柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建與檢測

王自文，董 輝，趙其平，夏偉麗,2，朱順海，門啟婓,2，李 聰，朱雪龍，韓紅玉，黃 兵,3

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海200241；2. 上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；3. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009）

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柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶4酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建與檢測

王自文1，董 輝1，趙其平1，夏偉麗1,2，朱順海1，門啟婓1,2，李 聰1，朱雪龍1，韓紅玉1，黃 兵1,3

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海200241；2. 上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；3. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009）

摘 要：為了篩選出柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶（EtCDPK4）在蟲體內(nèi)發(fā)揮作用時(shí)的作用受體即相互作用蛋白，構(gòu)建了能夠應(yīng)用于篩選柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫的誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4，本研究以柔嫩艾美耳球蟲子孢子為材料，提取了總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈，利用PCR的方法擴(kuò)增獲得了該基因大小為1660 bp的EtCDPK4的功能區(qū)片段，并將其連接于酵母BD誘餌pGBKT7載體上，經(jīng)雙酶切鑒定和序列分析，以及檢測了pGBKT7-EtCDPK4在酵母雙雜交系統(tǒng)中的自激活、細(xì)胞毒性和表達(dá)情況。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了酵母雙雜交誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4，在酵母雙雜交系統(tǒng)中沒有自激活活性和細(xì)胞毒性，且在酵母細(xì)胞Y2HGold中能夠進(jìn)行表達(dá)。表明所構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4可以應(yīng)用于酵母雙雜交系統(tǒng)中，用于篩選柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫，獲得可能與EtCDPK4具有相互作用的蛋白質(zhì)。

關(guān)鍵詞：柔嫩艾美耳球蟲；鈣依賴蛋白激酶；誘餌質(zhì)粒；自激活作用；細(xì)胞毒性

鈣依賴蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases，CDPK）是一種鈣依賴而鈣調(diào)素不依賴的蛋白激酶或類似鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)域的蛋白激酶（Calmodulin-like domain protein kinases），是由多基因編碼的大家族，同時(shí)CDPK也是一種非常重要的Ca2+信號蛋白。鈣依賴蛋白激酶家族（CDPKs）的成員均為單肽鏈且具有非常明顯的結(jié)構(gòu)特征，從N端到C端共有4個(gè)功能結(jié)構(gòu)區(qū)，依次是可變區(qū)、催化區(qū)、連接區(qū)和調(diào)控區(qū)[1]。CDPK僅存在于植物[2]、綠藻[3]、纖毛蟲以及一些頂復(fù)門原蟲中[4]，但在細(xì)菌、真菌、酵母、線蟲和脊椎動(dòng)物中尚未發(fā)現(xiàn)[5]。大部分的頂復(fù)門原蟲都是嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的病原，只有進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)才能進(jìn)行生長和繁殖，它們可通過本身的機(jī)制來逃避宿主的免疫屏障以及藥物對它們的殺傷作用。這些頂復(fù)門原蟲能夠入侵宿主細(xì)胞具有很多的機(jī)制，然而CDPKs介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)是一種重要機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)CDPKs激發(fā)的生理效應(yīng)是推動(dòng)頂復(fù)門原蟲成功入侵和逃逸宿主細(xì)胞以及蟲體自身發(fā)育成熟的關(guān)鍵因素之一[6]。盡管目前對于CDPKs在柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）體內(nèi)發(fā)揮作用的具體詳細(xì)機(jī)制還不清楚，但已有的研究發(fā)現(xiàn)一些CDPKs在E. tenella入侵宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用[6]，因此通過阻斷CDPK在E. tenella體內(nèi)的信號傳導(dǎo)很可能就會(huì)阻斷蟲體對宿主細(xì)胞的入侵，從而減弱E. tenella這類病原所帶來的危害。阻斷CDPK誘發(fā)的信號傳導(dǎo)過程可以有2種方式：通過使用特異性的抑制劑來抑制CDPK本身或者阻斷CDPK下游的作用底物，使CDPK不能夠發(fā)揮作用[7]。為了弄清楚EtCDPK4在E. tenella中的基本作用方式，及其下游的效應(yīng)分子，本文構(gòu)建了E. tenella CDPK4的酵母雙雜交系統(tǒng)誘餌質(zhì)粒，旨在為今后通過酵母雙雜交技術(shù)篩選EtCDPK4的下游作用底物提供基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1蟲株及所需試劑 E. tenella孢子化卵囊上海株（資源編號：CAAS21111601，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所原蟲病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)保存）；M-MLV Reverse Transcriptase Kit（Invitrogen，USA）；Trizol試劑和RNase-free water、限制性內(nèi)切酶EcoRΙ和SalΙ（TaKaRa）；Regular Agarose G10（Gene Company）；大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，DNA Marker DL2000，酵母質(zhì)粒提取試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒（TIANGEN）；T4 DNA Ligase和T4 DNA Ligase Buffer（Promega，USA）；pGBKT7質(zhì)粒（本實(shí)驗(yàn)室保存）；酵母菌株Y2HGold，X-α-Gal，YPD和YPDA酵母培養(yǎng)基，酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化試劑盒和SD/-Trp缺陷性培養(yǎng)基（Clontech）；Adenine（Sigma）；Kana抗生素（Sangon Biotech）。

