液相色譜法分析煙葉酸性洗滌纖維素的堿性氧化銅降解產(chǎn)物

郝衛(wèi)強(qiáng) ， 王磊君， 吳 順， 岳邦毅， 陳 強(qiáng)， 張培培

（1. 上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，煙草行業(yè)卷煙煙氣重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200082；2. 常州南京大學(xué)高新技術(shù)研究院，江蘇 常州213164）

木質(zhì)素以及纖維素、半纖維素、果膠等是構(gòu)成煙葉細(xì)胞壁物質(zhì)的主要成分［1，2］。由于這些細(xì)胞壁物質(zhì)與煙葉的吸味品質(zhì)密不可分，因此準(zhǔn)確掌握和了解煙葉中木質(zhì)素的組成及其含量，可為煙葉的生產(chǎn)、加工以及質(zhì)量評(píng)價(jià)等提供參考。木質(zhì)素是由苯丙烷類化合物組成的一種天然高分子聚合物。通常認(rèn)為它的形成起始于3 種木質(zhì)醇：對(duì)-香豆醇、松柏醇和芥子醇（分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1）。這些木質(zhì)醇可進(jìn)一步脫氫聚合形成對(duì)羥基苯基結(jié)構(gòu)單元、愈創(chuàng)木基丙烷結(jié)構(gòu)單元以及紫丁香基丙烷結(jié)構(gòu)單元［3，4］。木質(zhì)素結(jié)構(gòu)具有復(fù)雜和多樣的特點(diǎn)。另外，木質(zhì)素不溶于水、稀酸或稀堿，分子結(jié)構(gòu)中含有抑制酶解或者化學(xué)水解的碳-碳鍵和聯(lián)苯醚鍵，因此對(duì)其進(jìn)行化學(xué)分析存在一定的難度［5］。

圖1 對(duì)-香豆醇、松柏醇和芥子醇的分子結(jié)構(gòu)式［4］Fig.1 Molecular structures of p-coumaryl alcohol，coniferyl alcohol and sinapyl alcohol［4］

目前重量法在木質(zhì)素檢測(cè)中的應(yīng)用最為廣泛，其代表方法是Klason 法和Van Soest 法［6-8］。Klason 法是將樣品依次用72% 和3% 硫酸進(jìn)行處理，剩余殘?jiān)礊镵lason 木質(zhì)素（Klason lignin，KL）。Van Soest 法是將樣品依次用中性洗滌劑、酸性洗滌劑以及72% 硫酸進(jìn)行處理，分別得到中性洗滌纖維素（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗滌纖維素（acid detergent fiber，ADF）以及酸性洗滌木質(zhì)素（acid detergent lignin，ADL）。需要指出，部分木質(zhì)素會(huì)溶解于濃酸之中，因此濃酸處理的方法往往僅適用于硬木木質(zhì)素，而不適用于含量較低的軟木木質(zhì)素和草本木質(zhì)素［5，9］。另外，一些不易降解的內(nèi)源性物質(zhì)，如角質(zhì)、聚合鞣酸以及與木質(zhì)素以共價(jià)鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)、纖維素、淀粉等，又會(huì)使重量法的測(cè)定結(jié)果偏高［9］。當(dāng)樣品中木質(zhì)素的含量不高時(shí)，這種因內(nèi)源性物質(zhì)或者實(shí)驗(yàn)操作引入的誤差往往就會(huì)更為顯著。另有研究［6］報(bào)道，即使對(duì)于同一樣品，用Klason 法和Van Soest 法測(cè)得的木質(zhì)素含量也存在顯著差異，其中KL 量要高于ADL 量。這一結(jié)果意味著需要建立一種更為可靠的方法以準(zhǔn)確測(cè)定樣品中木質(zhì)素的含量。

