基于調制熒光檢測技術的柑橘黃龍病診斷

鄧小玲, 林亮生， 蘭玉彬

(1 華南農業(yè)大學 電子工程學院， 廣東 廣州510642； 2 廣東省農業(yè)航空應用工程技術研究中心, 廣東 廣州 510642； 3 華南農業(yè)大學 工程學院， 廣東 廣州 510642)

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基于調制熒光檢測技術的柑橘黃龍病診斷

鄧小玲1,2, 林亮生1， 蘭玉彬2,3

(1 華南農業(yè)大學 電子工程學院， 廣東 廣州510642； 2 廣東省農業(yè)航空應用工程技術研究中心, 廣東 廣州 510642； 3 華南農業(yè)大學 工程學院， 廣東 廣州 510642)

摘要：【目的】實現(xiàn)柑橘黃龍病的及時診斷，防止病情擴散、保障柑橘生產。【方法】運用基于調制熒光檢測技術的超便攜式調制葉綠素熒光儀MINI-PAM獲取柑橘Citrus reticulata葉片熒光參數(shù)，通過概率神經網絡對熒光數(shù)據進行建模及分類處理，以鑒定并區(qū)分健康的、非黃龍病黃化的以及黃龍病的柑橘植株?！窘Y果】該方法對所有類別的診斷準確率均高于76.93%，有些類別分類準確率甚至可達100%?！窘Y論】基于概率神經網絡的柑橘黃龍病調制熒光檢測技術用于鑒別柑橘黃龍病病情具有一定的可行性和推廣性。

關鍵詞：柑橘黃龍??； 熒光檢測； 概率神經網絡； 調制葉綠素熒光

柑橘黃龍病(Huanglongbing,HLB)是柑橘生產中的一種國際毀滅性病害，其危害大、蔓延速度快。柑橘感染HLB后，輕者嚴重影響其產量和品質，重者造成柑橘樹的枯死，迄今鮮見有效的治療方法[1]。為了防止HLB病菌擴散，目前柑橘生產采用的首要措施是連根挖除病株。因此，準確可靠地鑒別出HLB，及早挖除病株，對于HLB的防治具有重大意義。

HLB診斷方法有田間診斷、嫁接診斷、電鏡觀察、血清學診斷、DNA探針雜交以及PCR 擴增等[2-6]。目前PCR是較為可靠的檢測方法，但其檢測過程繁瑣、復雜、周期長、費用高，難以推廣普及[7]。因此，尋找一種便捷高效的檢測方法，對HLB的及時防治具有重大意義。近幾年基于光譜學的HLB檢測方法陸續(xù)有報道。Sankaran等[8]基于HLB病葉對淀粉的大量累積效應，采用中程紅外光譜檢測HLB，該方法對HLB病葉、健康葉片、缺素癥病葉的分類精確度達到90%以上。在光譜檢測的基礎上，國外一些學者利用衰減全反射傅里葉紅外光譜法檢測HLB，也取得了較好的效果[9]。華南農業(yè)大學柑橘黃龍病鑒定研究課題組基于高光譜技術對HLB診斷進行了深入的研究，也獲得了較好的研究成果[10-12]。盡管高光譜技術對HLB有較高的診斷精度，但由于高光譜數(shù)據獲取的過程較復雜，多數(shù)是在實驗室環(huán)境下采用昂貴的高光譜成像儀完成的，其高光譜或多光譜傳感器價格不菲，應用于田間作業(yè)不太現(xiàn)實。

超便攜式調制葉綠素熒光儀MINI-PAM是一款外觀迷你但功能非常強大的調制熒光儀，特別適合于生態(tài)學研究。該儀器采用了獨特的調制技術和飽和脈沖技術，可通過選擇性的原位測量葉綠素熒光，從而檢測植物光合作用的變化。該儀器具有很強的靈敏度和選擇性，即使在很強的、未經濾光片處理的環(huán)境下，也能測定熒光產量且不受到干擾，是野外光合作用研究的強大工具。MINI-PAM主要應用于研究光合作用機理、各種環(huán)境因子(光、溫、營養(yǎng)等)對植物生理生態(tài)的影響、植物抗逆性和植物的長期生態(tài)學變化等[13-17]。

