霍亂弧菌檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

王國臻 王玉格 王憲鈺 馬麗 王彬 李天園

【摘 要】霍亂是由霍亂弧菌所引起的烈性腸道傳染病，其傳播速度極快，發(fā)病急，屬于國際檢疫傳染病，其被我國列為甲類傳染病?；魜y的快速檢測顯得極其重要，現(xiàn)在國內(nèi)外有很多檢測霍亂弧菌的方法。主要是傳統(tǒng)的檢測方法及分子生物學(xué)和免疫學(xué)的方法，本文主要對近幾年最新的霍亂弧菌檢測技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】霍亂弧菌；檢測技術(shù)；分子生物學(xué)；免疫學(xué)

霍亂是一種烈性腸道傳染病，霍亂的病原體—霍亂弧菌（Vibrio cholerae）經(jīng)人工培養(yǎng)呈桿狀或彎曲弧狀，有鞭毛能運動的革蘭陰性菌?；魜y弧菌由于O抗原的不同，被分為155個血清群，主要是O1群和O139群可導(dǎo)致霍亂的發(fā)生，其他血清型尚未發(fā)現(xiàn)可致霍亂，O1群和O139群主要引起感染者劇烈嘔吐，腹瀉，失水，肌肉痙攣甚至死亡。所以霍亂弧菌的快速檢測顯得極其重要。國內(nèi)外學(xué)者建立了大量應(yīng)用廣泛的檢測技術(shù)。其中傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)，生化檢測以及血清學(xué)檢測等作為常規(guī)的檢測方法被應(yīng)用。近來，分子生物學(xué)，免疫學(xué)和倆者結(jié)合的技術(shù)越來越成熟，以其快速簡便，準(zhǔn)確性高，特異性極強(qiáng)等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用。

1.霍亂弧菌的致病機(jī)理及流行情況

產(chǎn)生霍亂毒素的霍亂弧菌為產(chǎn)毒株，其主要致病毒素是霍亂腸毒素，霍亂弧菌的致病物質(zhì)與其染色體上的多個基因有關(guān)，主要致病因子有三個，a.CTX基因原件，b.TCP致病性島，c.ToxR，霍亂腸毒素是由A亞單位和B亞單位構(gòu)成的一個多聚體蛋白，當(dāng)人或動物感染后，B亞單位可與攻擊對象的小腸黏膜上皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，然后A亞單位進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致一系列酶反應(yīng)發(fā)生，然后引起腸道分泌功能亢進(jìn)，引起大量液體及血漿中的大量電解質(zhì)進(jìn)入腸腔，由于分泌功能超過腸道的重吸收能力，從而導(dǎo)致人體嚴(yán)重的腹瀉，由于脫水和電解質(zhì)缺失，引起循環(huán)衰竭，血壓下降繼而腦供血不足，然后缺氧昏迷；更甚者不發(fā)生嘔吐和腹瀉癥狀，直接進(jìn)入中毒性休克而死亡。

2.檢測方法

2.1傳統(tǒng)的檢測方法

霍亂弧菌兼性厭氧，營養(yǎng)要求簡單，在堿性蛋白胨水或平板上生長良好，所形成的菌落無色透明，扁平或稍凸起，邊緣整齊?，F(xiàn)國內(nèi)已有許多選擇培養(yǎng)基，如TCBS等。其生化反應(yīng)氧化酶陽性，過氧化物酶陽性，吲哚反應(yīng)陽性。能發(fā)酵多種單糖，雙糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵乳糖遲緩，不分解阿拉伯糖、水楊素等?；魜y弧菌在無鹽的生存環(huán)境中也可生活，其他菌則不能。