與重量法相比，色譜法的優(yōu)點(diǎn)是具有良好的分離選擇性。目前氣相色譜（GC）和液相色譜（LC）均已應(yīng)用于木質(zhì)素降解產(chǎn)物的研究中［10-12］。堿性氧化銅降解法是研究復(fù)雜樣品，如土壤、湖泊沉積物、植物、腐殖質(zhì)等中木質(zhì)素組成的一種常用方法［13-17］。通過(guò)該方法，大分子的木質(zhì)素被氧化降解成低相對(duì)分子質(zhì)量的酚類化合物，然后再通過(guò)GC 或LC 對(duì)這些降解產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，可獲得木質(zhì)素結(jié)構(gòu)組成的相關(guān)信息，如香草基（V）、丁香基（S）、肉桂基（C）等單體化合物之間的比例關(guān)系［11，16］。有研究［17］表明，應(yīng)用GC 法和LC 法測(cè)得的結(jié)果之間具有良好的可比性。在GC 法中，得到的木質(zhì)素降解產(chǎn)物需要通過(guò)硅烷衍生化反應(yīng)以增強(qiáng)其揮發(fā)性。而LC 法則可避免該操作，從而有助于簡(jiǎn)化操作的步驟，并克服衍生化不完全等缺點(diǎn)。另外，由于木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)，通過(guò)將LC 的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)在254 nm 甚至更高，還可有效避免纖維素、半纖維素等內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，因此在木質(zhì)素的檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。需要指出，不同植物之間的木質(zhì)素組成往往存在很大差異［4］，而目前基于LC 法對(duì)煙葉木質(zhì)素展開(kāi)研究的報(bào)道還很少。本文以煙葉ADF 為研究對(duì)象，對(duì)其堿性氧化銅降解產(chǎn)物的LC 分離條件進(jìn)行了探討。通過(guò)尋找特征的降解產(chǎn)物色譜峰，為研究不同煙葉樣品木質(zhì)素組成的差異，以及其與煙葉吸味品質(zhì)的關(guān)系提供了一種新的分析手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及材料

日本島津公司的Prominence 液相色譜系統(tǒng)，包括2 個(gè)LC-20AT 輸液泵、1 個(gè)SIL-20A 自動(dòng)進(jìn)樣器、1 個(gè)SPD-20A 紫外檢測(cè)器、1 個(gè)CTO-20AC 柱溫箱以及LabSolutions 色譜工作站等；烘箱（DZF-6020，上?；厶﹥x器制造有限公司）；聚四氟反應(yīng)罐（KH-50，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；分析天平（BS124S，感量0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；離心機(jī)（XYJ-A，金壇市杰瑞爾電器有限公司）；pH 計(jì)（PHS-3E，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；超聲儀（KX-1990QT，北京科璽世紀(jì)科技有限公司）。

石油醚（沸程60 ～90 ℃）、乙二醇乙醚、葡萄糖、甲醇（分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司）；98% 濃硫酸（分析純，江蘇永豐化學(xué)試劑廠）；乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，上海試四赫維化工有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（分析純，上海申博化工有限公司）；十水合四硼酸鈉、磷酸氫二鈉（分析純，宜興第二化學(xué)試劑廠）；十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨（分析純，上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司）；氧化銅粉（分析純，上海龍昕科技發(fā)展有限公司）；二氯甲烷、六水合硫酸亞鐵銨（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，Adamas 公司）；芥子酸（純度98%）、咖啡酸（純度≥98%）、對(duì)羥基肉桂酸（純度≥98%）（上海泰坦科技股份有限公司）；阿魏酸（純度≥98%，上海詩(shī)丹得生物技術(shù)有限公司）；試驗(yàn)用水為超純水。

樣品：6 種煙葉樣品（編號(hào)為03＃、04＃、06＃、10＃、12＃、22＃）由上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司提供。樣品在使用前均經(jīng)風(fēng)干、磨碎、過(guò)40 目篩。

1.2 試劑的配制

1.2.1 中性洗滌劑的配制［7，18］

將18.6 g 乙二胺四乙酸二鈉和6.8 g 十水合四硼酸鈉置于燒杯中，加水約100 mL，加熱使之溶解；將30 g 十二烷基硫酸鈉和10 mL 乙二醇乙醚溶于約650 mL 熱水中；合并上述兩種溶液；再將4.56 g磷酸氫二鈉溶于150 mL 熱水中，并入上述溶液中，用磷酸調(diào)節(jié)上述混合液至pH 6.9 ～7.1，轉(zhuǎn)移至1 000 mL 容量瓶中，加水定容至刻度。

