1株桑根腐病拮抗細菌的分離鑒定及田間防治效果

謝紅輝， 韋繼光， 周　穎， 熊　英

(1廣西大學 農(nóng)學院， 廣西 南寧 530004； 2 廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所， 廣西 南寧 530001)

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1株桑根腐病拮抗細菌的分離鑒定及田間防治效果

謝紅輝1,2， 韋繼光1， 周穎1， 熊英1

(1廣西大學 農(nóng)學院， 廣西 南寧 530004； 2 廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所， 廣西 南寧 530001)

摘要：【目的】篩選出對桑根腐病菌可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae有顯著拮抗作用的細菌，并測定其田間防治效果。【方法】采用平板稀釋法從健康桑樹根際土壤中分離細菌；采用平板對峙法和孢子萌發(fā)法篩選出對靶標菌株有顯著拮抗作用的菌株。通過形態(tài)觀察、生理生化特征測定、gyrA和gyrB基因序列鑒定拮抗細菌菌株。設置田間小區(qū)試驗，測定拮抗菌株在自然條件下的生防效果?！窘Y(jié)果】從桑樹根際土壤中分離出8株對L. theobromae有抑制作用的細菌，其中菌株YZ14-3的抑制效果最好。該菌株及其培養(yǎng)液對L. theobromae菌絲生長的抑制率分別為73.3%和55.6%，挑取抑菌圈上的L. theobromae菌絲鏡檢發(fā)現(xiàn)，菌絲畸形膨大； L. theobromae分生孢子在YZ14-3的培養(yǎng)液中不能萌發(fā)，且分生孢子因細胞壁降解而解體；經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化特征測定和基于gyrA和gyrB基因序列BLAST分析結(jié)果構建的系統(tǒng)發(fā)育樹，YZ14-3被鑒定為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens；大田防治試驗結(jié)果表明，YZ14-3的生防效果達67.94%。【結(jié)論】B. amyloliquefaciens菌株YZ14-3對L. theobromae的抑制效果較顯著，可應用于L. theobromae所致病害的生物防治。

關鍵詞：桑根腐?。?可可毛色二孢； 解淀粉芽孢桿菌； 拮抗作用； 分離鑒定； 田間防治

桑樹MorusalbaLinn.屬?？芃oraceae桑屬Morus，原產(chǎn)我國中部，是一種具有重要經(jīng)濟價值的落葉喬木。種桑養(yǎng)蠶是我國的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，我國已有約4 000 的桑樹栽培歷史[1]。隨著“東桑西移”發(fā)展戰(zhàn)略的實施，廣西逐步成為我國蠶繭生產(chǎn)第一大省區(qū)和世界重要原料蠶繭生產(chǎn)基地，2012年，廣西桑樹種植面積達1.69×105hm2，家蠶飼養(yǎng)量為655萬張，蠶繭產(chǎn)量達2.56×105t[2]。由可可毛色二孢LasiodiplodiatheobromaePat.Griffon & Maubl桑樹的新病害，2014年，Xie等[3]曾報道該病害在我國廣西橫縣發(fā)生，發(fā)病面積達2 400 hm2，其后在廣西其他蠶桑種植區(qū)均發(fā)現(xiàn)該病害的存在。

桑根腐病是一種根部新病害，目前生產(chǎn)上鮮見有防治效果好的化學藥劑，且化學防治易對桑樹和家蠶產(chǎn)生藥害，因此，針對該病害開展生物防治的研究具有重要意義，而獲得有顯著拮抗效果的菌株是病害生物防治的基礎。本研究采集健康桑樹根際土壤，篩選能顯著抑制L.theobromae的拮抗細菌，以期為桑根腐病的生物防治奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA Ladder Min Marker(SM0337)、DreamTaqGreen PCR MasterMix(2×)、PCR引物等均購自上海生物工程技術服務有限公司；PDA粉(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；快速革蘭氏染色試劑盒(濟南百博生物科技有限責任公司)；孔雀石綠(天津市大茂化學試劑廠)。

NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏3.0 g、蛋白胨5 g、葡萄糖2.5 g，瓊脂粉15 g，用少量蒸餾水加熱溶解后，補充蒸餾水至1 L。

可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae菌株由廣西大學農(nóng)學院植保系實驗室分離保存。

