固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水稻中17 種細胞分裂素

曹趙云， 馬有寧， 牟仁祥， 于莎莎， 陳銘學*

（1. 中國水稻研究所，農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，浙江 杭州311400；2. 浙江大學農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，浙江 杭州310029；3. 農(nóng)業(yè)部稻米產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室，浙江 杭州311400）

植物中天然的細胞分裂素（cytokinins，CKs）是一類具有腺嘌呤環(huán)結(jié)構(gòu)的植物激素，對細胞生長、分化和器官形成等具有重要的調(diào)控作用［1，2］。水稻是我國的主要糧食作物，近年來有關(guān)水稻中CKs 與抗逆性、產(chǎn)量及稻米品質(zhì)等關(guān)系的研究備受關(guān)注，并取得了一些重要研究成果［3，4］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的CKs 有40 余種［5］，但其在水稻體內(nèi)的生理功能、生物代謝及分子調(diào)控機理等尚未完全闡明［6，7］。在我國，由于痕量植物激素分析技術(shù)的相對滯后，對CKs 間的轉(zhuǎn)化關(guān)系了解甚少［8］，嚴重阻礙了相關(guān)研究的進展。而建立水稻中多種CKs 的定性、定量分析方法，將為此提供重要的技術(shù)手段。

由于植株體內(nèi)CKs 含量極低，通常不超過30 pmol／g（以鮮樣重計）［9］，且植物基質(zhì)異常復雜，要實現(xiàn)對其準確定量，選擇有效的樣品純化方法及靈敏度高、選擇性強的檢測手段則至為關(guān)鍵。目前針對CKs 的純化方法主要有液液萃取［10，11］、分散固相萃?。?2］、固相萃?。?3］等。其中，液液萃取和分散固相萃取法雖條件溫和、過程簡單，但實驗表明其僅適合于極少數(shù)CKs 的純化。反相C18 柱［14］、親水親油平衡（HLB）柱［15］、混合型陰離子交換反相柱（Oasis MAX）［16］以及多種填料聯(lián)用［17］等固相萃取技術(shù)盡管使用最為廣泛。但反相填料除雜能力有限，當樣品中富含非極性雜質(zhì)時，常產(chǎn)生較強的背景干擾或基質(zhì)效應［13］；而陰離子交換柱對堿性較強的CKs 吸附能力較差，導致目標物損失嚴重；聯(lián)用技術(shù)雖克服了上述不足，但使用過程中涉及若干淋洗、洗脫等步驟，方法的重現(xiàn)性差。近年來，一些特殊萃取技術(shù)，如Fe3O4納米粒子吸附劑［2］、共聚物固相微萃?。?8］和分子印跡富集柱［19］等純化材料也有應用，但受商品化等因素限制，目前還難以推廣使用。

針對CKs 的弱極性和弱堿性的特點［13］，本文采用混合型磺酸陽離子交換樹脂（PCX），在酸性條件下，使帶正電荷的目標化合物在離子交換和反相吸附的雙重作用下被富集和純化，再結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS／MS）的高靈敏度、高選擇性檢測，實現(xiàn)了水稻中17 種CKs 的同時定性、定量分析。方法操作簡單，純化效果好，分析結(jié)果準確、可靠。

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

Survryor 系列液相色譜儀、TSQ Quantum Access Max 三重四極桿質(zhì)譜儀附電噴霧離子源、臺式冷凍離心機Biofuge Primo R（美國Thermo Fisher 公司）。

1.2 試劑與材料

乙腈、甲醇（色譜純，德國Merck 公司）；甲酸（色譜純）、二甲基亞砜（DMSO，色譜純）、甲酸銨（分析純）、氨水（28% ～30%）和氫氧化鈉均購自美國Sigma-Aldrich 公司；Bond Elut Plexa PCX（60 mg×3 mL，美國Agilent Technologies 公司）；實驗用水為Milli-Q 超純水。

17 種CKs 標準品：異戊烯基腺嘌呤（iP）、異戊烯基腺嘌呤核苷（iPR）、7-β-葡糖基-N6-（異戊二烯基）腺嘌呤（iP7G）、9-β-葡糖基-N6-（異戊二烯基）腺嘌呤（iP9G）、反式-玉米素（tZ）、反式-玉米素核苷（tZR）、反式-7-β-葡糖基玉米素（tZ7G）、反式-9-β-葡糖基玉米素（tZ9G）、反式-O-β-葡糖基玉米素（tZOG）、反 式-O-β-葡 糖 基-9-核 糖 基 玉 米 素（tZROG）、順式-玉米素（cZ）、順式-玉米素核苷（cZR）、二氫玉米素（DZ）、7-β-葡糖基二氫玉米素（DZ7G）、9-β-葡糖基二氫玉米素（DZ9G）、O-β-葡糖基二氫玉米素（DZOG）和O-β-葡糖基-9-核糖基二氫玉米素（DZROG）均購自捷克Olchemim 公司，純度均≥95%。