1.2.2 酸性洗滌劑的配制［7］

用50 mL 量筒量取約27.2 mL 98% 濃硫酸，緩慢加入已裝有500 mL 蒸餾水的燒杯中，冷卻后轉(zhuǎn)移至1 000 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，配制成0.5 mol／L 硫酸溶液。另稱取約20 g 十六烷基三甲基溴化銨于1 000 mL 燒杯中，加入配制好的0.5 mol／L 硫酸溶液，攪拌溶解，轉(zhuǎn)移至1 000 mL 容量瓶中，加水定容至刻度。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酸性洗滌纖維素的制備

酸性洗滌纖維素的制備參考文獻(xiàn)［7］。取煙葉粉末5 g 置于250 mL 圓底燒瓶中，加入60 mL 石油醚和40 mL 乙醇，維持微沸狀態(tài)4 h，冷卻至室溫后過(guò)濾，用乙醇沖洗至濾出液無(wú)色。再將濾渣轉(zhuǎn)移至250 mL 圓底燒瓶中，加入100 mL 中性洗滌劑，維持微沸狀態(tài)1 h，冷卻至室溫后以1 000 g 離心10 min，棄去上清液，殘?jiān)?0 ～100 ℃水反復(fù)清洗至上清液無(wú)泡沫。然后將殘?jiān)D(zhuǎn)移至250 mL 圓底燒瓶中，加入100 mL 酸性洗滌劑，維持微沸狀態(tài)1 h，過(guò)濾，冷卻至室溫后以1 000 g 離心10 min，棄去上清液，殘?jiān)?0 ～100 ℃水反復(fù)清洗至上清液無(wú)泡沫且pH 中性，干燥，得到ADF。

1.3.2 酸性洗滌木質(zhì)素的制備

將1.3.1 節(jié)中制備得到的ADF 加入25 mL 72% 硫酸中，攪拌3 h 后過(guò)濾，依次用水和乙醇充分洗滌濾渣，干燥，得到ADL［7］。

1.3.3 堿性氧化銅降解［11，16］

取0.1 g ADF 或ADL、0.5 g 經(jīng)二氯甲烷萃取過(guò)的氧化銅粉末、0.1 g 六水合硫酸亞鐵銨和0.05 g葡萄糖于聚四氟反應(yīng)罐內(nèi)，加入15 mL 2 mol／L 氫氧化鈉溶液，旋緊上蓋后置于烘箱中，于200 ℃加熱5 h，冷卻至室溫后加入5 mL 甲醇，混勻，轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，再用4 mL 20% （v／v）甲醇洗滌聚四氟反應(yīng)罐，并入離心管中，超聲15 min，于1 000 g離心15 min，移取上清液。用4 mL 20% （v／v）甲醇清洗沉淀2 次，離心，合并上清液，用6 mol／L H3PO4酸化至pH 1.8 ～2.2，靜置1 h，于1 000 g 離心10 min，移取上清液至50 mL 容量瓶中。用5 mL 20% （v／v）甲醇洗滌沉淀，洗滌液并入容量瓶中。再用20% （v／v）甲醇定容至刻度，混勻，過(guò)0.45 μm 濾膜，濾液供LC 測(cè)定。

1.3.4 LC 條件

色譜柱：Ultimate XB C18 色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，月旭材料科技（上海）有限公司）；流動(dòng)相：甲醇（A）和水（B），梯度洗脫程序：0 ～5 min，10% A；5 ～25 min，10% A ～35% A；25 ～35 min，35% A ～90% A；35 ～45 min，90% A；45 ～57 min，10% A。柱溫：35 ℃；流速：0.8 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm 和320 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙葉木質(zhì)素樣品的制備

本文采用Van Soest 法制備煙葉的木質(zhì)素樣品。在用中性洗滌劑處理樣品之前，首先用石油醚／乙醇（60 ∶40，v／v）溶液提取以除去樣品中的色素及其他脂溶性成分。在Van Soest 法中，中性洗滌劑用于除去糖、淀粉、蛋白質(zhì)、果膠等可溶性物質(zhì)，酸性洗滌劑用于除去半纖維素等物質(zhì)，而72% 硫酸則用于除去樣品中的纖維素等物質(zhì)［7，18］。應(yīng)用該方法制得的22＃煙葉樣品ADF 和ADL 的平均得率分別為10.0%（RSD＝6.14%，n ＝7）和1.59% （RSD ＝14.1%，n ＝7），該結(jié)果與文獻(xiàn)［7，8］報(bào)道基本一致。另外，由于煙葉ADL 的得率偏低，實(shí)驗(yàn)操作誤差對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響較之ADF 更為顯著（即RSD 偏高）。

