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    霍亂弧菌檢測(cè)方法的研究

    2018-05-14 13:50李巧燕
    好日子(下旬) 2018年1期
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)方法

    李巧燕

    摘 要:烈性腸道傳染病霍亂能引起大范圍乃至世界性大流行,在我國(guó)被列為甲類傳染病?;魜y弧菌是導(dǎo)致感染者嚴(yán)重腹瀉、引起霍亂的病原菌?;魜y弧菌的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)是霍亂預(yù)防、控制的重要依據(jù)。目前,國(guó)內(nèi)、外針對(duì)霍亂弧菌建立了許多有效的檢測(cè)方法,尤其是分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用,為霍亂弧菌的檢測(cè)提供了新的手段。本文綜述了近年來(lái)霍亂弧菌檢測(cè)方法的研究進(jìn)展。

    關(guān)鍵詞:霍亂弧菌;檢測(cè)方法;分子生物學(xué)技術(shù)

    一、傳統(tǒng)檢測(cè)方法

    霍亂弧菌為需氧或兼性厭氧菌,營(yíng)養(yǎng)要求不高,在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,常以堿性蛋白胨水作為其選擇性增菌培養(yǎng)基?;魜y弧菌生長(zhǎng)迅速,可將標(biāo)本在 37℃培 養(yǎng) 6~8h后取上層培養(yǎng)物做弧菌分離?;魜y弧菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂和堿性瓊脂上呈無(wú)色、圓形、透明、光滑、濕潤(rùn)、扁平或稍凸起、邊緣整齊的菌落。

    為便于檢出,根據(jù)其生長(zhǎng)特性、對(duì)某些抗生素的敏感性及與其他常見(jiàn)腸道菌的差別,國(guó)內(nèi)已研制出慶大霉素瓊脂、四號(hào)瓊脂,國(guó)外有TCBS等選擇性培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基一般都含有膽鹽、亞碲酸鉀、十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、慶大霉素、多黏菌素等抑菌劑。

    在不同的選擇性培養(yǎng)基上,霍亂弧菌具有不同的菌落特征。挑取可疑菌落后需進(jìn)行一系列生化反應(yīng)、血清凝集等試驗(yàn),對(duì)結(jié)果進(jìn)行綜合判定,從而確定為霍亂弧菌[1]。目前,細(xì)菌培養(yǎng)、生化和血清學(xué)鑒定仍是霍亂弧菌實(shí)驗(yàn)室診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”,具有較好的敏感度和特異度。但不可否認(rèn),傳統(tǒng)方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、工作量大,且易受環(huán)境、培養(yǎng)條件及主觀因素影響,不能滿足疾病預(yù)防和控制快速反應(yīng)體系的需求,不利于實(shí)驗(yàn)室的快速診斷。[2]

    二、分子生物學(xué)方法

    1.聚合酶鏈反應(yīng)

    (1)普通聚合酶鏈反應(yīng)

    運(yùn)用常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechain reaction,PCR)檢測(cè)霍亂弧菌,一般選擇霍亂腸毒素(choleraenterotoxin,CT)基因 ctx的保守序列作為靶基因[3,4]。一些非產(chǎn)毒株(如環(huán)境來(lái)源的菌株)有可能通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移獲得毒力基因成為產(chǎn)毒株,若僅檢測(cè) ctx基因容易造成漏檢。因此,霍亂弧菌的其他重要基因,如毒力協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛 A 基因(tcpA)、0抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力表達(dá)調(diào)控基因(toxR)等也被選用為 PCR的靶基因[5,6],這大大提高了檢測(cè)的特異度。PCR方法檢測(cè)霍亂弧菌的特異度和敏感度都很高,但其本身也有缺點(diǎn):一是因樣本DNA交叉污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性;二是由于待測(cè)樣本中的某些雜質(zhì)蛋白及核酸提取過(guò)程中用到乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)、SDS等,如未去除干凈就會(huì)成為 Taq DNA 聚合酶的抑制劑,造成擴(kuò)增失敗。此外,標(biāo)本中也可能含有會(huì)降解靶核酸的核酸酶,導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此,在運(yùn)用 PCR檢測(cè)霍亂弧菌時(shí),要注意避免 DNA污染以及其他雜質(zhì)的干擾。

    (2)多重PCR

    與常規(guī)PCR相比,多重PCR一次反應(yīng)可檢測(cè)多個(gè)基因,節(jié)省了時(shí)間和成本。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者選用霍亂弧菌的毒素基因ctx、rfb、hly進(jìn)行組合[7],作為共同的靶基因,克服了由于毒力基因特異度不夠高而造成的假陽(yáng)性。多重 PCR 同時(shí)可準(zhǔn)確區(qū)分不同血清型的霍亂弧菌和快速鑒定其是否為產(chǎn)毒株,可謂舉多得,大大提高了檢測(cè)效率。