2.2分子生物學(xué)方法

2.2.1 PCR-激光誘導(dǎo)熒光-毛細(xì)血管電泳檢測方法

此方法以毛細(xì)血管電泳法和激光誘導(dǎo)熒光檢測器結(jié)合用以檢測霍亂弧菌，此方法首先讓霍亂弧菌腸毒素CTXA基因來選擇引物，然后利用PCR法擴(kuò)增霍亂弧菌的特異性基因片段，所得到的PCR產(chǎn)物，然后利用高效毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光快速檢測，此方法對毛細(xì)血管電泳法和PCR條件進(jìn)行了改良，用以實現(xiàn)快速檢測。在改良的PCR條件下，霍亂弧菌的CTXA基因有效擴(kuò)增，無特異性條帶；擴(kuò)增產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn)其與基因庫的序列同源性比匹配度幾乎達(dá)到100%，其檢測結(jié)果與普通凝膠電泳法一致。此方法優(yōu)點明顯，所需的檢驗樣品少，非?？焖?，所建立的技術(shù)先進(jìn)，可應(yīng)用于科研等專業(yè)實驗室。

2.2.2環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)是一項非常特殊的技術(shù)，它可以針對基因的多個區(qū)域然后設(shè)計不同的特異性引物，然后在鏈置換DNA聚合酶的作用下，進(jìn)行恒溫擴(kuò)增，15到60min左右即可實現(xiàn)十的九次方倍的核酸擴(kuò)增，目前已有人開展相關(guān)研究，這種方法應(yīng)用于霍亂弧菌的檢測時，是利用霍亂弧菌外膜蛋白的ompW基因設(shè)計特異性引物，建立霍亂弧菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)檢測方法，同時對霍亂弧菌進(jìn)行擴(kuò)增，然后檢測其靈敏度和特異性，此技術(shù)與普通PCR法進(jìn)行比較，反應(yīng)速度極快， 而且反應(yīng)結(jié)果都可以通過肉眼直接觀察斷定，實驗顯示此檢測辦法靈敏度極高，特異度為100%。可用于食品方面的檢測，與傳統(tǒng)的檢測方法比大大縮短了檢測的時間，靈敏度高，其可直接用于霍亂弧菌的現(xiàn)場流行學(xué)檢查。

2.3免疫學(xué)方法

2.3.1近紅外免疫層析法

近紅外免疫層析法的建立用以快速檢測O1群霍亂弧菌，其借鑒近紅外熒光探針的定量免疫層析試紙條，其建立的技術(shù)基礎(chǔ)為低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的O1群霍亂弧菌免疫層析試紙條，利用了近紅外免疫層析技術(shù)，雙抗體夾心法檢測O1群霍亂弧菌，然后制造靶向O1群霍亂弧菌的免疫層析的試紙條，此方法順應(yīng)了使用更高靈敏度的標(biāo)記物替代膠體金顆粒的發(fā)展趨勢，其檢測結(jié)果快速準(zhǔn)確，特異性強(qiáng)，此方法與普通膠體金方法相比較，其靈敏度提高了100倍，極大的提高檢驗檢疫效率。

2.3.2膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法可對霍亂弧菌O1群和O139群進(jìn)行快速檢測，膠體金免疫層析法運用膠體金免疫層析技術(shù)，以雙抗體夾心法檢測霍亂弧菌O1群和O139群，然后對此方法進(jìn)行其靈敏度，特異性等方面的對比，與細(xì)菌培養(yǎng)法檢測多份臨床標(biāo)本相比較該方法能在十分鐘內(nèi)完成檢測，此方法具有操作簡便快速，靈敏度高，不需任何儀器設(shè)備、能夠同時檢測大量樣品等優(yōu)點?？捎糜谶M(jìn)出口的檢測。

3.結(jié)語

綜上所述，分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法對霍亂弧菌的檢測都有著良好的靈敏度和特異性，能達(dá)到快速檢測的目的。分子生物學(xué)方面，隨著引物與探針的設(shè)計更精確，其檢測技術(shù)也越來越成熟，因成本低，效率高等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用；免疫學(xué)方面，因操作簡單，工作量大，檢測快速等優(yōu)點也被廣泛推廣。我們應(yīng)該將其與分子生物學(xué)與免疫學(xué)相結(jié)合，然后再確定病原體，相信不久的將來，人們可以發(fā)現(xiàn)更多的方式檢測霍亂弧菌，為霍亂弧菌的早期檢測和臨床治療提供更多的有價值的信息。

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