1.2引物的設(shè)計(jì) 對EtCDPK4進(jìn)行限制性酶切位點(diǎn)分析后根據(jù)pGBKT7載體上的多克隆位點(diǎn)和EtCDPK4的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的PCR引物。EtCDPK4-UP：5'-CCGGAATTCAGCAGGTGATGG GTGGGCGGGAGGT-3'（劃線部分為EcoR I位點(diǎn)）

EtCDPK4-LOW：5'-GCGTCGACAATTCGTCCCAG TCAATCTGCCCATCGC-3'（劃線部分為Sal I位點(diǎn)）

1.3目的基因EtCDPK4的PCR擴(kuò)增 純化E. tenella孢子化卵囊，提取子孢子，方法參見文獻(xiàn)[8]。利用Trizol試劑提取子孢子總RNA，經(jīng)1%凝膠電泳鑒定合格后用M-MLV Reverse Transcriptase Kit將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用合成的特異性引物和子孢子cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳分析。

1.4PCR產(chǎn)物克隆與鑒定 回收產(chǎn)物用EcoRΙ和SalΙ進(jìn)行酶切后將其定向連接到同樣進(jìn)行酶切的pGBKT7載體中，再轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)測序、酶切鑒定后，將正確插入目的基因片段的重組質(zhì)粒命名為pGBKT7-EtCDPK4。

1.5酵母菌株Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞制備 在YPDA培養(yǎng)基上對Y2HGold酵母菌劃板，30℃培養(yǎng)4 d，挑取3個(gè)直徑大約3～4mm的酵母菌于離心管中，30℃，250r/min震蕩培養(yǎng)12 h，測定酵母菌OD600值來評價(jià)生長速度，取生長速度最快的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取酵母菌5 μL于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，250r/min震蕩培養(yǎng)16～20h，直到OD600達(dá)到0.15～0.3，離心收獲酵母菌沉淀, 重懸酵母細(xì)胞，30℃，250r/min震蕩培養(yǎng)3～5 h，直到OD600達(dá)到0.4～0.5, 離心收獲酵母細(xì)胞沉淀，用無菌ddH2O重懸細(xì)胞沉淀，離心再次收獲細(xì)胞沉淀。再用TE/LiAc重懸酵母細(xì)胞，瞬時(shí)離心15 s，TE/LiAc Buffer重懸酵母細(xì)胞，將其置于冰上立即轉(zhuǎn)化。