本文以柑橘葉片為研究對象，通過超便攜式調制葉綠素熒光儀MINI-PAM獲取柑橘葉片的熒光參數(shù)，采用概率神經網絡(Probability neural network,PNN)對不同病狀葉片的熒光參數(shù)數(shù)據進行訓練處理并建模，探索基于概率神經網絡的HLB調制熒光檢測方法的可行性和有效性。

1材料與方法

1.1材料

本試驗采用超便攜式調制葉綠素熒光儀MINI-PAM采集柑橘葉片的熒光參數(shù)。柑橘葉片的試驗樣本主要來自于清遠市市級柑橘黃龍病綜合防控示范果園，部分葉片采集于廣東省惠州市博羅縣楊村鎮(zhèn)新天地果場。試驗地點為華南農業(yè)大學生命科學學院。

1.2調制熒光數(shù)據的采集

將采集到的柑橘葉片樣本先存放于紙箱中避光處理約30 min，以充分地進行暗適應，隨后取出葉片夾于葉片夾中，啟動超便攜式調制葉綠素熒光儀，獲取樣本的各種熒光參數(shù)：Fo,Fm,F,Ft，F(xiàn)m′，F(xiàn)v/Fm,qP，qN，NPQ，ETR,PTR和Yield參數(shù)等。其中Fo和Fm為最小和最大熒光參數(shù)；F表示飽和脈沖前的熒光值；Ft代表任一給定時間測量得到的熒光產量，它反映了樣品的還原狀態(tài)和能態(tài)。Fm′代表光適應的樣品打開飽和脈沖時得到的最大熒光產量；Fv/Fm反映了(在最適條件下經過暗適應后的)光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的最大量子產量；qP和qN分別被定義為光化學和非光化學熒光淬滅系數(shù)；NPQ是非光化學淬滅的另一種表達方式；ETR代表相對光合電子傳遞速率；PTR代表入射到樣品的光合有效輻射強度；Yield是利用飽和脈沖法進行熒光淬滅分析的根本，最常用于野外測量穩(wěn)態(tài)光照下的量子產量，此時PSⅡ的有效量子產量最接近光合作用的實際量子產量。在眾多參數(shù)中，F(xiàn)v/Fm和Yield都是比值，不依賴于測量的靈敏度，與樣品葉綠素濃度的高低和樣品形狀無關，選取這2個參數(shù)較能反映柑橘葉片病癥。因此經過數(shù)據分析之后，決定采用Fv/Fm和Yield這2個數(shù)據作為神經網絡的輸入特征參量。Fv/Fm的計算公式如下：

調制熒光儀Yield的參數(shù)，即穩(wěn)態(tài)光照下的量子產量，是MINI-PAM熒光儀提供的最重要的信息，可通過超便攜式調制葉綠素熒光儀直接讀取。其計算公式如下：

Yield=(Fm′-Ft)/Fm。

2數(shù)據分析

2.1概率神經網絡

概率神經網絡PNN是由徑向基網絡發(fā)展而來的一種前饋性神經網絡。它是基于Bayes最小風險準則與Parzen窗的概率密度函數(shù)估計方法發(fā)展而來的一種并行算法，具有訓練時間短、結構固定、應用廣泛、能產生貝葉斯后驗概率輸出等優(yōu)點。在解決分類問題時，PNN可以用線性學習算法來完成非線性算法所完成的工作，同時又可以保持非線性算法的高精度。這種網絡對應的權值就是模式樣本的分布，網絡不要訓練而不作任何修改，只需對高斯函數(shù)的平滑因子進行經驗式統(tǒng)計的估計，因而能夠滿足訓練上實時處理的要求。

PNN網絡由輸入層、模式層、求和層、輸出層構成。求和層是將某類的概率進行累計，每一類只有一個求和層，求和層單元與只屬于自己類的模式層單元相連接，而與其他模式層單元無連接。求和層單元的輸出與各類基于內核的概率密度的估計成比例，通過輸出層的歸一化處理，就能得到各類的概率估計。

