離子液體均相液液微萃取-高效液相色譜法測定嬰兒奶粉中5 種三嗪類除草劑

張麗媛， 姚 笛， 李 娜， 張寒琦， 于愛民*

（1. 吉林大學化學學院，吉林 長春130012；2. 黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江 大慶163319）

三嗪類除草劑屬于有機雜環(huán)類化合物，具有除草活性高、殺草譜廣、適用范圍大等優(yōu)點，已成為現(xiàn)代除草劑中的主流產(chǎn)品［1，2］。但是大量的研究已經(jīng)證實三嗪除草劑的毒性：一方面，這類除草劑可能導致先天性缺陷，并可能致癌；另一方面，三嗪類化合物能夠干擾荷爾蒙的正常功能，引起內(nèi)分泌失調(diào)［3-5］。三嗪類除草劑及其代謝降解產(chǎn)物除了對農(nóng)作物造成污染外，還會對土壤、水等周圍環(huán)境造成污染，并通過生物循環(huán)進入動物以及人體內(nèi)；由于其代謝和排泄緩慢而在體內(nèi)累積，最終導致動物以及人體中毒甚至死亡。

嬰兒相對于成人而言更容易受到侵害。調(diào)查顯示嬰兒遭受有機化合物的持續(xù)性傷害的重要途徑就是攝入被污染的嬰兒食品，其中受污染的嬰兒配方奶粉是重要的途徑之一。這是因為嬰兒配方奶粉是嬰兒出生后很長一段時間重要的營養(yǎng)來源，且對嬰兒的生長發(fā)育和代謝調(diào)節(jié)等起著重要作用。美國環(huán)保署和美國食品和藥品監(jiān)督管理局對乳制品中的除草劑農(nóng)藥最大殘留量做出明確規(guī)定，要求不得高于50 μg／kg，嬰幼兒奶粉中不允許檢測出農(nóng)藥殘留［6］。

嬰兒配方奶粉由于含有大量的蛋白質(zhì)和脂肪，會對目標分析物的萃取、富集和檢測產(chǎn)生干擾，為樣品前處理增加了難度。從不同基質(zhì)中萃取三嗪除草劑的常用方法有液液微萃?。?］、固相萃?。?］、固相微萃取［9］、濁點萃取［10］、溶劑浮選［11］、基質(zhì)固相分散［12］、QuEChERS［13］等。超聲輔助離子液體／離子液體均相液液微萃?。║A-IL／IL-HLLME）是在常規(guī)液液微萃取法的基礎上發(fā)展起來的新型微萃取法。該方法將液液微萃取、濁點萃取和超聲輔助技術巧妙地結合起來，具有快速、高效、便利、精密度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。在液液微萃取中，選擇的萃取劑既要便于與水相分離又要對待測物有較強的溶解能力。離子液體［14-17］在100 ℃以下呈液態(tài)，具有許多特殊性質(zhì)，相比較液液微萃取過程中常用的有機試劑，離子液體是對環(huán)境更友好的綠色試劑。離子液體對有機物、無機物、金屬氧化物、金屬有機物和聚合物等具有很強的溶解能力，可以通過改變其離子結構改變它的溶解度。利用離子液體可以實現(xiàn)對嬰兒配方奶粉等復雜基質(zhì)中三嗪類除草劑的萃取和富集［18-21］。

本實驗采用以離子液體為萃取溶劑的均相液液微萃取對嬰兒配方奶粉中的草凈津、敵草凈、特丁通、特丁津、異戊乙凈進行萃取和富集，并采用高效液相色譜法對這5 種三嗪類除草劑進行了分離測定。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑和樣品

Agilent 1200 型高效液相色譜儀，配多波長檢測器、真空脫氣機和Chemstation 工作站（美國Agilent 公司）；電子分析天平（ALC-310 型，上海民橋科學儀器有限公司）；超聲波清洗器（KQ2200E，昆山超聲儀器有限公司）；高速離心機（Allegre 64R，美國貝克曼公司）；純水凈化儀（Milli-Q，法國Millipore 公司）；Eclipse XDB-C18 柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm；美國Agilent 公司）；移液槍（Finnpipetter F3，賽默飛世爾科技公司）；微量注射器（美國Agilent 公司）；針式有機相濾膜（0.22 μm，天津蘭博儀器有限公司）

乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher 公司）；磷酸、乙醇和氯化鈉（分析純，北京化學試劑廠）；實驗用超純水由Milli-Q 水處理系統(tǒng)制得。

離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（［BMIM］［BF4］，純度＞99%）、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（［HMIM］［BF4］，純度＞99%）、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（［BMIM］［PF6］，純度＞98%）、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（［HMIM］［PF6］，純度＞97%）和1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（［OMIM］［PF6］，純度＞99%）以及六氟磷酸銨（NH4PF6，98%）購于上海成捷化學試劑公司。

三嗪類除草劑草凈津、敵草凈、特丁通、特丁津和異戊乙凈標準品，純度均大于99%，購于中國藥品生物制品檢定所（北京）。

4 種不同的嬰兒配方奶粉購于超市，這些樣品包括適用0 ～6 個月的嬰兒配方奶粉（樣品1）、6 ～12 個月的嬰兒配方奶粉（樣品2）、12 ～24 個月的嬰兒配方奶粉（樣品3）和24 ～36 個月的嬰兒配方奶粉（樣品4）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

準確稱取適量三嗪類除草劑標準品，用甲醇溶解配制500 mg／L 單標準儲備液，于4 ℃下保存。分別移取單標準儲備液用甲醇配制成10 mg／L 的混合標準溶液；根據(jù)實驗要求稀釋成0.5 ～10 mg／L的混合標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理

準確稱取2.000 0 g 的嬰兒配方奶粉，溶解于20.00 mL 60 ℃的超純水中，振蕩15 min，保證固體奶粉完全溶解并混合均勻；取5.00 mL 混合后的樣品溶液放入10 mL 的聚四氟乙烯離心管中，加入0.20 g NaCl，用0.1 mol／L 磷酸溶液調(diào)節(jié)pH 值為6，在40 ℃下超聲振蕩10 min，于20 ℃、15 000 r／min 條件下離心10 min，將上清液轉移至另一支10 mL 聚四氟乙烯萃取管中，依次加入80 μL［HMIM］［PF6］（萃取劑）和80 μL［HMIM］［BF4］（分散劑），將此離心管置于超聲波清洗器中于40℃下萃取5 min。再加入150 μL 離子對試劑溶液NH4PF6，振蕩1 min。此時離心管中的溶液形成一個水／分散劑／萃取劑的乳濁液體系，三嗪類除草劑迅速地由水相轉移到萃取相（離子液體相）中并且達到兩相平衡。平衡后，溶液在室溫、15 000 r／min條件下離心10 min，此時觀察到溶液分層，在萃取管底部得到萃取液沉積相。完全移除上層的水相，同時用50 μL 微量注射器將萃取液完全轉移到1.0 mL 離心管中，再用流動相稀釋到200 μL 作為分析溶液，超聲2 min，過0.22 μm 濾膜后進行高效液相色譜分析。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18 色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm；美國Agilent 公司）；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈（A）和水（B）；流速：1.00 mL／min；梯度洗脫程序：0 ～5 min，60% B ～40% B；5 ～15 min，40% B ～20% B；15 ～20 min，20% B ～60% B；20 ～30 min，60% B。進樣體積：10 μL，紫外檢測波長：228 nm；參比波長：360 nm；狹縫寬度：4 nm。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

在奶粉等乳制品中，蛋白質(zhì)和氨基酸是其中的主要成分，要想獲得較好的分析結果，需要將奶粉中的蛋白質(zhì)和脂肪除去。常用的去除蛋白質(zhì)和脂肪的方法是在酸性條件下加入有機溶劑使得蛋白質(zhì)和脂肪變性，但是大量的有機溶劑會造成嚴重的污染。本實驗選擇用NaCl 在酸性條件下沉淀蛋白質(zhì)和脂肪。樣品溶液中加入NaCl 后，蛋白質(zhì)與水之間的親水性膠體被破壞，蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集和沉降。一般情況下，pH 低于蛋白質(zhì)等電點時，蛋白質(zhì)也會發(fā)生聚集和沉降。大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點在4.0 ～6.0 之間，所以選擇酸性條件下加入無機鹽，通過沉淀的方法除去蛋白質(zhì)和脂肪。

