超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)和鑒定豬尿中氯丙那林的主要代謝產(chǎn)物

畢言鋒 ， 王亦琳， 葉 妮， 孫 雷， 王鶴佳， 徐士新， 肖希龍

（1. 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京100193）

β-腎上腺受體激動(dòng)劑（β-adrenergic agonists，β-AAs）是臨床上常用的一類平喘藥物。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用劑量是推薦治療劑量的5 ～10 倍時(shí)，克倫特羅、西馬特羅等β-AAs 能促進(jìn)動(dòng)物脂肪代謝，并增加蛋白合成，具有明顯的“營(yíng)養(yǎng)再分配”作用［1-3］。因此，多種β-AAs 類化合物先后在養(yǎng)殖中作為促生長(zhǎng)劑被大量使用，在我國(guó)也被稱為“瘦肉精”。然而，由于克倫特羅殘留在歐洲多個(gè)國(guó)家導(dǎo)致了多起食品中毒事故，歐盟、中國(guó)等先后禁止β-AAs 物質(zhì)用作食品動(dòng)物促生長(zhǎng)劑［4，5］。近年來(lái)，作為新的“瘦肉精”替代品，β-AAs 類化合物氯丙那林（CLO）也被發(fā)現(xiàn)非法添加于飼料中［6］。同時(shí)，還出現(xiàn)了獸藥制劑中添加氯丙那林的違法事件。為了保障動(dòng)物源食品安全，農(nóng)業(yè)部1519 號(hào)公告已經(jīng)禁止鹽酸氯丙那林等在飼料和動(dòng)物飲水中使用［7］。

在分子結(jié)構(gòu)上，β-AAs 類化合物一般具有苯乙醇胺（phenylethanolamine，PEA）母核以及不同的N-取代基（見(jiàn)圖1）。Smith 等［8］的研究表明，苯環(huán)取代基類型是決定β-AAs 類化合物代謝特點(diǎn)的關(guān)鍵因素。當(dāng)PEA 的苯環(huán)上有羥基（苯酚型，如萊克多巴胺、沙丁胺醇等）時(shí)，動(dòng)物體內(nèi)的主要代謝途徑是酚羥基的葡萄糖醛酸或硫酸軛合，且軛合代謝產(chǎn)物是體內(nèi)的主要?dú)埩粜问?。而?duì)于克倫特羅等苯環(huán)取代基為氨基（苯胺型）的β-AAs，在動(dòng)物體內(nèi)可能發(fā)生氧化、軛合代謝，但主要?dú)埩粜问綖槲创x的原形。在檢測(cè)動(dòng)物尿液和組織中β-AAs 殘留時(shí)，一般先對(duì)樣品進(jìn)行水解，然后測(cè)定游離態(tài)β-AAs 原形的總量［9-12］。

氯丙那林分子（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1a）的苯環(huán)上只有一個(gè)氯取代基，既不屬于苯胺型，也不屬于苯酚型。因此，氯丙那林在動(dòng)物體內(nèi)的主要代謝途徑可能與其他β-AAs 類化合物不同。目前，氯丙那林在豬、牛等家畜體內(nèi)的代謝研究還是空白，而在一些專門針對(duì)氯丙那林的殘留分析方法中［13，14］，并未對(duì)樣品進(jìn)行酶解，且直接將原形作為檢測(cè)目標(biāo)物。在本研究中，將利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC／Q-TOF MS）技術(shù)，檢測(cè)和鑒定豬口服氯丙那林后尿液中的主要代謝產(chǎn)物，研究氯丙那林在豬體內(nèi)的主要代謝途徑。

圖1 （a）氯丙那林、（b）克倫特羅和（c）萊克多巴胺的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of （a）clorprenaline，（b）clenbuterol and （c）ractopamine

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Waters Acquity UPLC-SYNAPT HDMS，美國(guó)Waters公司）；豬代謝籠（北京人和機(jī)械廠）；高速離心機(jī)（德國(guó)Thermo 公司）；渦旋振蕩器（MS-3，德國(guó)IKA公司）；氯丙那林（含量＞95%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；乙腈（HPLC 級(jí)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；甲酸（分析純，北京試劑公司）

1.2 樣品采集及處理

長(zhǎng)白豬（購(gòu)自北京市蘇家坨養(yǎng)殖場(chǎng)），體重30 ～40 kg。代謝實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)物在代謝籠中適應(yīng)一周，飼喂空白飼料，自由飲水。給藥前禁食12 h，不禁水。按10 mg／kg （b. w.）的劑量，口服給藥一次。給藥后，自由采食進(jìn)水。收集給藥前12 h 內(nèi)的尿液，作為空白樣品。收集給藥后24 h 內(nèi)的尿液，8 000 r／min 離心10 min，取上清液于-20 ℃冷凍保存。