1.6誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4轉(zhuǎn)入酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞 取鯡魚精DNA(10 mg/mL)，煮沸5 min，立即將其置于冰上冷卻，重復(fù)一次，置于冰上備用。在2個(gè)Eppendorf管中按順序分別加入pGBKT7-EtCDPK4誘餌質(zhì)?；蛘遬GBKT7空質(zhì)粒，鯡魚精DNA和酵母感受態(tài)細(xì)胞，加入PEG/LiAc溫和混勻后30℃孵育30 min，結(jié)束后加入DMSO，混勻之后，42℃溫育15 min。重懸酵母細(xì)胞沉淀，30℃，250r/min震蕩培養(yǎng)90 min后，離心盡量棄去上清，用0.9%（w/v）NaCl溶液重懸轉(zhuǎn)化子細(xì)胞沉淀，做10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀釋后涂布于SD/-Trp營養(yǎng)缺陷性固體培養(yǎng)基上，每塊板涂布100μL稀釋產(chǎn)物，30℃培養(yǎng)4～5d，直到平板上生長出乳白色酵母菌落。

1.7重組酵母菌PCR鑒定 提取重組酵母菌質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，鑒定時(shí)采用pGBKT7的通用引物即T7和3'BD。

1.8pGBKT7-EtCDPK4對Y2HGold報(bào)告基因自激活活性的檢測 根據(jù)Y2HGold酵母菌的表型選擇檢測Mel1+和ADE2+這2個(gè)報(bào)告基因。將轉(zhuǎn)化且PCR鑒定為陽性的酵母單菌落挑于0.9%（w/v）NaCl溶液重懸后，涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/-Ade三種營養(yǎng)缺陷性固體培養(yǎng)基上，每塊板涂布100μL酵母菌液，30℃培養(yǎng)4～5d，直到長出酵母單菌落。

1.9pGBKT7-EtCDPK4對Y2HGold細(xì)胞毒性的檢測 誘餌pGBKT7-EtCDPK4對Y2HGold細(xì)胞毒性檢測分2個(gè)階段，即酵母形態(tài)表觀檢測和生長速度動(dòng)態(tài)觀測。將轉(zhuǎn)化且PCR鑒定為陽性的誘餌pGBKT7-EtCDPK4和已經(jīng)轉(zhuǎn)化pGBKT7的酵母單菌落挑取于0.9%（w/v）NaCl溶液重懸后，分別涂布于SD/-Trp營養(yǎng)缺陷性培養(yǎng)基上，每塊板涂布100μL酵母菌液，30℃培養(yǎng)4～5 d，直到長出酵母單菌落。將誘餌pGBKT7-EtCDPK4酵母菌和pGBKT7酵母菌各挑取一個(gè)單菌落于SD/-Trp/Kan+(20 μg/mL)液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，30℃，250 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，其中在0、16、18、20、22、24 h分別測定OD600值。

1.10pGBKT7-EtCDPK4在Y2HGold宿主菌中表達(dá)情況檢測 2個(gè)SD/-Trp營養(yǎng)缺陷性液體培養(yǎng)基的離心管中各挑取一個(gè)轉(zhuǎn)化有誘餌質(zhì)粒和空質(zhì)粒的單菌落，30℃，250r/min培養(yǎng)12 h，將其傾入含YPD液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，繼續(xù)30℃，250r/min培養(yǎng)3～5h。直到OD600達(dá)到0.4～0.6時(shí)，迅速將酵母培養(yǎng)物倒入提前預(yù)冷的離心管中，離心棄上清，用滅菌水重懸細(xì)胞沉淀，離心后重新得到細(xì)胞團(tuán)塊，然后用TCA buffer重懸，將離心管放置在冰上，轉(zhuǎn)移細(xì)胞上清到一個(gè)新的離心管中，震蕩破碎酵母細(xì)胞壁，轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中，并且將離心管置于冰上1 min，離心，棄去上清留下細(xì)胞沉淀，使用TCALaemmli Loading buffer重懸后置于沸水中20 min，各取5 μL提取的酵母蛋白進(jìn)行Western blot檢測。

