水產(chǎn)品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌多重PCR檢測方法的建立

蔣 蔚，易 力，陳永軍，何再平，白雪瑞，趙夢蘇，劉景云，王 權(quán)

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2. 洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，洛陽 471022）

?

水產(chǎn)品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌多重PCR檢測方法的建立

蔣 蔚1，易 力2，陳永軍1，何再平1，白雪瑞1，趙夢蘇2，劉景云2，王 權(quán)1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2. 洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，洛陽 471022）

摘 要：霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌是引起全球范圍的食源性疾病的重要病原菌，建立一種能準(zhǔn)確鑒別這3種弧菌的方法具有重要意義。groEL基因是包括弧菌屬在內(nèi)的多種細(xì)菌檢測的分子標(biāo)記。本研究根據(jù)3種弧菌的groEL基因分別設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增及反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立一種能同時(shí)檢測這3種弧菌的多重PCR方法。結(jié)果表明應(yīng)用多重PCR技術(shù)對霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌能分別特異性地?cái)U(kuò)增出418、644、192 bp的目的片段。檢測其他非目標(biāo)供試菌時(shí)，不出現(xiàn)任何擴(kuò)增條帶。敏感性檢測結(jié)果表明，對霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌最低檢測限分別為102、102、103CFU/mL。人工染菌水產(chǎn)品檢測結(jié)果顯示，所建立的多重PCR方法能夠有效檢測出目的細(xì)菌，而未染菌組均為陰性。本文通過建立的多重PCR方法實(shí)現(xiàn)了對這3種弧菌的同時(shí)檢測，具有快速、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，對水產(chǎn)品中這3種弧菌的檢測和流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。

關(guān)鍵詞：霍亂弧菌；副溶血弧菌；創(chuàng)傷弧菌；groEL基因；多重PCR

近幾年弧菌引起的食源性疾病已成為當(dāng)今許多國家面臨的公共衛(wèi)生問題，其中霍亂弧菌（Vibrio cholerae，Vc）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）和創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnficus，Vv）引起的疾病占有很大比例[1]?；魜y弧菌所致的霍亂為烈性腸道傳染病，具有發(fā)病急、傳播快、流行范圍廣等特征，曾在世界上發(fā)生過幾次大流行，至今仍未平息，是我國傳染病法規(guī)定的甲類傳染病，也是當(dāng)前三種國際檢疫傳染病之一[2]。副溶血弧菌對人類危害僅次于霍亂弧菌，副溶血弧菌能夠引起多種無脊椎動物致病，包括石斑魚、九孔鮑和蝦，致病菌株可引起人類腹瀉、惡心、嘔吐、腹部痙攣，嚴(yán)重的可以引起昏迷、脫水甚至死亡[3]。創(chuàng)傷弧菌感染的危害不僅引起胃腸炎，還可引起蜂窩織炎和敗血癥[4]。這些弧菌不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重威脅人類健康，建立快速、準(zhǔn)確的檢測方法意義重大。

目前用于弧菌檢測的PCR方法有很多種，大量研究證明多重PCR方法在檢測特定微生物具有較高的特異性和靈敏性。用于檢測弧菌的mPCR方法大多以某些毒力因子為靶基因，如霍亂弧菌的毒力基因ctx、zot和rtx等[5]，副溶血弧菌的毒力基因tdh、trh等[6]，創(chuàng)傷弧菌的毒力基因vvh，rtxA1 和vvp 等[7]，但這些方法容易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。以看家基因（housekeeping genes）為目標(biāo)基因建立檢測方法則可以避免這樣的問題，而且建立一種能同時(shí)檢測所有目標(biāo)菌株的方法是進(jìn)一步進(jìn)行毒力檢測的基礎(chǔ)。