1.3 標準溶液的配制

準確稱取上述CKs 標準品，配成200 μg／mL 的單標準儲備液。依據(jù)各自溶解性，其中iP、tZ 用甲醇配制，cZ、cZR、DZ7G、DZ9G 和tZROG 用80%（體積比，下同）乙醇配制，tZOG、DZOG 和DZROG用60% 甲醇配制，iP7G、tZ7G 和iP9G 用DMSO 配制，tZ9G、DZ、iPR 和tZR 先用少量0.1 mol／L 的氫氧化鈉溶解，再用甲醇定容。用甲醇將儲備液稀釋為1 μg／mL 的單標準溶液，用于質(zhì)譜條件優(yōu)化；各取0.5 mL 單標準儲備液，用甲醇定容至100 mL，配成1 μg／mL 的17 種CKs 混合標準溶液。各標準溶液均置于-40 ℃。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

取新鮮的水稻植株，按根、莖和葉等部位分割，剪碎，于研缽中加液氮磨細。分別稱取0.2 g（精確至0.001 g）樣品于10 mL 塑料離心管中，加入2 mL預冷（4 ℃）的80% 甲醇溶液，在4 ℃下浸提16 h，其間振搖2 ～3 次。取出后于4 ℃在8 000 r／min 的轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集上清液。殘渣中加入2 mL 80% 甲醇，漩渦振蕩，于4 ℃在8 000 r／min 的轉(zhuǎn)速下離心10 min，將兩次提取液合并，加入50 μL 甲酸，混勻，獲得樣品粗提液。

1.4.2 純化

PCX 固相萃取柱用2 mL 甲醇活化，再用2 mL 1% 甲酸平衡，將樣品粗提液全部過PCX 固相萃取柱。依次用2 mL 0.1% 甲酸和2 mL 甲醇淋洗萃取柱。用2 mL 0.5% 氨水-甲醇溶液洗脫，重復一次。2 次洗脫液均收集于10 mL 試管中，于35 ℃氮吹至體積約為0.1 mL，加水稀釋至0.5 mL，混勻，過0.22 μm 濾膜后待測。

1.5 LC-MS／MS 條件

分析柱：ZORBAX Extend-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。流動相A：5 mmol／L 甲酸銨溶液；流動相B：甲醇；流速：150 μL／min；梯度洗脫程序：0 ～30 min，10% B ～45% B；30 ～35 min，45% B ～95% B；35 ～35.1 min，95%B ～10% B；35.1 ～55 min，10% B。

電噴霧電離正離子模式（ESI＋）；噴霧電壓：3 kV；離子源溫度：350 ℃；鞘氣壓力：241 kPa；輔助氣流量：1.5 mL／min；碰撞氣（Ar）壓力：0.2 Pa；離子傳輸管溫度：300 ℃。采用選擇反應監(jiān)測（SRM）模式掃描；其他參數(shù)見表1。

表1 17 種細胞分裂素的選擇反應監(jiān)測參數(shù)Table 1 Parameters for selected reaction monitoring （SRM）of the 17 cytokinins