    Tarr等[8]運(yùn)用多重 PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌的 sodB、副溶血弧菌的laEf、創(chuàng)傷弧菌的 hsp等 基因,G6mez.Duarte等[9]運(yùn)用多重PCR從腹瀉患者的臨床標(biāo)本中同時(shí)檢測(cè)到包括霍亂弧菌在內(nèi)的 7種腸道致病菌。這些都大大提高 了感染性腹瀉病原學(xué)診斷的效率和水平,為多種致病菌的快速診斷提供了很好的思路和方法。多重PCR 的引物設(shè)計(jì)要注意避免各對(duì)引物之間的相互干擾和各目的片段之間的非特異性擴(kuò)增。

    (3)熒光定量 PCR 熒光定量

    PCR 自動(dòng)化程度高、特異性強(qiáng)、無(wú)交叉污染,在霍亂弧菌的快速診斷中得到廣泛應(yīng)用。尤其是近年來(lái),隨著引物與探針的設(shè)計(jì)更精確、多通道熒光 PCR儀的開(kāi)發(fā)與廣泛使用,多重?zé)晒舛?PCR技術(shù) 日臻成熟,并以其高通量、低成本、高效率等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、真菌等多種病原體的快速檢測(cè),成為應(yīng)用的熱點(diǎn)。Huang等[10] 選取 Ol和 O139群特異的 rbf基因以及 ctxA、hylA等作為靶點(diǎn),建立了四重?zé)晒舛?PCR體系,不僅克服了單重?zé)晒舛?PCR僅檢測(cè)毒力基因特異度不高而造成假陽(yáng)性的缺點(diǎn),而且能很好檢測(cè)并區(qū)分 01群和 O139群霍亂弧菌及其毒力株,最低檢出限達(dá)每個(gè)反應(yīng) 2個(gè)菌落形成單位(colonyformingunit,CFU)。這與單重?zé)晒舛縋CR的最低檢出限相當(dāng),降低了檢測(cè)成本,提高了檢測(cè)效率。Fykse等[1l]運(yùn)用基于分子信號(hào)標(biāo)記的多重?zé)晒舛?PCR體 系檢測(cè)環(huán)境標(biāo)本中霍亂弧菌的 ctxA、tcpA、toxR、hlyA、groEL等多個(gè)基因的不同組合,在一定程度上削弱了標(biāo)本中雜質(zhì)的干擾,提高了 PCR技術(shù)對(duì)環(huán)境標(biāo)本檢測(cè)的特異度,敏感度也較 TaqMan探針和 SYBR Green I方法提高了 100 倍??梢?jiàn),多重?zé)晒舛?PCR技術(shù)已成為未來(lái)檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì),但必須保證不同探針?biāo)鶚?biāo)記的光基團(tuán)問(wèn)無(wú)相互干擾,且各目的片段有相近的擴(kuò)增效率。

    2、基因芯片

    與 PCR方法相 比,基因芯片技術(shù)能同時(shí)獲得更多病原學(xué)、生物學(xué)方面的信息,從而更為全面地分析、掌握病原微生物的特征。Vora等[12]運(yùn)用基因芯片技術(shù)對(duì)多種致病性弧菌的毒力、毒素、耐藥基因及潛在的毒力基因進(jìn)行全面分析,對(duì)掌握這些細(xì)菌的致病性及進(jìn)行有效預(yù)防、控制等具有重要意義。但基因芯片成本較高,距離推廣應(yīng)用尚需時(shí)間等待。

    3、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

    環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(1oop.mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)是 2000年 Notomi等發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法。此方法針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì) 4條特異性引物,利用鏈置換 DNA 聚合酶(BstDNA polymerase)在恒溫條件(60-65℃)孵育 40-60min,引發(fā)自動(dòng)鏈循環(huán)取代反應(yīng),完成對(duì)靶基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)電泳或直接通過(guò)副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度進(jìn)行檢測(cè)。Yamazaki等[13]。采用 LAMP檢測(cè)霍亂弧菌的 ctxA基因,最低檢測(cè)限達(dá)每個(gè)反應(yīng) 1.4 CFU,比普通PCR高近 10倍,說(shuō)明該方法具有很高的靈敏度。

    參考文獻(xiàn)

    [1]聞?dòng)衩?現(xiàn)代醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[M].上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社,1999:331-334.

    [2]王秀茹.預(yù)防醫(yī)學(xué)微生物學(xué)及檢驗(yàn)技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:338-339.

    [3]王家豪,楊長(zhǎng)業(yè),候金英 應(yīng)用一步法快速檢測(cè)乙型肝炎表面抗原 中國(guó)公共衛(wèi)生雜志,1998,14(1):47~48.

    [4]曾章新,劉文星,朱忠勇,等.膠體金免疫層析法檢測(cè)乙肝表面抗原的評(píng)價(jià).中華 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,1999,22(6):327.

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