groEL基因編碼分子伴侶GroEL，在維持細(xì)胞滲透壓方面發(fā)揮重要作用，該基因在自然界的普遍性和保守性以及在種間的變異性使其非常適宜作為一種系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記[8]。groEL較16S rRNA和23S rRNA在弧菌屬檢測中的優(yōu)勢已早有報(bào)道[9]。groEL基因作為分子標(biāo)記已被用于包括弧菌屬在內(nèi)的多種細(xì)菌檢測[10,11]。本文根據(jù)文獻(xiàn)[12]分別合成了針對霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌groEL基因的3對特異性的引物，先進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增，在此基礎(chǔ)上再對多重PCR的反應(yīng)體系及條件進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化。最后以人工接種上述3種菌的文蛤作為檢測對象，評價(jià)建立的多重PCR技術(shù)對樣本中病原菌的檢測效果，以期建立針對水產(chǎn)品中3種重要弧菌快速、靈敏、特異性強(qiáng)的多重PCR檢測方法。

1　材料與方法

1.1菌株 副溶血弧菌ATCC33847購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；副溶血弧菌ATCC17802和創(chuàng)傷弧菌ATCC27562購自美國模式培養(yǎng)物集存庫；副溶血弧菌Vp67、Vp246菌株，霍亂弧菌Vc0901、Vc0903、Vc0904、Vcsh1501和Vcsh1505菌株，創(chuàng)傷弧菌Vvsh1207、Vvsh1501、Vvsh1503菌株, 以及大腸桿菌 O157、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌為實(shí)驗(yàn)室保存株；無乳鏈球菌為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室惠贈。

1.2試劑 蛋白胨、酵母提取物、硫代硫酸鈉-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖培養(yǎng)基（Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS）購自英國OXOID公司；DNA Marker 購自大連寶生物公司；2×PCR TaqMix 購自廣州東盛生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收DNA片段試劑盒購自美國Axygen公司；其余試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.3引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)文獻(xiàn)[10,12]報(bào)道分別以霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的groEL基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)3對引物，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，引物信息見表1。

1.4細(xì)菌DNA提取 取 1mL 新鮮培養(yǎng)菌液于離心管中，10 000×g 離心2 min，棄去上清，收集沉淀；根據(jù)細(xì)菌基因組 DNA（TIANamp Bacteria DNA kit，上海天根生物技術(shù)有限公司）提取試劑盒說明書提取細(xì)菌 DNA，用滅菌水溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 本文所用引物Table1 Primers used in this study

1.5單重PCR特異性評價(jià) 提取霍亂弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌及其他供試菌的基因組DNA作為模板，無菌水為空白對照，分別進(jìn)行單重PCR檢測評價(jià)上述3對引物的特異性。各引物進(jìn)行單重PCR的反應(yīng)體系：PCRMix 10μL、上下游引物（10 pmol/μL）各0.5μL、模板1 μL、用ddH2O調(diào)整終體積至25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s；60℃退火30 s；72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳試驗(yàn)，15 min后通過紫外成像系統(tǒng)拍攝電泳圖。3種弧菌的PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化后送由上海英俊有限公司進(jìn)行測序。

1.6單重PCR敏感性評價(jià) 將TCBS平板上霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌單菌落接種3%牛肉浸膏培養(yǎng)基，200r/min、37℃培養(yǎng)至對數(shù)期，在含3% NaCl的LB平板上計(jì)數(shù)，用無菌生理鹽水以10倍梯度稀釋，各取1 mL菌液提取DNA作為模板，用3對引物分別進(jìn)行單重PCR，反應(yīng)條件同1.5，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 在凝膠成像系統(tǒng)下拍照記錄結(jié)果。

1.7多重PCR體系優(yōu)化 多重PCR反應(yīng)體系優(yōu)化從退火溫度、退火時(shí)間和循環(huán)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。首先對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，25μL反應(yīng)體系：Mix 10μL、上下游引物（10 pmol/μL）各0.5μL、模板1μL、用ddH2O調(diào)整終體積至25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，退火溫度60℃～70℃，退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。選擇最佳反應(yīng)體系及退火溫度后，對退火時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，退火時(shí)間分別設(shè)為為30 s、1 min、2 min。最后對循環(huán)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，將循環(huán)參數(shù)分別設(shè)為20、25和30。

1.8多重PCR引物特異性評價(jià) 提取霍亂弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌及其他供試菌的DNA，混合后作為模板，無菌水為空白對照，以最佳反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，評價(jià)多重PCR的特異性。