概率神經網絡的輸出層由簡單的閾值辨別器組成，具有最大后驗概率密度的神經元將作為整個系統(tǒng)的輸出。輸出層神經元是一種競爭型神經元，每個神經元分別對應于一種數(shù)據類型，輸出層神經元的個數(shù)等于訓練樣本數(shù)據的種類的個數(shù)，從求和層輸出的各類概率密度函數(shù)中，最大概率密度函數(shù)的那個神經元輸出為1，作為待識別的樣本模式類別，其他神經元的輸出全為0。

2.2數(shù)據處理

對于調制熒光參數(shù)，F(xiàn)v/Fm和Yield都是比值，不依賴于測量的靈敏度，與樣品葉綠素濃度的高低和樣品形狀無關，選取這2個參數(shù)較能反映柑橘葉片病癥，因此選擇了這2個參數(shù)特征量作為網絡的輸入，網絡的輸入節(jié)點數(shù)為2。

柑橘葉片的分類和采集環(huán)節(jié)由華南農業(yè)大學資源環(huán)境學院黃龍病研究室提供技術支持，主要由專家經驗判斷以及PCR技術聯(lián)合檢測的方法實現(xiàn)柑橘葉片的分類，其分類結果用于檢測本文方法的有效性。

根據已分好類的柑橘葉片，選取了健康、缺錳、缺鎂、缺鎂兼黃龍病、黃化、斑駁和缺鋅共7種類型，對應的網絡的期望輸出可分別用1、2、3、4、5、6、7來表示。這7種類型中，缺鎂兼黃龍病(缺鎂HLB)、黃化、斑駁屬于黃龍病，缺錳、缺鎂、缺鋅屬于缺素癥。

將MINI-PAM獲得的各類病情葉片的Fv/Fm和Yield參數(shù)輸入PNN網絡，用于網絡的訓練，部分樣本輸入向量數(shù)據如表1所示。用上述柑橘葉片調制熒光參數(shù)構建概率神經網絡，對柑橘黃龍病癥狀進行分類，SPREAD擴展系數(shù)設置為0.01。輸入50組待檢驗樣本的數(shù)據進行檢測，得到檢測結果。其步驟總結如下：

選取7種類型樣本，收集它們的Fv/Fm和Yield熒光數(shù)據；運用收集的熒光參數(shù)訓練PNN網絡；將需要識別的未知樣本的熒光參數(shù)輸入網絡實現(xiàn)分類。

運用收集的熒光參數(shù)訓練PNN網絡在MATLAB實現(xiàn)過程中，選擇合適的徑向基函數(shù)的擴展速度SPREAD值來訓練網絡顯得尤為重要。SPREAD值對網絡精度的影響非常明顯。SPREAD值越小，對函數(shù)的逼近就越精確，但是逼近的過程就越不平滑；SPREAD值越大，逼近誤差比較大，但逼近過程就比較平滑。SPREAD值過大或過小都會造成網絡精度的偏差。試驗過程中，通過設置不同的SPREAD值得到不同的分類結果，并建立混淆矩陣，得到總精度，進行對比后最終選定SPREAD值為0.01。

在MATLAB中創(chuàng)建一個概率神經網絡的函數(shù)為：newpnn(P,T,SPREAD)。其中P為輸入樣本，T為目標分類向量，其由函數(shù)ind2vec將類別向量轉換而成。

表1部分樣本輸入向量數(shù)據

Tab.1Input vectors of samples with different symptons

健康葉片缺錳葉片缺鎂葉片缺鎂HLB葉片黃化葉片斑駁葉片缺鋅葉片F(xiàn)v/FmYieldFv/FmYieldFv/FmYieldFv/FmYieldFv/FmYieldFv/FmYieldFv/FmYield0.6690.1950.3890.0750.6850.1710.4980.1150.1480.0160.2810.0420.5340.1570.7130.2170.2890.0550.5610.1210.4360.0760.1950.0060.3330.0760.5050.1600.6810.2500.2280.0660.5000.0580.5590.1080.1400.0080.1300.0200.4080.086??????????????