取以上樣品500 μL 于5 mL 塑料離心管中，加入乙腈溶液2.0 mL，充分渦旋振蕩后，以5 000 r／min 離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液。按照以上方法，重復(fù)提取一次。合并上清液，在50 ℃氮?dú)饬飨聺饪s至小于0.5 mL。用水定容至0.5 mL 后，以12 000 r／min 離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm 濾膜后，供UPLC／Q-TOF MS 分析。

1.3 UPLC／Q-TOF MS 條件

色譜柱采用ACQUITY HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱 溫30 ℃，流 速0.400 mL／min，進(jìn)樣體積2 μL。流動(dòng)相A 為含0.1% 甲酸的乙腈，流動(dòng)相B 為含0.1% 甲酸的水溶液，梯度洗脫程序如下：0 ～1.0 min，保持2% A；1.0 ～5.0 min，流動(dòng)相A 的比例由2% 線性變化至30%；5.0～7.0 min，流動(dòng)相A 的比例由30% 線性變化至60%；7.0 ～9.0 min，流動(dòng)相A 的比例保持95%；9.0 ～11.0 min，保持流動(dòng)相A 的比例為2%。

Q-TOF MS 采用電噴霧正離子源（ESI＋）；毛細(xì)管電壓3.0 kV；電離源溫度120 ℃，錐孔電壓20 V，數(shù)據(jù)采集質(zhì)量范圍為50 ～1 000 Da；數(shù)據(jù)采集方式為MSE模式，一級(jí)質(zhì)譜（MS）碰撞能量為4 eV，二級(jí)質(zhì)譜（MS／MS）碰撞能量為10 ～30 eV。檢測(cè)前，采用甲酸鈉溶液進(jìn)行精確質(zhì)量校正，并用亮氨酸-腦啡肽溶液（［M＋H］＋，m／z 556.277 1 Da）進(jìn)行實(shí)時(shí)質(zhì)量鎖定。

1.4 代謝物檢測(cè)和結(jié)構(gòu)鑒定

采用MetaboLynx XS 軟件對(duì)UPLC／Q-TOF MS 采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。首先，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量虧損過(guò)濾（MDF）處理，消除內(nèi)源性代謝物的干擾。在MDF 處理時(shí)，以氯丙那林（C11H17NOCl，［M ＋H］＋＝214.099 9 Da）為模板（template），MDF 的閾值為±50 mDa。然后，根據(jù)氯丙那林可能代謝途徑的精確質(zhì)量變化，進(jìn)行離子色譜峰提?。‥IC），篩查可能的代謝產(chǎn)物。其中，在EIC 處理中，保留時(shí)間和精確質(zhì)量的誤差分別為±0.05 min 和±10 mDa。最后，根據(jù)MSE采集的MS／MS 信息，對(duì)比代謝產(chǎn)物和原形的主要碎片離子，對(duì)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

1.5 相對(duì)含量計(jì)算

由于無(wú)法得到所有代謝物的對(duì)照品，因此，只能根據(jù)EIC 的峰面積估算氯丙那林原形或代謝物的相對(duì)含量。具體計(jì)算公式如下：氯丙那林或代謝物相對(duì)含量＝峰面積CLO或代謝物／（峰面積CLO＋峰面積CLO_M1＋……＋峰面積CLO_M9）×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 氯丙那林的質(zhì)譜裂解特征

根據(jù)UPLC／Q-TOF MS 采集的MS／MS 信息（見(jiàn)圖2），氯丙那林的準(zhǔn)分子離子（［M＋H］＋）可以產(chǎn)生4 個(gè)主要的碎片離子，分別為m／z 196、m／z 154、m／z 118 和m／z 91，其元素組成、精確質(zhì)量數(shù)（exact mass，EM）和不飽和度（double bond equivalent，DBE）分別見(jiàn)表1。

圖2 氯丙那林的MS／MS 圖Fig.2 MS／MS spectrum of clorprenaline

表1 氯丙那林的［M＋H］＋及其主要碎片離子的元素組成、EM 理論值及測(cè)量值、不飽和度（DBEs）和質(zhì)量偏差Table 1 Element compositions，exact masses，DBEs and mass errors of［M＋H］＋and fragment ions of clorprenaline