2.1.1 NaCl 用量的影響

在萃取劑的用量和分散劑的用量均為80 μL 的條件下，考察了NaCl 的加入量（0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g）的影響。經(jīng)過比較待測組分的回收率發(fā)現(xiàn)，當NaCl 的加入量為0.20 g 時，沉淀效果最好，萃取回收率最高（見圖1）。這主要是因為當NaCl 的加入量較小時，濃度較低，鹽析效應起主導作用，目標分析物的溶解度降低使其更易從水相轉移到萃取相中；隨著NaCl 量的增加，萃取率逐漸升高，但當NaCl 加入量太大時，水溶液的密度高于離子液體的密度，從而降低了離子液體相的回收率；另一方面萃取劑［HMIM］［PF6］中的陰離子［PF6］-易與溶液中的Cl-發(fā)生離子交換，導致水溶性離子液體［HMIM］Cl 的產(chǎn)生，也會降低離子液體的萃取率。故選擇NaCl 的加入量為0.20 g。

圖1 NaCl 用量對三嗪除草劑回收率的影響Fig.1 Effect of NaCl amount on the recoveries of the triazine herbicides

2.1.2 樣品溶液pH 值的影響

pH 值是影響萃取回收率的主要因素。一方面樣品溶液的前處理效果受pH 值影響，在酸性條件下，蛋白質(zhì)更易沉淀，有利于目標分析物的分散萃取；另一方面，三嗪除草劑屬于弱堿性物質(zhì)，調(diào)節(jié)pH值使其酸化后更有利于三嗪除草劑的萃取。但由于蛋白質(zhì)的等電點在4 ～6 之間，強酸、強堿條件下不利于萃取，影響富集效果。實驗考察了pH 值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 時對三嗪除草劑回收率的影響。結果表明，隨著pH 增加，萃取回收率逐漸增加，當pH 值為6.0 時達到最大，隨后趨于平穩(wěn)。因此所有實驗都在pH 為6 的條件下進行。

2.2 萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 萃取劑的選擇

離子液體咪唑陽離子1 位上不同烷基取代與離子液體陰離子種類均影響萃取三嗪除草劑的能力。本實驗考察了5 種咪唑類離子液體［BMIM］［BF4］、［HMIM］［BF4］、［BMIM］［PF6］、［HMIM］［PF6］和［OMIM］［PF6］對回收率的影響（見圖2）。當陰離子相同時，離子液體在水中的溶解性隨著陽離子烷基鏈的增長而降低，其非極性特征明顯增加，從而對非極性物質(zhì)的溶解性增強。通過實驗發(fā)現(xiàn)，親水性和疏水性離子液體均具有萃取能力，但是疏水性離子液體的萃取回收率明顯高于親水性離子液體。這是因為疏水性離子液體更易于和水相分離，［OMIM］［PF6］作為萃取劑時在色譜圖上出現(xiàn)干擾峰。綜合考慮，選擇［HMIM］［PF6］作為本實驗的萃取劑。

圖2 萃取溶劑的類型對三嗪除草劑回收率的影響Fig.2 Effect of type of extraction solvents on the recoveries of the triazine herbicides

實驗還考察了萃取劑的用量。當加入80 μL 離子液體時，萃取回收率達到最大值并趨于穩(wěn)定。

2.2.2 分散劑的選擇

圖3 分散劑的類型對三嗪除草劑回收率的影響Fig.3 Effect of type of dispersion solvents on the recoveries of the triazine herbicides

分散劑的類型是影響萃取效率的又一重要因素。所選分散劑應能與萃取劑及水有良好的混溶性，而在分相時又能形成兩相，并且對目標化合物的測定不產(chǎn)生干擾。本實驗選擇兩種親水性離子液體［BMIM］［BF4］、［HMIM］［BF4］和3 種常用的有機溶劑甲醇、乙醇、乙腈進行考察。從圖3 可見，甲醇和乙醇作為分散劑時萃取回收率都比較低，并且實驗結果不穩(wěn)定，在實驗過程中發(fā)現(xiàn)用甲醇作分散劑時溶液出現(xiàn)明顯的乳化現(xiàn)象，萃取相不易分離出來；乙醇和甲醇類似；用乙腈、［BMIM］［BF4］和［HMIM］［BF4］回收率結果都比較滿意，但乙腈毒性高于其余二者；親水性離子液體與水和萃取劑（疏水性離子液體）都有較好的溶解能力，能夠增大各相之間的接觸面積，有利于萃取分離。用［BMIM］［BF4］獲得的分析物回收率略高于用乙腈和［HMIM］［BF4］?；谏鲜隼碛桑x擇［BMIM］［BF4］作為分散劑，用量為80 μL。