由圖2 所示的LC 結(jié)果可以看到，由ADF 和ADL 得到的堿性氧化銅降解產(chǎn)物的色譜圖較為類似，均包含所標(biāo)注的A、B、C、D 4 個(gè)峰。由于ADF主要由纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成，而ADL 主要由木質(zhì)素構(gòu)成，因此A、B、C、D 4 個(gè)峰可看作是煙葉木質(zhì)素的特征降解產(chǎn)物峰。另外，圖2 中ADF 和ADL 的取樣量均為100 mg，而兩者譜圖中A、B 兩個(gè)色譜峰的峰高并沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。結(jié)合ADL 的得率約為ADF 的1／6 這個(gè)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，部分木質(zhì)素在72% 硫酸處理的過(guò)程中發(fā)生了溶解，類似的結(jié)果在文獻(xiàn)［9］中也有報(bào)道。因此，對(duì)于煙葉等草本樣品，由于木質(zhì)素的含量本身就低，在樣品處理過(guò)程中應(yīng)盡可能地避免濃酸消化的步驟，從而降低其對(duì)木質(zhì)素檢測(cè)的影響。在本文后面的研究中，我們選擇ADF 作為煙葉木質(zhì)素研究的對(duì)象。

圖2 不同檢測(cè)波長(zhǎng)下22＃煙葉的ADF 和ADL 堿性氧化銅降解產(chǎn)物的LC 譜圖Fig.2 Chromatograms of alkaline CuO degradation products of acid detergent fiber （ADF）and acid detergent lignin （ADL）from 22＃ tobacco leaves

2.2 液相色譜條件的建立

本文應(yīng)用反相液相色譜對(duì)煙葉ADF 的堿性氧化銅降解產(chǎn)物進(jìn)行了分離。由于纖維素等多糖類物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)中不含有苯環(huán)，因此可將紫外檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)在254 nm 甚至更高，從而避免這些內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)木質(zhì)素測(cè)定的影響。實(shí)驗(yàn)考察了降解產(chǎn)物在檢測(cè)波長(zhǎng)分別為254、280 以及320 nm 時(shí)的出峰情況，典型譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 （a）10＃煙葉的ADF 堿性氧化銅降解產(chǎn)物以及（b）咖啡酸、對(duì)羥基肉桂酸、阿魏酸、芥子酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同波長(zhǎng)下的色譜圖Fig.3 Chromatograms of （a）alkaline CuO degradation products of ADF from 10＃ tobacco leaves and （b）the mixed standard solution of caffeic acid，pcoumaric acid， ferulic acid and sinapic acid under different detection wavelengths

從圖3a 可以看到，標(biāo)號(hào)為A、B、C、D 的4 個(gè)峰在280 nm 和320 nm 時(shí)的響應(yīng)值均高于254 nm 時(shí)的響應(yīng)值。在圖3b 中，對(duì)羥基肉桂酸、阿魏酸、芥子酸分別對(duì)應(yīng)于圖1 中對(duì)-香豆醇、松柏醇、芥子醇的羥甲基氧化產(chǎn)物，是研究木質(zhì)素結(jié)構(gòu)組成的重要特征化合物［11，19］。另外，A、B、C、D 4 個(gè)峰與咖啡酸、對(duì)羥基肉桂酸、阿魏酸、芥子酸的紫外響應(yīng)非常類似（在280 nm 和320 nm 均有明顯吸收），這說(shuō)明這些色譜峰與煙葉木質(zhì)素之間存在密切的聯(lián)系。同時(shí)，這4 個(gè)色譜峰的保留時(shí)間均遠(yuǎn)大于芥子酸等單體化合物的保留時(shí)間，色譜峰形也更為對(duì)稱，說(shuō)明這些色譜峰所對(duì)應(yīng)的化合物的分子結(jié)構(gòu)中含有更多的疏水單元，因此可能具有更大的分子結(jié)構(gòu)。在以往關(guān)于木質(zhì)素的研究中，van der Hage 等［20］建立了一種可用于木質(zhì)素分析的在線高溫裂解（curie-point pyrolysis）LC-MS 方法。該工作的研究結(jié)果表明，裂解得到的木質(zhì)素降解產(chǎn)物中含有多種木質(zhì)素單體的低聚物。類似的低聚物可能也存在于木質(zhì)素的堿性氧化銅降解產(chǎn)物中，盡管這一結(jié)果還尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。另外，圖3b 中在35 ～38 min 區(qū)間內(nèi)出現(xiàn)了一組在280 nm 和320 nm 均有明顯吸收的色譜峰。這些色譜峰可能也對(duì)應(yīng)于疏水性更強(qiáng)、相對(duì)分子質(zhì)量更大的木質(zhì)素降解產(chǎn)物。對(duì)于這些色譜峰所對(duì)應(yīng)的化合物結(jié)構(gòu)可通過(guò)MS、NMR 等技術(shù)進(jìn)行解析，本文作者也正在開(kāi)展相關(guān)的研究工作。