2　結(jié)果

2.1EtCDPK4基因的PCR擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物在1%的凝膠電泳中發(fā)現(xiàn)在2 000bp以下有一個(gè)特別明顯的條帶，與預(yù)期片段基本相符（圖1A）。經(jīng)序列測定分析，確定為EtCDPK4基因片段。

2.2重組誘餌質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 目的條帶用EcoRΙ 和SalΙ進(jìn)行切割(圖1B)回收后，與同樣酶切的pGBKT7進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定（圖1C），將酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，與原序列一致，說明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4構(gòu)建成功。

2.3誘餌pGBKT7-EtCDPK4轉(zhuǎn)入Y2HGold的鑒定誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4轉(zhuǎn)入Y2HGold中，待乳白色的單菌落長出后挑12個(gè)單酵母菌落于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，250r/min震蕩培養(yǎng)12 h后提取質(zhì)粒，用通用引物T7和3'BD驗(yàn)證，結(jié)果表明挑取的12個(gè)酵母單克隆均為陽性（圖2）

圖1　EtCDPK4擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定(A)，目的條帶和質(zhì)粒的雙酶切反應(yīng)(B)和重組酵母誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4的雙酶切鑒定(C)Fig. 1 PCR products of EtCDPK4 (A), the double restrictionenzyme digestion for target gene and pGBKT7(B) and recombinant yeast bait plasmid identifi cation of pGBKT7-EtCDPK4 by double restriction endonuclease digestion(C)M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: EtCDPK4: PCR產(chǎn)物; 2: EtCDPK4雙酶切產(chǎn)物; 3: 酵母誘餌質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物; 4: pGBKT7-EtCDPK4M: DNA Marker (DL2000) 1: PCR products of EtCDPK4; 2: The double restrictionenzyme digestion of EtCDPK; 3: pGBKT7 4: pGBKT7-EtCDPK4

圖2　酵母誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4轉(zhuǎn)化入Y2HGold酵母菌中抽提重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig. 2 PCR identifi cation of extracted recombinant yeast bait plasmid pGBKT7-EtCDPK4 in the Y2HGold yeast strainM: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～12: 樣品序號M: DNA Marker (DL2000); 1-12: Sample

2.4誘餌pGBKT7-EtCDPK4對Y2HGold報(bào)告基因自激活檢測 誘餌pGBKT7-EtCDPK4對Y2HGold報(bào)告基因自激活檢測，結(jié)果顯示在SD/-Trp和SD/-Trp/ X-α-Gal營養(yǎng)缺陷性固體培養(yǎng)基上長出圓潤且為乳白色的酵母單菌落（圖3A），說明構(gòu)建的pGBKT7-EtCDPK4誘餌重組質(zhì)粒對Y2HGold酵母宿主菌的Mel1+報(bào)告基因無自激活活性（圖3B）；而在SD/-Trp/-Ade營養(yǎng)缺陷性固體培養(yǎng)基上沒有酵母菌落生長，這說明所構(gòu)建的pGBKT7-EtCDPK4誘餌重組質(zhì)粒對Y2HGold酵母宿主菌的ADE2+報(bào)告基因無自激活活性（圖3C）。

圖3　pGBKT7-EtCDPK4對Y2HGold酵母菌報(bào)告基因自激活活性的檢測Fig. 3 Detection of self-activity reporter gene of pGBKT7-EtCDPK in Y2HGold yeast strainA: SD/-Trp營養(yǎng)缺陷性固體培養(yǎng)基; B: SD/-Trp/X-α-Gal營養(yǎng)缺陷性固體培養(yǎng)基; C: SD/-Trp/-Ade營養(yǎng)缺陷性固體培養(yǎng)基A: SD/-TrpNutrient defi cient solid medium; B: SD/-Trp/X-αgal nutrient defi cient solid medium; C: SD/-Trp/-Ade nutrient defi cient solid medium