1.2方法

從廣西自治區(qū)南寧市、河池市和來賓市的桑園中，采集健康桑樹根際土壤用于分離拮抗細菌。參考孫正祥等[4]的方法分離和純化細菌菌株。

1.2.1拮抗細菌對L.theobromae菌絲生長的影響采用平板對峙法[5]測定拮抗細菌對菌絲生長的影響。將保存的病原菌菌株和細菌菌株分別在PDA培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基上活化。用滅菌打孔器(直徑6 mm)取L.theobromae菌餅接種至PDA培養(yǎng)基平板中央，其兩側(cè)2 cm處對稱放置細菌菌落塊，放置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待對照處理的菌落長滿平板后，測量各處理菌落的直徑，參照謝晨昭等[6]的方法計算生長抑制率，并在顯微鏡下觀察抑菌帶菌絲的形態(tài)特征。各處理重復3次。從參試的細菌菌株中篩選出拮抗效果最好的菌株進行后續(xù)試驗。

1.2.2細菌培養(yǎng)液對L.theobromae菌絲生長的影響將篩選出的細菌菌落塊接種到150 mL液體NA培養(yǎng)基中，于振蕩培養(yǎng)箱中(28 ℃，150 r·min-1)培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾后，備用。取活化好的L.theobromae菌餅接種到PDA培養(yǎng)基中央，在其周圍對稱放置3片滅菌濾紙片(直徑5 mm)，再用移液槍吸取10 μL細菌上清液滴在濾紙片上。重復3次，計算生長抑制率。

1.2.3細菌培養(yǎng)液對L.theobromae孢子萌發(fā)的影響采用載玻片孢子萌發(fā)法[5]：利用過濾的細菌培養(yǎng)液配制孢子懸浮液(約1×106個·mL-1)，以清水為對照,將500 μL孢子懸浮液滴在干凈的載玻片上，再將載玻片放入墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，然后放置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后觀察孢子萌發(fā)情況，計算孢子萌發(fā)率。以芽管長度超過孢子長度的一半作為萌發(fā)標準。

1.2.4拮抗菌株的鑒定將活化好的拮抗菌株菌落劃線接種在NA培養(yǎng)基平板上，放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，觀察菌落特征，并進行革蘭氏染色和芽孢染色觀察形態(tài)特征[7]。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]的方法測定拮抗細菌的生理生化特征。試劑盒提取菌株總DNA，保存于-20 ℃?zhèn)溆?。參考并利用Chun等[8]的引物擴增gyrA基因。PCR反應體系：DreamTaqGreen PCR MasterMix(2×)25 μL，引物各2 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O至50 μL。反應條件： 95 ℃預變性3 min； 95 ℃ 35 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，重復30次； 72 ℃ 10 min。gyrB基因引物為UP1和UP2r[9]。除引物不同外，PCR反應體系中各成分的量和反應條件與gyrA基因序列擴增試驗相同。

PCR擴增完成后，取PCR產(chǎn)物在10 g·L-1瓊脂糖凝膠中電泳(150 V、100 mA、20 min)檢測產(chǎn)物的特異性并委托上海生工測序。將測得的菌株序列在NCBI上進行BLAST比對，確定菌株的分類地位，同時下載NCBI中與參試菌株序列相似性高的序列用Mega 5軟件進行同源性分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5YZ14-3 大田防治桑根腐病效果在廣西自治區(qū)橫縣石塘鎮(zhèn)選擇樹齡為4~6年的桑園作為試驗田，試驗田隨機設置3個小區(qū)，每小區(qū)65~70棵桑樹。施用生防菌劑前，先調(diào)查記錄好各小區(qū)的病死桑樹。將YZ14-3培養(yǎng)液9 L(4.8×108CFU·mL-1)兌水18 L后均勻澆灌于各小區(qū)桑樹根部土壤。試驗期限為2014年4月至2015年5月，前5個月，每月施用培養(yǎng)液2次，其后每月施用1次。對照用等量的清水代替YZ14-3培養(yǎng)液。最后1次施藥1個月后，調(diào)查各處理小區(qū)及對照的病死株數(shù)，參照賴傳雅的方法[10]并稍作改進計算防治效果:

防治效果=[(對照區(qū)校正病死率-處理區(qū)校正病死率)/對照區(qū)校正病死率]×100%，

校正病死率=用藥后病死率-用藥前病死率。

2結(jié)果與分析

2.1拮抗菌株分離及拮抗效果測定

從采集的45份土樣中分離到菌落形態(tài)有明顯差異的菌株22個，經(jīng)篩選得到對L.theobromae有顯著抑制效果的8個菌株，其中菌株YZ14-3的抑菌效果最好(圖1)。YZ14-3菌落與L.theobromae對峙培養(yǎng)時，抑菌圈半徑為12 mm，對L.theobromae的生長抑制率為73.3%。因此，選定菌株YZ14-3進行后續(xù)試驗。研究發(fā)現(xiàn)，菌株YZ14-3的培養(yǎng)液能顯著抑制L.theobromae的生長，抑菌圈半徑為8 mm，抑制率為55.6%。觀察發(fā)現(xiàn)抑菌圈外緣的L.theobromae菌絲變黑(圖1)，挑取變黑的菌絲在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)菌絲膨大、畸形、易斷裂(圖2)。

A：YZ14-3菌落的抑菌效果； C：YZ14-3培養(yǎng)液的抑菌效果；B和D分別為A和C的對照。

圖1菌株YZ14-3對Lasiodiplodia theobromae菌絲生長的抑制效果

Fig.1Inhibitory effect of YZ14-3 on myceliium growth of Lasiodiplodia theobromae

A：膨大、畸形的L.theobromae菌絲; B：正常的L.theobromae菌絲。

圖2菌株YZ14-3對Lasiodiplodia theobromae菌絲形態(tài)的影響

Fig.2Effect of YZ14-3 on mycelium morphology of Lasiodiplodia theobromae

2.2菌株YZ14-3培養(yǎng)液對L. theobromae孢子萌發(fā)的影響

采用載玻片孢子萌發(fā)法測定了YZ14-3培養(yǎng)液對L.theobromae分生孢子萌發(fā)的影響，培養(yǎng)20 h后，在顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)情況。每個視野隨機觀測500個孢子，觀察3個視野，共1 500個孢子。觀察發(fā)現(xiàn)，L.theobromae分生孢子在YZ14-3的培養(yǎng)液中不能萌發(fā)且YZ14-3的培養(yǎng)液能降解L.theobromae分生孢子的細胞壁，使分生孢子解體。

2.3菌株YZ14-3的鑒定

2.3.1形態(tài)特征菌株YZ14-3在NA培養(yǎng)基的主要培養(yǎng)特征(圖3A)如下：菌落乳白色，邊緣不整齊，表面有皺褶，隆起不透明，菌落干爽無光澤；液體靜止培養(yǎng)時形成乳白色菌膜。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，YZ14-3革蘭氏染色陽性，呈紫色(圖3B)，菌體短桿狀，直或略彎，菌體單個或呈短鏈狀排列，芽孢頂生或生于菌體中部(圖3C)。根據(jù)形態(tài)特征，初步鑒定YZ14-3為芽孢桿菌Bacillussp.。

A：菌落形態(tài)；B：革蘭染色；C：芽孢染色。

2.3.2生理生化特性本研究測定了YZ14-3的部分生理生化特征(表1)。將本文測定結(jié)果與已發(fā)表的B.amyloliquefaciens相關菌株生理生化特征測定結(jié)果[11-12]相比較，并參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]，YZ14-3被初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens。

表1菌株YZ14-3的生理生化特性1)

Tab.1Physiological and biochemical characteristics of YZ14-3

測試項目YZ14-3B10-26[11]SWFU01[12]測試項目YZ14-3B10-26[11]SWFU01[12]厭氧生長++10℃培養(yǎng)+-尿素酶試驗++30℃培養(yǎng)+++甲基紅反應++50℃培養(yǎng)---明膠液化+++w(NaCl)為1%+淀粉水解+++w(NaCl)為5%++檸檬酸鹽利用--w(NaCl)為7%+-+酪氨酸水解--w(NaCl)為10%--氧化酶-硝酸鹽還原++-葡萄糖+++葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣+半乳糖+-乙酰甲基甲醇反應+++木糖++接觸酶++過氧化氫酶++苯丙氨酸脫氨酶試驗--