在本文建立的LC 體系中，以320 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)還可避免蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)木質(zhì)素測(cè)定的干擾，而前者的最大吸收波長(zhǎng)在280 nm 附近。在320 nm 波長(zhǎng)下，A、B、C、D 4 個(gè)峰均與其他色譜峰有著良好的分離度。這些色譜峰在所測(cè)試的所有煙葉樣品中均有出現(xiàn)（編號(hào)03＃、04＃、06＃和12＃的煙葉樣品色譜圖見(jiàn)圖4），因此A、B、C、D 4 個(gè)峰可作為煙葉木質(zhì)素降解產(chǎn)物研究的特征色譜峰。通過(guò)比較煙葉樣品中這些色譜峰的差異，將有助于了解不同煙葉樣品之間的差異，進(jìn)而為研究這些差異與煙葉吸味品質(zhì)的關(guān)系提供參考。

圖4 （a）03＃、（b）04＃、（c）06＃和（d）12＃煙葉樣品的ADF 堿性氧化銅降解產(chǎn)物的色譜圖Fig.4 Chromatograms of alkaline CuO degradation products of ADF obtained from（a）03＃，（b）04＃，（c）06＃ and （d）12＃ tobacco leaf samples

2.3 堿性氧化銅氧化降解時(shí)間及溶液穩(wěn)定性的考察

實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用LC 方法，對(duì)煙葉ADF 堿性氧化銅氧化降解的最佳時(shí)間進(jìn)行了考察。以22＃煙葉ADF樣品為研究對(duì)象，2.2 節(jié)中確定的4 個(gè)特征色譜峰的峰面積隨降解時(shí)間的變化情況見(jiàn)圖5。從圖5 中可以看到，隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，4 個(gè)特征峰的峰面積也隨之增加，并在4 ～5 h 趨于平衡。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)降解時(shí)間少于4 h 時(shí)，反應(yīng)罐中會(huì)存在較多的固體殘?jiān)?，這一現(xiàn)象與LC 結(jié)果一致。本文最終選擇5 h 作為煙葉ADF 堿性氧化銅氧化降解的最佳時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)還對(duì)氧化降解得到的樣品溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。表1 比較了由06＃和12＃煙葉ADF 制得的樣品溶液在第1 天和第7 天的峰面積。從表1 數(shù)據(jù)可見(jiàn)樣品溶液在7 天內(nèi)保持穩(wěn)定。

圖5 22＃煙葉ADF 堿性氧化銅降解產(chǎn)物特征色譜峰的峰面積隨降解時(shí)間的變化（n＝3）Fig.5 Variation of the peak areas of characteristic peaks of alkaline CuO degradation products of ADF from 22＃ tobacco leaves with degradation time （n＝3）

表1 不同時(shí)間測(cè)得的06＃和12＃煙葉ADF 降解產(chǎn)物特征色譜峰的峰面積Table 1 Peak areas of characteristic peaks of the degradation products of ADF from 06＃ and 12＃tobacco leaves at different times

3 結(jié)論

應(yīng)用Van Soest 法制備得到煙葉酸性洗滌纖維素，并作為煙葉木質(zhì)素研究所關(guān)注的對(duì)象。建立了酸性洗滌纖維素堿性氧化銅氧化降解產(chǎn)物的LC 分析方法。在LC 分析中分離得到4 個(gè)可看作是煙葉木質(zhì)素的特征降解產(chǎn)物峰。以這4 個(gè)特征色譜峰為考察對(duì)象，可研究不同煙葉木質(zhì)素組成的差異及其與煙葉吸味品質(zhì)的關(guān)系。

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