2.2.3 超聲萃取時間的選擇

實驗考察了萃取時間分別為4、5、6、7 和8 min對回收率的影響。結果發(fā)現(xiàn)，萃取時間為5 min 時萃取回收率達到較大值，再增加萃取時間4 種除草劑的回收率有所下降。這可能是因為選擇兩種陽離子相同的離子液體作為萃取劑和分散劑使得萃取劑和水溶液的接觸面積增大，而超聲可促進萃取相與水相的接觸和混合，加速不互溶兩相之間的質(zhì)量傳遞，使得萃取效率在最小的萃取劑使用量和最短的時間內(nèi)得到快速的提高，在此情況下，三嗪除草劑可以在兩相間迅速轉移。超聲時間過長會產(chǎn)生熱量，可能增加溶液的揮發(fā)度而影響萃取效果。如圖4 所示，選擇5 min 為最佳萃取時間。

圖4 萃取時間對三嗪除草劑回收率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the recoveries of the triazine herbicides

2.2.4 萃取溫度的選擇

萃取溫度對萃取過程有著顯著的影響?？疾炝嗽诠β使潭?0 W 時，不同溫度（25 ～45 ℃）下萃取回收率的變化情況。結果表明，隨著溫度從25 ℃升到40 ℃，回收率逐漸增加，之后回收率緩慢下降。這是因為隨著溫度升高，溶液中粒子間的相互運動更劇烈，移動的速度更快，溫度到達一定值時萃取達到平衡，回收率穩(wěn)定；繼續(xù)升高溫度，萃取能力不再繼續(xù)增加。因此選擇40 ℃為最佳萃取溫度。

2.3 方法的評價

2.3.1 線性關系

在最佳的實驗條件下，從加標奶粉樣品中萃取5 種三嗪除草劑并進行HPLC 測定，通過峰面積（A）與加標樣品中三嗪除草劑的含量（C，μg／kg）制作工作曲線，結果見表1。通過工作曲線計算方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。LOD 和LOQ 均由下式計算：LOD ＝3σ／k，LOQ ＝10σ／k，其中σ 是將11 個空白樣品直接進樣進行HPLC 分析得到的信號的標準偏差，k 是工作曲線的斜率。

表1 5 種三嗪除草劑的線性方程、相關系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 1 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges，limits of detection （LODs）and limits of quantification （LOQs）of the five triazine herbicides

2.3.2 回收率和精密度

為了評價方法的準確性和精密性，制備3 個加標水平（10.00、50.00 和100.00 μg／kg）的加標樣品，日內(nèi)精密度通過1 天之內(nèi)平行分析3 次加標樣品所得到回收率的RSD 表示。日間精密度通過每天分析1次加標樣品，連續(xù)分析3 天所得回收率的RSD 表示。由表2 可見5 種三嗪類除草劑的回收率為92.2% ～103.2% ，日內(nèi)及日間RSD 均低于6%。

表2 嬰兒奶粉中5 種待測物在3 個加標水平的回收率和精密度Table 2 Recoveries and RSDs of the five analytes spiked in infant milk powders at three levels

2.4 樣品分析

在最佳條件下對4 種奶粉樣品進行了分析，樣品中均未檢出待測物。標準溶液、空白樣品和加標樣品的色譜圖見圖5。

圖5 （a）標準溶液、（b）空白樣品和（c）加標樣品的色譜圖Fig.5 Chromatograms of （a）a mixed standard solution，（b）a blank milk powder sample and （c）a spiked sample

3 結論

基于離子液體的超聲輔助均相液液微萃取成功應用于萃取分離嬰兒奶粉中5 種三嗪除草劑，對影響實驗結果的條件進行了考察，獲得了最佳萃取條件?；陔x子液體的超聲輔助均相液液微萃取方法操作簡便，利用離子液體取代傳統(tǒng)萃取劑，使得樣品前處理過程更加環(huán)保并減少了有機試劑的用量。所建立的離子液體均相液液微萃取-高效液相色譜方法靈敏度高、操作簡單，適用于奶粉樣品中三嗪類除草劑殘留的檢測。

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