3結果與分析

在華南農業(yè)大學資源環(huán)境學院黃龍病研究實驗室的技術支持下，所有待檢測的葉片均通過了專家判斷以及PCR檢測，確定了其病狀類別?；诟怕噬窠浘W絡的柑橘調制熒光檢測結果與以上結果進行匹配，每一類別共采用50組葉片數(shù)據進行驗證，得到如表2所示的分類準確率。從表2可以看出，基于概率神經網絡的調制熒光檢測方法，可100%檢測出健康和缺鋅癥狀的柑橘葉片。黃化和缺錳癥狀的識別度也高于90%。缺鎂和缺鎂HLB(即缺鎂又具黃龍病)的識別度較好，達76.93%以上。本文所述方法為柑橘黃龍病檢測提供了較為可行的新途徑。識別度不是特別理想的主要原因在于部分類別之間存在病情交叉，因此熒光參數(shù)具有較大的相似性。此外，黃龍病癥狀多樣，與其他缺素癥狀類似，在外觀上普遍呈現(xiàn)黃化現(xiàn)象，肉眼難以分辨，部分熒光系數(shù)也存在一定的相似性，導致分類精度不甚完美。后期將進一步研究更適合的數(shù)據處理方法以及采集更多葉片進行數(shù)據分析，提高分類精度地及有效性。

表2　概率神經網絡分類結果

4結論

為了有效地檢測柑橘黃龍病，本研究采用了調制熒光技術，運用了概率神經網絡模型對采集數(shù)據進行了處理與分析，研究表明：該方法可以較好地檢測出柑橘黃龍病，能夠100%檢測出柑橘的健康葉片和缺鋅葉片，對于其他癥狀也有較好的分類，最低分類準確率為76.93%。

基于概率神經網絡的柑橘黃龍病調制熒光檢測技術在柑橘黃龍病的無損檢測方面有一定的可行性。

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【責任編輯霍歡】

Citrus Huanglongbing detection based on modulation chlorophyll fluorescence measurement

DENG Xiaoling1,2, LIN Liangsheng1, LAN Yubin2,3

(1 College of Electronic Engineering， South China Agricultural University,Guangzhou 510642， China；2 Engineering Research Center for Agricultural Aviation Application, Guangzhou 510642， China；3 College of Engineering， South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

Abstract：【Objective】 To diagnose citrus Huanglongbing(HLB) timely to prevent citrus production from the spread of the disease. 【Method】 A detection method of citrus HLB based on modulation chlorophyll fluorescence measurements was investigated. Fluorescence parameters were extracted from MINI-PAM, and analyzed by probability neural network (PNN) model and classification to distinguish among healthy citrus, HLB-infected citrus and etiolated citrus due to non-HLB problems. 【Result】 The average detection accuracy for different classes of citrus symptoms was above 76.93%, and that for some classes even reached 100%. 【Conclusion】 It is feasible to use the modulation chlorophyll fluorescence measurement combined with PNN model to detect citrus HLB.

Key words：citrus Huanglongbing; flurescence detection; PNN; modulation chlorophyll fluorescence

中圖分類號：S33

文獻標志碼：A

文章編號：1001- 411X(2016)02- 0113- 04

基金項目：國家自然科學基金青年基金(31201129)； 廣東省科技計劃項目(2015B050501009)； 江蘇省現(xiàn)代農業(yè)裝備與技術協(xié)同創(chuàng)新項目(NZXT01201403)； 華南農業(yè)大學人才引進項目(K14018)

作者簡介：鄧小玲(1978—)，女，副教授，博士，Email：dengxl@scau.edu.cn；通信作者：蘭玉彬(1961—)，男，教授，博士，E-mail：ylan@scau.edu.cn

收稿日期：2015- 06- 10優(yōu)先出版時間：2016- 01- 18

優(yōu)先出版網址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20160118.1651.032.html

鄧小玲, 林亮生， 蘭玉彬.基于調制熒光檢測技術的柑橘黃龍病診斷[J].華南農業(yè)大學學報，2016,37(2):113- 116.