1.9多重PCR引物敏感性評價(jià) 分別將相同濃度的霍亂弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌以等體積混合后，用無菌生理鹽水以10倍梯度倍比稀釋，各取1 mL提取DNA作為模板，在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行多重PCR敏感性的評價(jià)。

1.10人工模擬樣品的檢測 在當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場采集貝類，在超凈臺無菌操作剪碎，用高速分散均質(zhì)機(jī)打碎成勻漿，稱取10 g樣品與90 mL滅菌的3%NaCl堿性蛋白胨水混勻。取過夜培養(yǎng)的霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌菌懸液，10倍梯度稀釋后分別涂平板計(jì)數(shù)，確定細(xì)菌濃度后將3種弧菌菌懸液濃度調(diào)整至1×108CFU/mL。分別取3種弧菌菌懸液100μL加至50 mL含有樣品的3%NaCl堿性蛋白胨水中并混勻，未加菌液的含有樣品的3%NaCl堿性蛋白胨水混合液作為陰性對照。37℃、200r/min的條件下進(jìn)行細(xì)菌的富集培養(yǎng)，分別在0、2、4、8h取1 mL菌懸液，提取基因組并進(jìn)行多重PCR方法檢測。

2　結(jié)果

2.1三種弧菌單重PCR特異性檢測結(jié)果 在單重PCR特異性結(jié)果中，3對引物對目標(biāo)菌株都分別擴(kuò)增出了目的條帶（圖1A、B、C），而其他非目的細(xì)菌均未擴(kuò)增出條帶?；魜y弧菌（Vc）、副溶血弧菌（Vp）、創(chuàng)傷弧菌（Vv）擴(kuò)增的目的條帶大小分別為418、644、192 bp。測序結(jié)果表明，與這3種菌各自的groEL基因的同源性分別均達(dá)到98%以上，結(jié)果證實(shí)所擴(kuò)條帶均為目的基因，設(shè)計(jì)的3對引物具有很好的特異性。

2.2單重PCR靈敏度檢測結(jié)果 對每種弧菌分別進(jìn)行單重PCR檢測，結(jié)果表明對霍亂弧菌，副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的最低檢測限分別為102CFU/mL（圖2A）、102CFU/mL（圖2B）和103CFU/mL（圖2C）。

2.3多重PCR體系優(yōu)化 當(dāng)退火溫度在60℃～62℃時(shí)，有比較明顯的3條目的條帶（圖3A）；當(dāng)退火時(shí)間在30 s和45 s時(shí)均有3條目的條帶（圖3B），考慮檢測的快捷原則，退火時(shí)間選為30 s；當(dāng)循環(huán)參數(shù)在25、30和35時(shí)，3條目的條帶均較明顯，其中循環(huán)參數(shù)為30時(shí)3條目的條帶最明顯（圖3C）。綜上所述，用于同時(shí)檢測霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的多重PCR方法的最佳反應(yīng)體系為：Mix 10 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各0.5μL，模板1 μL，用ddH2O調(diào)整終體積至25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，退火溫度61℃，退火時(shí)間30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

2.4多重PCR特異性檢測結(jié)果 將各菌混合后進(jìn)行多重PCR檢測，目的菌都可以擴(kuò)增出相應(yīng)大小的目的條帶，非目的基因均沒有擴(kuò)增出條帶（圖4）。結(jié)果表明在多重PCR檢測方法中，3對引物都具有較高的特異性，且在擴(kuò)增混合菌DNA的過程中未發(fā)生互相干擾或抑制，進(jìn)一步說明所建立的三重PCR具有很好的特異性。