2.5誘餌pGBKT7-EtCDPK4對Y2HGold細(xì)胞毒性檢測 誘餌pGBKT7-EtCDPK4對Y2HGold酵母菌細(xì)胞毒性檢測，表明在SD/-Trp營養(yǎng)缺陷性固體培養(yǎng)基上，誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4（圖4A）的酵母菌大小和形態(tài)與pGBKT7（圖4B）的酵母菌相近。同時(shí)在SD/-Trp/Kan+(20 μg/mL)液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)20 h時(shí)，其OD600值為0.8380，其中在0、16、18、20、22、24h測定的OD600值見表1，這些時(shí)間點(diǎn)酵母生長均呈現(xiàn)上升趨勢（圖5），與空載體轉(zhuǎn)化酵母后的生長趨勢差異不明顯，說明pGBKT7-EtCDPK4誘餌質(zhì)粒對Y2HGold酵母宿主菌沒有細(xì)胞毒性。

2.6誘餌pGBKT7-EtCDPK4在Y2HGold中表達(dá)情況的檢測 Western blot 檢測pGBKT7-EtCDPK4 在Y2HGold中的表達(dá)。與對照比較，在蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)55～70kDa間有大小符合EtCDPK4（約62.6kDa）的條帶，表明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK 4在Y2HGold酵母菌中表達(dá)（圖6）。說明構(gòu)建的pGBKT7-EtCDPK4誘餌質(zhì)?？捎糜诮湍鸽p雜交系統(tǒng)。

3　討論

圖4　pGBKT7-EtCDPK4對Y2HGold宿主酵母菌細(xì)胞毒性的檢測Fig. 4 Detection of pGBKT7-EtCDPK4 on the cytotoxicity of Y2HGold host yeast cellsA: pGBKT7空質(zhì)粒; B: pGBKT7-EtCDPK4誘餌重組質(zhì)粒A: pGBKT7 plasmid; B: pGBKT7-EtCDPK4 bait recombinant plasmid

圖5　pGBKT7-Y2HGold和pGBKT7-EtCDPK4-Y2HGold酵母菌的生長趨勢Fig. 5 Growth rate of pGBKT7-Y2HGold and pGBKT7-EtCDPK4-Y2HGold

表1 不同時(shí)間點(diǎn)pGBKT7-Y2HGold和pGBKT7-EtCDPK4-Y2HGold的OD600值Table 1 At different time points OD600value of pGBKT7-Y2HGold and pGBKT7-EtCDPK4-Y2HGold

圖6　Western blot 鑒定pGBKT7-EtCDPK4在Y2HGold宿主酵母菌中表達(dá)Fig. 6 Western blot detection of pGBKT7-EtCDPK4 expression in Y2HGoldM: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); 1、2: pGBKT7-Y2HGold酵母蛋白; 3、4: pGBKT7-EtCDPK4-Y2HGold酵母蛋白M: PageRulerTMprestained Protein Ladder; 1, 2: Control of pGBKT7-Y2HGold yeast protein; 3, 4: pGBKT7-EtCDPK4-Y2HGold yeast protein