圖3 氯丙那林的質(zhì)譜碎裂途徑Fig.3 Proposed fragmentation pathways of clorprenaline

2.2 代謝產(chǎn)物鑒定

除氯丙那林原型外，在豬尿液中還檢測(cè)到9 種主要代謝產(chǎn)物，其中，Ⅰ相代謝產(chǎn)物2 種，Ⅱ相代謝產(chǎn)物7 種。氯丙那林及其代謝產(chǎn)物的UPLC 保留時(shí)間（RT）、精確質(zhì)量數(shù)、元素組成和相對(duì)含量等見(jiàn)表2。另外，9 種代謝產(chǎn)物（CLO_M1 ～ CLO_M9）的EICs 譜圖和MS／MS 譜圖分別見(jiàn)圖4 和圖5。

表2 豬尿樣品中氯丙那林及其代謝產(chǎn)物的色譜-質(zhì)譜信息、代謝途徑和相對(duì)含量Table 2 LC-MS information，biotransformation pathways and relative contents of clorprenaline and its metabolites in swine urine

圖4 豬尿中氯丙那林代謝產(chǎn)物（CLO_M1 ～CLO_M9）的EIC 圖Fig.4 EICs of clorprenaline metabolites （CLO_M1-CLO_M9）in swine urine

2.2.1 Ⅰ相代謝產(chǎn)物

代謝物CLO_M1（m／z 230.094 5，RT ＝3.66 min）與CLO_M2（m／z 230.095 6，RT ＝4.09 min）的［M＋H］＋的元素組成都為C11H17NO2Cl（EM 理論值為230.094 8 Da），比氯丙那林（C11H17NOCl）多一個(gè)氧原子。MS／MS 圖（圖5）顯示，M1 和M2 具有相同的碎片離子m／z 212、m／z 170 和m／z 134，比氯丙那林的特征碎片離子m／z 196、m／z 154 和m／z 118 大16 Da，說(shuō)明CLO_M1 和CLO_M2 是氯丙那林的氧化產(chǎn)物。另外，碎片離子m／z 170（C8H9NOCl）和m／z 134（C8H8NO）的存在，說(shuō)明氧化代謝反應(yīng)發(fā)生在苯環(huán)上，而不是側(cè)鏈的N-異丙基上。因此，CLO_M1 和CLO_M2 被確定為氯丙那林的苯環(huán)羥基化代謝產(chǎn)物（OH-CLO），可能的質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖6。

圖5 氯丙那林代謝產(chǎn)物（CLO_M1 ～CLO_M9）的MS／MS 圖Fig.5 MS／MS spectra of clorprenaline metabolites （CLO_M1-CLO_M9）

2.2.2 Ⅱ相代謝產(chǎn)物

代謝物CLO_M3（m／z 390.131 2，RT ＝4.05 min）和CLO_M4（m／z 390.130 5，RT ＝4.24 min）的［M＋H］＋的元素組成為C17H25NO7Cl（EM 理論值為390.132 0 Da），比氯丙那林多C6H8O6（EM 理論值為176.032 1 Da）。同時(shí)，CLO_M3 和CLO_M4都具有與氯丙那林相同的特征碎片離子m／z 196和m／z 154（見(jiàn)圖5），因此，可以確定它們?yōu)槁缺橇值钠咸烟侨┧彳椇袭a(chǎn)物（GLU-CLO），可能的軛合反應(yīng)位點(diǎn)為β-羥基或脂肪仲胺。

圖6 OH-CLO 可能的質(zhì)譜裂解過(guò)程Fig.6 Proposed fragmentation pathways of OH-CLO

代謝物CLO_M5（m／z 406.126 4，RT ＝2.71 min）、CLO_M6（m／z 406.127 1，RT ＝2.75 min）、CLO_M7（m／z 406.124 8，RT ＝3.35 min）和CLO_M8（m／z 406.127 1，RT ＝3.41 min）的［M＋H］＋的元素組成全部為C17H25NO8Cl（EM 理論值為406.126 9 Da），比OH-CLO（CLO_M1 和CLO_M2）多C6H8O6（EM 理論值為176.032 1 Da）。同時(shí)，它們都具有與OH-CLO（CLO_M1 和CLO_M2）相同的特征碎片離子m／z 212 和m／z 170（見(jiàn)圖5）。因此，CLO_M5、CLO_M6、CLO_M7 和CLO_M8 是OH-CLO 的4 種葡萄糖醛酸軛合物（GLU-OHCLO）。