1)“+”為陽性反應，“-”為陰性反應，空白表示未測定。

2.3.3gyrA和gyrB序列分析鑒定菌株YZ14-3的gyrA基因擴增后，獲得1個長度為1 013 bp的片段。PCR產(chǎn)物純化、測序后，將該基因序列在NCBI上進行BLAST相似性分析，比對結(jié)果表明，YZ14-3的gyrA序列與GenBank中的B.amyloliquefaciens的gyrA序列相似性均高于98%。從GenBank中下載與YZ14-3的gyrA序列相似性較高的B.amyloliquefaciensgyrA序列11個、B.subtilis序列 8個、B.licheniformis序列6個，以大腸埃希菌Escherichiacoli菌株的gyrA序列(登錄號：DQ447131)為外群構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4A)。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，YZ14-3與11株B.amyloliquefaciens聚在一群，并與其他菌株分離，表明YZ14-3與B.amyloliquefaciens具有很高的遺傳相似性。

菌株YZ14-3的gyrB基因擴增后，獲得1個長度為1 243 bp的片段。PCR產(chǎn)物純化、測序后，將該基因序列在NCBI上進行BLAST相似性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，YZ14-3的gyrB序列與GenBank中的B.amyloliquefaciens的gyrB序列相似性均高于99%。下載GenBank中與YZ14-3的gyrB序列相似性較高的7個B.amyloliquefaciens菌株序列、7個B.subtilis序列、3個B.licheniformis序列、3個B.thuringiensis序列，以E.coli菌株的gyrB序列(登錄號：AB083949)為外群構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4B)。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，YZ14-3與7株B.amyloliquefaciens聚在一群，并與7株B.subtilis分離，表明YZ14-3與B.amyloliquefaciens的遺傳相似性很高。

由gyrA和gyrB序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹可鑒定菌株YZ14-3為B.amyloliquefaciens。

圖4　基于gyrA和gyrB基因序列的YZ14-3系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3.4菌株YZ14-3的田間防治效果施用YZ14-3培養(yǎng)液前后各調(diào)查1次桑樹病死情況，施用YZ14-3培養(yǎng)液用藥前和用藥后桑樹病死率分別為14.44%和18.89%，用藥后的桑樹病死率顯著地低于對照的(29.44%)。生防菌劑處理的校正病死率約為4.45%，顯著高于對照的校正病死率13.88%。由生防菌劑處理和對照的校正病死率得YZ14-3的田間防治效果為67.94%。

3討論與結(jié)論

B.amyloliquefaciens與B.subtilis親緣性很高，能分泌一系列抑制真菌、細菌、病毒和支原體生長發(fā)育的抗菌脂肽[13]。王奕文等[14]從甜瓜果實表面分離到1株B.amyloliquefaciens，該菌株對灰葡萄孢Botrytiscinerea、鏈格孢Alternariasp.、尖孢鐮刀菌Fusarium.oxysporum等病原真菌的拮抗作用顯著。陳妍等[15]從土壤中分離出1株對棉花黃萎病菌Verticilliumdahliae有良好拮抗作用的B.amyloliquefaciens菌株。陳成等[16]從土壤中分離到1株B.amyloliquefaciens，其對黑曲霉Aspergillusniger、稻瘟病菌Magnaportheoryzae和水稻紋枯病菌Rhizoctoniasolani等植物病原真菌有很強的抑制作用。B.amyloliquefaciens菌株DFE16及其發(fā)酵液不僅能抑制病菌生長，而且能誘導油菜對黑脛病產(chǎn)生抗性[17]。B.amyloliquefaciens的發(fā)酵液對油茶炭疽病具有很強的抑制作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)為脂肽，該物質(zhì)能使病菌菌絲畸形[18]。B.amyloliquefaciens分泌的胞外非蛋白類物質(zhì)能有效抑制魚腥藻的生長[19]?？莶菅挎邨U菌不同種群在植物病害的生物防治中有廣泛的應用，其作用機制主要有競爭、抗生、溶菌等[20]。本研究從健康桑樹的根際土壤中分離出1株B.amyloliquefaciensYZ14-3，其對桑根腐病菌L.theobromae的抑制效果顯著，YZ14-3的無菌培養(yǎng)液能完全抑制病菌分生孢子的萌發(fā)，降解分生孢子的細胞壁，從而使孢子解體，說明YZ14-3的培養(yǎng)液中含有溶菌物質(zhì)。溶菌作用是B.amyloliquefaciens菌株YZ14-3抑制病原菌生長的一種機制。田間防治試驗結(jié)果表明，YZ14-3的生防效果較顯著達67.94%，具有一定的應用前景。本研究結(jié)果為菌株YZ14-3在桑根腐病生物防治中的應用奠定了基礎。