目前，對于E. tenella鈣依賴蛋白激酶家族（CDPKs）的成員已經(jīng)被揭示了3個(gè)，分別是EtCDPK1、EtCDPK2[9]和EtCDPK3[10]，它們都是E.tenella入侵宿主細(xì)胞的相關(guān)分子，但是它們在E.tenella體內(nèi)發(fā)揮作用的具體詳細(xì)作用機(jī)制目前尚不清楚，而EtCDPK4是本實(shí)驗(yàn)室之前通過RACE技術(shù)得到的E.tenella的一個(gè)新基因，通過對其生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)它具有鈣依賴蛋白激酶家族（CDPKs）成員的基本特征，因此，命名為EtCDPK4。CDPKs在頂復(fù)門原蟲作為接收Ca2+信號的主要效應(yīng)分子，將信號傳遞給下游分子，從而發(fā)揮功能，這一過程在頂復(fù)門原蟲完成整個(gè)生活史的過程中發(fā)揮著極其重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)CDPKs能夠影響頂復(fù)門原蟲一系列的生理生化活動(dòng)，促進(jìn)頂復(fù)門原蟲致密斑、微線體、棒狀體蛋白的分泌，使蟲體的運(yùn)動(dòng)性加強(qiáng)，入侵宿主細(xì)胞的能力增強(qiáng)，從而更加適應(yīng)宿主細(xì)胞的微環(huán)境[11]。對剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii，Tg）的CDPKs研究發(fā)現(xiàn)，TgCDPKs可以促進(jìn)蟲體頂部微線體蛋白質(zhì)的分泌，而這些分泌的蛋白在T.gondii入侵宿主細(xì)胞時(shí)是必需的[12,13]。同樣，在對惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum，Pf）的研究發(fā)現(xiàn)CDPKs在P. falciparum的生活史過程中也具有重要作用，通過序列比對發(fā)現(xiàn)PfCDPKs家族有7個(gè)成員，其中PfCDPK1具有促進(jìn)P. falciparum的運(yùn)動(dòng)性和入侵細(xì)胞的作用，并且PfCDPK1對于P. falciparum在宿主血液中的發(fā)育和成熟也極其重要。Ca2+對P. falciparum的配子發(fā)育過程有直接的影響，而PfCDPK3和PfCDPK4是Ca2+影響P. falciparum配子發(fā)育過程的中介，因此，這兩個(gè)蛋白在配子發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。同樣研究發(fā)現(xiàn)PfCDPK5參與了P. falciparum從宿主紅細(xì)胞中逸出的過程[14]。在E. tenella中，研究發(fā)現(xiàn)EtCDPK3與子孢子入侵宿主細(xì)胞和在宿主細(xì)胞內(nèi)的生長繁殖有關(guān)[10]。因此，推測EtCDPK4很可能在E.tenella的生活史中也發(fā)揮著重要作用。

EtCDPK4接收的Ca2+信號需要傳遞給下游作用分子，而這些作用分子都是EtCDPK4直接或者間接的作用底物。對于CDPKs家族成員的作用底物在植物上研究的較為透徹和清楚，迄今發(fā)現(xiàn)的CDPKs底物包括代謝酶類（如蔗糖合成酶、PEP梭化酶、亞硝酸還原酶等）、脅迫相關(guān)蛋白（如PAL）、抗菌蛋白（如馬鈴薯梭膚酶抑制劑、磷脂轉(zhuǎn)移蛋白、植保素等）、離子通道蛋白（如ACAZ、KATl、H+-ATpase等）、其他蛋白（如熱穩(wěn)定蛋白）等[15]。為了獲得EtCDPK4下游作用底物，本研究選擇使用高效傳統(tǒng)的酵母雙雜交技術(shù)來進(jìn)行篩選。酵母雙雜交系統(tǒng)是由Fields等[16]在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立的，該技術(shù)是發(fā)現(xiàn)和研究蛋白質(zhì)相互作用的新技術(shù)，近幾年得到了廣泛的運(yùn)用，可用來研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用，還能用來發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)的作用，是一種具有很高靈敏度的研究技術(shù)[17]。酵母雙雜交系統(tǒng)的最為重要的用途就是從cDNA文庫中尋找與已知蛋白質(zhì)相互作用的未知蛋白質(zhì)，檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄情況，尋找與已知蛋白質(zhì)能相互作用的未知蛋白質(zhì)[18]。目前，酵母雙雜交技術(shù)在研究腫瘤誘發(fā)信號通路相關(guān)分子、病毒入侵宿主細(xì)胞所需受體、植物細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及寄生蟲與宿主相互作用方面均取得了突破性的進(jìn)展[19-21]，但是在以E. tenella作為病原的研究上應(yīng)用仍然較少。酵母雙雜交系統(tǒng)能夠被很好應(yīng)用的前提是要構(gòu)建符合酵母雙雜交系統(tǒng)篩選特性的誘餌質(zhì)粒。誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建可以采用傳統(tǒng)的分子克隆的方法，本研究在酵母雙雜交GAL4系統(tǒng)的基礎(chǔ)上成功地構(gòu)建了GAL4-BD結(jié)構(gòu)域的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EtCDPK4，并將誘餌質(zhì)粒成功的轉(zhuǎn)化入經(jīng)過人工改造的Y2HGold酵母宿主菌株中，通過Trp營養(yǎng)缺陷性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，重組轉(zhuǎn)化子能夠在SD/-Trp營養(yǎng)缺陷性固體培養(yǎng)基上生長出乳白色且圓潤的酵母單菌落，這表明帶有Trp營養(yǎng)缺陷性篩選標(biāo)記的誘餌質(zhì)粒已成功的轉(zhuǎn)入到Y(jié)2HGold宿主酵母菌株中。