圖1　霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌單重PCR特異性評價(jià)Fig. 1 Specifi city of single PCR for the detection of V. cholerae, V. parahaemolyticus and V. vulnifi cusM: DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL 2000). A: 霍亂弧菌 groEL基因擴(kuò)增. 1～5: 霍亂弧菌; 6～9: 創(chuàng)傷弧菌; 10～13: 副溶血弧菌; 14: 金黃色葡萄球菌; 15: 大腸桿菌; 16: 無乳鏈球菌; 17: 沙門氏菌; 18: 空白對照B: 副溶血弧菌groEL基因擴(kuò)增. 1～4: 副溶血弧菌; 5～8: 創(chuàng)傷弧菌; 9～13: 霍亂弧菌; 14: 金黃色葡萄球菌; 15: 大腸桿菌; 16: 無乳鏈球菌; 17: 沙門氏菌; 18: 空白對照C: 創(chuàng)傷弧菌groEL基因擴(kuò)增. 1～4: 創(chuàng)傷弧菌; 5～9: 霍亂弧菌; 10～13: 副溶血弧菌; 14: 金黃色葡萄球菌; 15: 大腸桿菌; 16: 無乳鏈球菌; 17: 沙門氏菌; 18: 空白對照M: DNA Marker(DL 2000). A: PCR for groEL of V. cholerae. 1-5: V. cholerae; 6-9: V. vulnifi cus; 10-13: V. parahaemolyticus; 14: Staphyloccocus aureus; 15: Escherichia coli; 16: Staphyloccocus aureus; 17: Salmonella; 18: Blank controlB: PCR for groEL of V. parahaemolyticus. 1-4: V.parahaemolyticus; 5-8: V.vulnifi cus; 9-13: V.cholerae; 14: Staphyloccocus aureus; 15: Escherichia coli; 16: Staphyloccocus aureus; 17: Salmonella; 18: Blank controlC: PCR for groEL of V.vulnifi cus. 1-4: V.vulnifi cus; 5-9: V.cholerae; 10-13: V.parahaemolyticus; 14: Staphyloccocus aureus; 15: Escherichia coli; 16: Staphyloccocus aureus; 17: Salmonella; 18: Blank control

2.5多重PCR敏感性檢測 將相同濃度的3種弧菌混合后，10倍梯度稀釋再進(jìn)行多重PCR檢測，結(jié)果表明混合后的霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌最低檢測限仍分別為102、102、103CFU/mL（圖5）；與單重PCR靈敏度的檢測結(jié)果基本相同，結(jié)果表明三對引物均具有較高的特異性，且在擴(kuò)增混合細(xì)菌DNA時(shí)不會發(fā)生互相干擾或抑制試驗(yàn)結(jié)果的影響。

圖2　單重PCR檢測霍亂弧菌（A）、副溶血弧菌（B）和創(chuàng)傷弧菌（C）敏感性評價(jià)Fig. 2 Sensitivity of single PCR for the detection of V. cholerae (A), V. parahaemolyticus (B) and V. vulnifi cus (C)M: DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL 2000). 1～4: 細(xì)菌濃度 (104～101CFU/mL); 5: 空白對照M: DNA Marker (DL 2000). 1-4: Bacterial concentration were from104to 101CFU/mL; 5: Blank control

圖3　多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化Fig. 3 Optimization of reaction conditions for multiplex PCRM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000). A: 不同退火溫度下PCR擴(kuò)增產(chǎn)物. 1: 60℃; 2: 61℃; 3: 62℃; 4: 63℃; 5: 64℃; 6: 65℃; 7: 66℃; 8: 67℃; 9:68℃; 10: 69℃; 11: 70℃; 12: 空白對照B: 不同退火時(shí)間下PCR擴(kuò)增產(chǎn)物. 1,2: 15 s; 3,4: 25 s; 5,6: 30 s; 7,8: 45 sC: 不同循環(huán)數(shù)下PCR擴(kuò)增產(chǎn)物. 1,2: 20次; 3, 4: 25次; 5, 6: 30次; 7, 8: 35次; 9, 10: 40次M: DNA Marker (DL2000). A: PCR amplifi cation on the different annealing temperature. 1: 60℃; 2: 61℃; 3: 62℃; 4: 63℃; 5: 64℃; 6: 65℃; 7: 66℃; 8: 67℃; 9: 68℃; 10: 69℃; 11: 70℃; 12: Blank controlB: PCR amplifi cation on the different annealing time. 1,2: 15 s; 3,4: 25 s; 5,6: 30 s; 7,8: 45 sC: PCR amplifi cation on the different number of cycles. 1,2: 20 times; 3,4: 25 times; 5,6: 30 times; 7,8: 35 times; 9,10: 40 times