16S rDNA/RNA基因序列被廣泛應用于細菌鑒定或研究細菌的系統(tǒng)進化關系，但由于16S rDNA/RNA基因序列過于保守，在親緣關系很近的分類類群間，由于序列間的相似度太高而無法區(qū)分近緣種[21]。Wang等[22]研究認為16S rDNA/RNA基因序列不能有效區(qū)分枯草芽孢桿菌的菌株，而gyrA和gyrB基因序列可以用于枯草芽孢桿菌的鑒定。gyrA和gyrB基因的分子進化速率比16S rDNA/RNA基因大，可以彌補16S rDNA/RNA基因的不足[22-23]。菌株SWB16的16S rRNA序列與B.subtilis、B.amyloliquefaciens、B.licheniformis和貝萊斯芽孢桿菌B.velezensis有99%的相似性，但利用gyrA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示SWB16與B.amyloliquefaciens聚為一群[24]。本文利用gyrA和gyrB基因序列構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，2株系統(tǒng)發(fā)育樹均能將B.amyloliquefaciens與B.subtilis及其他芽孢桿菌近緣種區(qū)分開。目前，gyrA和gyrB基因已經(jīng)應用到許多細菌近緣種的鑒別中，如枯草芽孢桿菌組(B.subtilisgroup)[21，25-26]、假單孢菌屬Pseudomonas[27]、氣單孢菌屬Aeromonas[28]、分枝桿菌屬Mycobacterium[29]等。

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【責任編輯霍歡】

Isolation, identification and field control capability of an antagonistic bacterium strain against mulberry root rot

XIE Honghui1,2, WEI Jiguang1，ZHOU Ying1，XIONG Ying1

(1 College of Agriculture, Guangxi University, Nanning 530004，China;2 Guangxi Subtropical Crops Research Institute, Nanning 530001，China)

Abstract：【Objective】 To isolate bacterium strains that have strongly inhibitory effects against Lasiodiplodia theobromae, the causal agent of mulberry root rot, and test its field control efficiency.【Method】Bacterium strains were isolated from rhizosphere soil of healthy mulberry by plate dilution method.Strains with remarkable antagonist activities against target pathogen were screened by dual culture and spore-germination techniques. The antagonistic bacteria were identified based on morphological, physiological and biochemical characteristics as well as their gyrA and gyrB gene sequences. Field plot experiments were set up to determine the biocontrol effects of antagonistic bacteria under natural conditions.【Result】Eight bacterium strains with inhibitory effects against L. theobromae were isolated, and YZ14-3 was the most effective among them. The inhibition rate of YZ14-3 and its culture extracts were 73.3% and 55.6%, respectively. The mycelia of L. theobromae in the inhibition zone were enlarged and malformed; the conidia could not germinate and disintegrated due to cell wall degradation in the culture extracts of YZ14-3. YZ14-3 was identified as Bacillus amyloliquefaciens using its morphological, physiological and biochemical characteristics as well as the phylogenetic tree based on the BLAST results with gyrA and gyrB gene sequences. Field tests showed that the biocontrol efficiency of YZ14-3 was 67.94%.【Conclusion】The B. amyloliquefaciens strain YZ14-3 has remarkable inhibitory effect against L. theobromae, and therefore it can be used for biocontrol of diseases caused by L. theobromae.

Key words：mulberry root rot； Lasiodiplodia theobromae； Bacillus amyloliquefaciens； inhibitory effect； isolation and identification； field control

中圖分類號：S572

文獻標志碼：A

文章編號：1001- 411X(2016)02- 0059- 06

基金項目：國家自然科學基金(31270076)；廣西科學研究與技術開發(fā)計劃項目(桂科重14121002-4-3)；南寧市科學研究與技術開發(fā)計劃項目(20122065)

作者簡介：謝紅輝(1982—)，男，助理研究員，博士研究生，E-mail：xhp17@126.com；通信作者：韋繼光(1962—)，男，教授，博士，E-mail: jiguangwei@gxu.edu.cn

收稿日期：2015- 07- 03優(yōu)先出版時間：2016- 01- 18

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20160118.1651.014.html

謝紅輝， 韋繼光， 周穎，等.1株桑根腐病拮抗細菌的分離鑒定及田間防治效果[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報，2016,37(2):59- 64.