構(gòu)建好的誘餌質(zhì)粒需要進(jìn)行3種特性的檢測，分別是誘餌質(zhì)粒的自激活活性、細(xì)胞毒性和酵母宿主中的表達(dá)特性，這三種特性必須同時(shí)滿足才可以將誘餌質(zhì)粒應(yīng)用于下一步的酵母雙雜交篩選試驗(yàn)中[22-25]，其中，對于自激活活性的檢測是通過選擇宿主酵母菌的一些報(bào)告基因，然后通過使用一些酵母專屬的營養(yǎng)缺陷性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，看其是否能夠單獨(dú)的激活這個(gè)報(bào)告基因，通常檢測α-半乳糖苷酶的活性，如果所構(gòu)建的酵母誘餌質(zhì)粒具有自激活活性，那么需要對目的基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的剪切后才可以應(yīng)用于酵母雙雜交系統(tǒng)[26-28]。本研究在誘餌質(zhì)粒自激活活性檢測時(shí)，選擇檢測Y2HGold酵母宿主菌株的MEL1+和ADE2+這兩個(gè)報(bào)告基因，通過使用SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/-Ade二重營養(yǎng)缺陷性固體培養(yǎng)基來檢測誘餌質(zhì)粒的自激活活性，結(jié)果表明pGBKT7-EtCDPK4對宿主菌株的報(bào)告基因MEL1+、ADE2+沒有自激活作用，因此所構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒不能夠單獨(dú)的去激活GAL4結(jié)構(gòu)域UAS下游的啟動(dòng)子。對于細(xì)胞毒性的檢測主要是評價(jià)其生長速度，如果誘餌質(zhì)粒和轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的酵母菌生長速度相近或者高于空質(zhì)粒則判定其對酵母宿主菌沒有毒性，如果誘餌質(zhì)粒具有毒性，則構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒不能應(yīng)用于酵母雙雜交系統(tǒng)[27,28]。在檢測構(gòu)建的pGBKT7-EtCDPK4誘餌質(zhì)粒產(chǎn)生的蛋白質(zhì)對酵母宿主菌是否有細(xì)胞毒性的試驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)化了pGBKT7-EtCDPK4誘餌質(zhì)粒的酵母菌Y2HGold在SD/-Trp固體培養(yǎng)基上生長的形態(tài)大小與轉(zhuǎn)化了pGBKT7空質(zhì)粒的酵母宿主菌形態(tài)大小基本相近，且與空質(zhì)粒在SD/-Trp/Kan（20μg/mL）液體培養(yǎng)基中增殖的速度均為不斷增加呈現(xiàn)出極速上升的趨勢，在20 h時(shí)均能夠超過0.8，說明本研究構(gòu)建的pGBKT7-EtCDPK4誘餌質(zhì)粒產(chǎn)生的蛋白對酵母菌Y2HGold無細(xì)胞毒性作用，誘餌質(zhì)?？梢栽诮湍杆拗骶蟹€(wěn)定的存在。對于誘餌質(zhì)粒在酵母宿主菌中的是否表達(dá)主要是通過Western blot檢測其是否在酵母體中能夠表達(dá)誘餌蛋白，如果不表達(dá)則無法將其應(yīng)用于酵母雙雜交系統(tǒng)中[29-31]。使用實(shí)驗(yàn)室已有的Anti-rEtCDPK4的兔血清對pGBKT7-EtCDPK4誘餌質(zhì)粒在Y2HGold酵母菌株中的蛋白表達(dá)進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果獲得了與預(yù)期EtCDPK4蛋白分子量大小相近的特異條帶，這表明pGBKT7-EtCDPK4誘餌質(zhì)粒在Y2HGold酵母菌中能夠穩(wěn)定表達(dá)誘餌蛋白。