圖4　多重PCR檢測霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌特異性評價(jià)Fig. 4 Specifi city for the detection of V. cholerae, V. parahaemolyticus and V. vulnifi cus by multiplex PCRM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1: 霍亂弧菌+副溶血弧菌+創(chuàng)傷弧菌; 2: 霍亂弧菌+副溶血弧菌; 3: 副溶血弧菌+創(chuàng)傷弧菌; 4: 霍亂弧菌+創(chuàng)傷弧菌; 5: 副溶血弧菌; 6: 霍亂弧菌; 7: 創(chuàng)傷弧菌; 8: 大腸桿菌、無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌; 9: 空白對照M: DNA Marker (DL2000); 1: V. cholerae+V. parahaemolyticus+V. vulnifi cus; 2: V. cholerae+V. parahaemolyticus; 3: V. parahaemolyticus+V. vulnifi cus; 4: V. cholerae +V. vulnifi cus; 5: V. parahaemolyticus; 6: V. cholerae; 7: V. vulnifi cus; 8: Escherichia coli+Staphyloccocus aureus +Staphyloccocus aureus; 9: Blank control

圖5　多重PCR檢測霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌靈敏度評價(jià)Fig. 5 Sensitivity of multiplex PCR for the detection of V. cholerae, V. parahaemolyticus and V. vulnifi cusM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1～4: 細(xì)菌濃度 (104～10 CFU/ mL); 5: 空白對照M: DNA Marker (DL2000); 1-4: Bacterial concentration was from 1×104to 10 CFU/mL; 5: Blank control

2.6人工污染樣品檢測結(jié)果 對人工污染的樣品進(jìn)行培養(yǎng)來富集細(xì)菌，分別在不同的培養(yǎng)時(shí)間取1 mL菌液提取DNA，用多重PCR方法進(jìn)行檢測。未加菌的樣品作為空白對照，沒有擴(kuò)增出任何條帶，確定樣品在處理前未被3種弧菌污染。富集0 h后提取的DNA擴(kuò)增出3條目的條帶，但比較模糊，培養(yǎng)2 h時(shí)提取的DNA經(jīng)檢測有比較明顯的條帶，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，目的條帶也逐漸變亮（圖6），說明所建立的多重PCR方法可有效的檢測貝類樣品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌。

圖6　多重 PCR對人工污染樣品中霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的檢測結(jié)果Fig. 6 Detection of V. cholerae, V. parahaemolyticus and V. vulnifi cus in inoculated samples by multiplex PCRM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1～5: 細(xì)菌富集培養(yǎng)時(shí)間為8、6、4、2、0 h; 6: 空白對照M: DNA Marker(DL 2000); 1-5: The time for enrichment culture were 8, 6, 4, 2, 0 h; 6: Blank control

3　討論

食源性致病菌嚴(yán)重威脅公眾健康，并且給很多國家?guī)韲?yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[13]，因此建立簡單、快速和靈敏的檢測方法非常重要。靶基因的選擇對檢測特定種群的細(xì)菌至關(guān)必要。目前很多方法選擇毒力基因?yàn)榘谢蛴糜谥虏【甑臋z測，但是在疾病暴發(fā)或樣品篩選的過程中，首要任務(wù)是在物種水平上確定細(xì)菌，大多數(shù)環(huán)境菌株不一定具有所檢測的毒力基因[5-7,12]，而且在自然環(huán)境中，親緣關(guān)系較近的弧菌中的毒力菌株具有將毒力基因水平轉(zhuǎn)移到非毒力菌株中的流行潛力[14]，因此僅以毒力基因?yàn)榘谢虻臋z測方法可能會導(dǎo)致漏檢。