在OH-CLO 分子中，β-羥基、脂肪仲胺或酚羥基都可能與葡萄糖醛酸軛合。有研究［8］表明，對(duì)于苯環(huán)上有羥基的β-AAs 化合物（如萊克多巴胺等），酚羥基比β-羥基和仲氨基更容易與葡萄糖醛酸發(fā)生軛合反應(yīng)。從圖4 可以看出，CLO_M8 的質(zhì)譜響應(yīng)明顯大于其他GLU-OH-CLO 的同分異構(gòu)體。因此，可以推測(cè)CLO_M8 的軛合位點(diǎn)可能在苯環(huán)上的羥基上。然而，只根據(jù)質(zhì)譜所采集的碎片離子信息，還無(wú)法準(zhǔn)確確定軛合反應(yīng)發(fā)生的具體位置。

代謝物CLO_M9（m／z 310.052 0，RT ＝3.34 min）的［M＋H］＋對(duì)應(yīng)的元素組成為C11H17NSO5Cl（EM 理論值為310.051 6 Da），比OH-CLO（CLO_M1 和CLO_M2）多SO3（EM 理論值79.956 8 Da）。同時(shí)，CLO_M9 可以失去SO3生成碎片離子m／z 230（C11H17NO2Cl），并具有與OH-CLO 相同的特征碎片離子m／z 212 和m／z 170（圖5）。因此，可以確定CLO_M9 為OH-CLO 的硫酸軛合產(chǎn)物（SO3-OH-CLO）。另外，在尿液中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)氯丙那林的硫酸軛合產(chǎn)物（C11H17NSO4Cl，［M＋H］＋＝294.056 7 Da），說(shuō)明β-羥基和脂肪仲胺不易與硫酸軛合。由此可以推測(cè)，CLO_M9 的硫酸軛合位點(diǎn)在苯環(huán)羥基化引入的酚羥基上。

2.3 氯丙那林在豬體內(nèi)的主要代謝途徑

在本研究中，利用UPLC／Q-TOF MS 在豬尿中檢測(cè)和鑒定了氯丙那林的2 種Ⅰ相代謝產(chǎn)物和7 種Ⅱ相代謝產(chǎn)物。根據(jù)代謝物鑒定結(jié)果，推測(cè)氯丙那林在豬體內(nèi)先發(fā)生苯環(huán)羥基化和葡萄糖醛酸軛合，而羥基化氯丙那林（OH-CLO）還能繼續(xù)與葡萄糖醛酸和硫酸軛合（見(jiàn)圖7）。

圖7 氯丙那林在豬體內(nèi)的主要代謝途徑Fig.7 Proposed metabolic pathways of clorprenaline in swine

本研究的結(jié)果表明，與其他β-AAs 化合物相似，氯丙那林在豬體內(nèi)的主要代謝途徑也是氧化和軛合反應(yīng)。以前的研究顯示，苯胺型的克倫特羅在牛和豬體內(nèi)的氧化代謝主要發(fā)生在苯胺上［14，15］。然而，由于苯環(huán)上的取代基類型不同，氯丙那林的氧化代謝主要是苯環(huán)的羥基化。另外，氯丙那林也能通過(guò)β-羥基和仲氨基與葡萄糖醛酸軛合，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其硫酸軛合產(chǎn)物。

氯丙那林的羥基化代謝產(chǎn)物（OH-CLO）含有一個(gè)酚羥基，結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與苯酚型β-AAs（如萊克多巴胺）相似。本研究發(fā)現(xiàn)，OH-CLO 的代謝特征與萊克多巴胺相同［8，16］，可 以生成 葡萄糖 醛酸軛 合物（GLU-OH-CLO）和硫酸軛合產(chǎn)物（SO3-OH-CLO）。另外，OH-CLO 及其軛合物（GLU-OH-CLO 和SO3-OH-CLO）的相對(duì)含量為60.9%，明顯高于氯丙那林原形及其軛合產(chǎn)物（39.1%）。因此，羥基化及軛合反應(yīng)是氯丙那林在豬體內(nèi)的主要代謝途徑。

3 結(jié)論

本文采用UPLC／Q-TOF MS 鑒定了豬尿中氯丙那林的9 種代謝產(chǎn)物，并推測(cè)了氯丙那林在豬體內(nèi)的主要代謝途徑——苯環(huán)羥基化、葡萄糖醛酸軛合和硫酸軛合。本研究還發(fā)現(xiàn)，羥基化氯丙那林及其軛合物是尿液中的主要代謝產(chǎn)物，這將為確定氯丙那林在動(dòng)物體內(nèi)的殘留標(biāo)示物提供科學(xué)依據(jù)。

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