因此，本研究構(gòu)建的pGBKT7-EtCDPK4誘餌質(zhì)粒產(chǎn)生的蛋白對Y2HGold酵母菌的生長無細(xì)胞毒性，可以在酵母體中穩(wěn)定的存在，也沒有Y2HGold酵母菌株自帶的報(bào)告基因的自激活作用，且在Y2HGold酵母菌株中能夠表達(dá)誘餌蛋白。因此可以利用E.tenella的EtCDPK4基因編碼的蛋白質(zhì)作為一個(gè)誘餌，來篩選E. tenella子孢子酵母雙雜交cDNA文庫，獲得在子孢子中與其相互作用的蛋白，為研究EtCDPK家族成員在鈣離子介導(dǎo)的信號通路中作用和功能奠定一定的基礎(chǔ)。

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·研究論文·

DETECTION AND CONSTRUCTION OF EIMERIA TENELLA CDPK4 BAIT

PLASMID FOR YEAST TWO-HYBRID SYSTEM

WANG Zi-wen1, DONG Hui1, ZHAO Qi-ping1, XIA Wei-li1,2, ZHU Shun-hai1, MEN Qi-fei1,2, LI Cong1, ZHU Xue-long1, HAN Hong-yu1, HUANG Bing1

(1. Key Laboratory of Animal Parasitolgy of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

Key words:Eimeria tenella; CDPK; bait plasmid; self-activation; toxic effect

Abstract:In order to screen for the interacting protein with CDPK4 of Eimeria tenella, the recombinant bait plasmid pGBKT7-EtCDPK4 was constructed, which can be used to screen for Eimeria tenella yeast two-hybrid cDNA library. The total RNA of E. tenella sporozoite was extracted, then the fi rst strand of cDNA was obtained by reverse transcriptase. The 1660 bp fragment of EtCDPK4 was amplifi ed by PCR and cloned into yeast BD bait vector pGBKT7, then the recombinant plasmid pGBKT7-EtCDPK4 was identifi ed by double enzyme digestion and sequenced. The self-activation, toxic action and protein expression of the recombination bait plasmid pGBKT7-EtCDPK4 were tested, respectively. These results show that the recombinant pGBKT7-EtCDPK4 plasmid was constructed successfully and proved to be no self-activation and toxic action. Moreover, it was expressed in the Y2HGold yeast cell. So the recombinant plasmid pGBKT7-EtCDPK4 can be used to screen for Eimeria tenella sporozoites yeast two-hybrid cDNA library.

中圖分類號：S852.723

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1674-6422（2016）01-0062-08

收稿日期：2015-12-18

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（31572266）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2014JB03）

作者簡介：王自文，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

通信作者：黃 兵，E-mail：hb@shvri.ac.cn；韓紅玉，E-mail：hhysh@shvri.ac.cn