目前基于一些看家基因，如dnaJ、amiB、rpoA 和gyrB等靶基因建立的多重PCR方法，用于檢測多種弧菌，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但是常常在檢測混合菌種時(shí)結(jié)果不太理想[15-17]。Pinto等[18]在2005年建立的一種以膠原酶為靶基因的多重PCR方法，對檢測弧菌具有較高的特異性，但是不能用于檢測對人體健康有較大威脅的創(chuàng)傷弧菌。研究表明，groEL基因是多種細(xì)菌種特異性檢測的一個(gè)很好的靶基因。本試驗(yàn)用groEL基因作為靶基因，分別針對副溶血弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌合成了3對特異的引物，所建立的多重PCR方法針對這3種弧菌可分別擴(kuò)增出大小不同的產(chǎn)物，通過核酸膠很容易分開，而且非目標(biāo)菌株均不能擴(kuò)增出目的條帶。多重PCR擴(kuò)增出來的目的條帶和相應(yīng)的單重PCR條帶大小相同，而且單重PCR的特異性和靈敏度均與多重PCR一致，說明該方法的可靠性。有研究表明應(yīng)用PCR檢測食品中的微生物常受到抑制劑的影響，細(xì)菌經(jīng)過培養(yǎng)后在富集目標(biāo)菌的同時(shí)，還可以降低抑制劑的干擾作用[19]。本文所建立的多重PCR可有效的檢測人工污染的水產(chǎn)品中的霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌，證實(shí)所建立方法的特異性和準(zhǔn)確性。

總之，本試驗(yàn)建立的多重PCR方法對霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌可進(jìn)行同步檢測，具有較高的靈敏性和特異性，為開展水產(chǎn)品中上述弧菌的檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 滕勇勇, 王琪, 吳雷, 等. 致病性弧菌的生物學(xué)特性和致病因子研究進(jìn)展[J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 14(10): 1396-1398.

[2] 王洪敏, 馬文麗, 鄭文嶺. 霍亂弧菌的致病性與流行性研究進(jìn)展[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2003, 30 (l): 38-41.

[3] 鄭文龍，王卓，馬潔, 等. 副溶血性弧菌病原學(xué)和分子流行病學(xué)流行特征研究進(jìn)展[J]. 疾病監(jiān)測, 2015, 31(10): 337-341.

[4] 武靜, 劉曉斐, 胡成進(jìn). 創(chuàng)傷弧菌流行病學(xué)調(diào)查及致病機(jī)制研究現(xiàn)狀[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志, 2015, 44 (3): 166-168.

[5] Dalsgaard A, Serichantalergs O, Forslund A V, et al. Clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae serogroup O141 carry the CTX phage and the genes encoding the toxin-coregulated pili [J]. J Clin Microbiol, 2001, 39 (11): 4086-4092.

[6] Panicker G, Call D R, Krug M J, et al. Detection of pathogenic Vibrio spp. in shellfish by using multiplex PCR and DNA microarrays [J]. Appl Environ Microbiol，2004,70(12): 7436-7444.

[7] Wang J, Sasaki T, Maehara Y, et al. Variation of extracellular proteases produced by Vibrio vulnificus clinical isolates: Genetic diversity of the metalloprotease gene (vvp), and serine protease secretion by vvp-negative strains [J]. Microbial Pathogenesis, 2008, 44(6): 494-500.

[8] Junick J and Blaut M. Quantification of human fecal Bifidobacterium species by use of quantitative real-time PCR analysis targeting groEL gene [J]. Appl Environ Microbiol, 2012, 78(8): 2613-2622.

[9] Hu Y S, Luo L, LiuW J, et al. Sequence analysis of the groEL gene and its potential application in identification of pathogenic bacteria [J]. African J Microbiol, 2010, 4(16): 1733-1741.

[10] Hossain M T, Kim Y R, Kong I S. PCR-restriction fragment length polymorphism analysis using groEL gene to differentiate pathogenic Vibrio species [J] Diagn Microbiol Infect Dis, 2014, 78 (1): 9-11.

[11] Hossain M T, Kim E Y, Kim Y R, et al. Application of groEL gene for the species-specific detection of Vibrio parahaemolyticus by PCR [J]. Lett in Appl Microbiol, 2012, 54(1): 67-72

[12] Hossain M T, Kim Y R, Kong I S, et al. Development of a groEL gene-based species-specific multiplex polymerase chain reaction assay for simultaneous detection of Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus [J]. J Appl Microbiol, 2013,114 (2): 448-456.

[13] Chen J, Tang J, Liu J, et al. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens [J]. J Appl Microbiol, 2012, 112(4): 823-830.

[14] Neogi S B, Chowdhury N, Asakura, M, et al. A highly sensitive and specific multiplex PCR assay for simultaneous detection of Vibrio cholera, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus [J]. Lett Appl Microbiol, 2010, 51(3): 293-300.

[15] Nhung P H, Shah M M, Ohkusu K, et al. The dnaJ geneas a novel phylogenetic marker for identification of Vibrio species [J]. Syst Appl Microbiol, 2007, 30(4): 309-315.

[16] Tarr C L, Patel J S, Phur N D, et al. Identification of Vibrio isolates by a multiplex PCR assay and rpoB sequence determination [J]. J Clin Microbiol, 2007, 45(1): 134-140.

[17] Bao Y, Wang Q, Liu H, et al. A small HSP gene of bloody clam (Tegillarca granosa) involved in the immune response against Vibrio parahaemolyticus and lipopolysaccharide [J]. Fish Shellfish Immunol, 2011, 30(2): 729-33.

[18] Pinto A D, Ciccarese G, Tantillo G, et al. A collagenasetargeted multiplex PCR assay for identification of Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae, and Vibrio parahaemolyticus [J]. J Food Prot, 2005, 68(1): 150-153.

[19] Wong H C, You W Y, Chen S Y. Detection of toxigenic Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus and V. vulnificus in oyster by multiplex-PCR with internal amplification control[J]. J Food Drug Ana, 2012, 20(1): 48-58.

·研究論文·

DEVELOPMENT OF A MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION ASSAY FOR SIMULTANEOUS DETECTION OF VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS, VIBRIO CHOLERAE AND VIBRIO VULNIFICUS IN AQUATIC FOODS

JIANG Wei1, YI-Li2, CHEN Yong-jun1, HE Zai-ping1, BAI Xue-rui1, ZHAO Meng-su2, LIU Jing-yun2, WANG Quan1

(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Life Science, Luoyang Normal University, Luoyang 471022, China)

Key words:Vibrio cholerae; Vibrio parahaemolyticus; Vibrio vulnifi cus; groEL gene; Multiplex PCR

Abstract:Vibrio cholerae (Vc), Vibrio parahaemolyticus (Vp) and Vibrio vulnifi cus (Vv) are of major concerns in aquatic food industry as they are important pathogens causing food-borne diseases throughout the world. Therefore, it is very necessary to develop an effective multiplex polymerase chain reaction (PCR) for the simultaneous detection of these important Vibrio species. The groEL gene is a potential marker for simultaneous detection of these species in seafood samples. Three sets of species-specifi c primers were designed to develop a multiplex PCR. The reaction conditions of the multiplex PCR were optimized to establish a rapid, sensitive and convenient PCR method. The results showed that the multiplex PCR produced amplicons with expected sizes of 418 bp, 644 bp and 192 bp specifi c for Vc, Vpand Vv, respectively. This PCR method showed good effi ciency as it detected three species in the same samples. The detection limits were demonstrated to be 102CFU/mL for Vp and Vc and 103CFU/mL for Vv in the mixed DNA samples. In addition, the multiplex PCR specifically amplified target species but did not cross-react with other Vibrio and non-Vibrio species. The results indicated that the multiplex PCR was a quick and cost-effi cient method for detection of Vibrio species in seafoods and for epidemiological investigation.

中圖分類號：S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1674-6422（2016）01-0044-08

收稿日期：2015-10-27

基金項(xiàng)目：上海市科學(xué)技術(shù)委員會科研計(jì)劃項(xiàng)目（13DZ0502702）；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)（201303045）

作者簡介：蔣蔚，女，博士，主要從事微生物學(xué)和免疫學(xué)研究

通信作者：王 權(quán)，E-mail：wangquan@shvri.ac.cn