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法優(yōu)化

目前對多種CKs 同時提取的方法主要有異丙醇-水-濃鹽酸（2 ∶1 ∶4，v／v／v）結(jié)合二氯甲烷萃取法［11］、甲醇-水（80 ∶20，v／v）溶液提取法［14］以及甲醇-甲酸-水（15 ∶1 ∶4，v／v／v）浸提法［16］等。本文通過基質(zhì)加標方法考察了上述3 種提取溶劑對水稻葉片中17 種CKs 的提取效率。其中異丙醇-水-濃鹽酸結(jié)合二氯甲烷萃取法按Pan 等［11］的方法進行，甲醇-水溶液提取法按1.4.1 節(jié)提取步驟操作，甲醇-甲酸-水浸提法參照Wang 等［16］的方法進行。分別向0.2 g 樣品中加入20 μL 混合標準溶液（1 μg／mL），采用以上3 種方法進行提取，各組提取液均采用基質(zhì)匹配校準法測定。結(jié)果表明：甲醇-水溶液對17 種目標化合物的提取效率最高，為80.1% ～101.7%；甲醇-甲酸-水溶液略低，為78.4% ～95.8%；而異丙醇-水-濃鹽酸結(jié)合二氯甲烷對大多目標化合物的提取效率均不到30%，tZR、tZ7G、tZ9G、tZROG、DZ7G、DZ9G 和DZOG 這7 種CKs 未能被檢測到。其原因可能是在強酸介質(zhì)中，堿性激素呈離子狀態(tài)（帶正電荷）而未被分配到弱極性的二氯甲烷層。同樣地，通過對水稻根、莖的提取試驗，也得到與上述類似的研究結(jié)果，因此本文選擇甲醇-水溶液為提取溶劑。

2.2 PCX 固相萃取純化

PCX 萃取樹脂為混合型材料，對極性堿性化合物具有良好的吸附作用。在酸性條件下上樣，呈陽離子形態(tài)的CKs 與萃取柱填料上的磺酸基團發(fā)生相互作用而被吸附。依次用水、甲醇淋洗以去除弱酸性和中性化合物雜質(zhì)，再加入氨化甲醇，使填料環(huán)境呈堿性，此時目標物呈中性而被甲醇洗脫。

用基質(zhì)效應強弱來評價方法的純化效果。分別以1.4.1 節(jié)方法處理得到的樣品粗提液、1.4.2 節(jié)方法處理得到的樣品純化后溶液和20% 甲醇溶液配制17 種CKs 的混合標準溶液。各目標化合物的質(zhì)量濃度均設為0.1、0.5、5 和25 ng／mL。經(jīng)LCMS／MS 測定，用目標化合物定量離子的峰面積對標準溶液質(zhì)量濃度繪制標準曲線。以前兩組樣品獲得的曲線斜率分別與后一組樣品獲得的曲線斜率比值η 的大小來判定基質(zhì)效應的強弱［20］。η 值越接近1，基質(zhì)效應越弱，即方法純化效果越好；η 值偏離1越大，基質(zhì)效應越強。結(jié)果表明，與水稻根和莖相比，水稻葉樣品的基質(zhì)效應最強。圖1 為以水稻葉基質(zhì)為例，PCX 固相萃取柱對樣品的純化效果。由圖1 可知，當樣品未經(jīng)純化時，17 種CKs 均表現(xiàn)出較強的基質(zhì)效應，其中絕大多數(shù)CKs 的η 值均小于0.70，而DZ7G 的η 值高達1.24。當樣品粗提液經(jīng)PCX 固相萃取柱純化后，盡管粗提液被濃縮近8倍，但各目標化合物的基質(zhì)效應仍明顯減弱，其η值均在0.79 ～1.07 之間。由此可見，本文選用PCX固相萃取柱具有較好的純化效果，提高了方法的準確度。

圖1 水稻葉中17 種細胞分裂素（a）純化前及（b）純化后的基質(zhì)效應圖Fig.1 Matrix effects of the 17 cytokinins in rice leaves （a）before and （b）after the purification by polymer cation exchange resins

2.3 LC-MS／MS 條件

多數(shù)CKs 結(jié)構(gòu)較為相似，有些還互為同分異構(gòu)體，含有相同的碎片離子，如tZ7G、tZ9G 和tZOG，DZ7G、DZ9G 和DZOG 等（見表1）。要對這些目標化合物進行準確定量，選擇良好的色譜分離條件是關(guān)鍵。為此，本文在采用1.8 μm 超高效C18 分析柱的基礎上，對流動相組成進行了優(yōu)化。通常情況下，向流動相中添加甲酸或緩沖鹽（通常為甲酸銨）可獲得更高的ESI＋分析靈敏度。但試驗結(jié)果表明，當流動相中添加甲酸時，上述同分異構(gòu)體分離度變差，且甲酸濃度越高，分離效果越差?？赡苁荂Ks 在酸性條件下易帶正電荷，導致其在反相C18 柱上保留變?nèi)跛?。而當添加甲酸銨時，本文中所有的同分異構(gòu)體均得到基線分離。綜合考慮分離效率和質(zhì)譜耐受性，本文最終選用5 mmol／L 甲酸銨-甲醇為流動相。在最佳條件下，17 種CKs 的SRM 色譜圖見圖2。

以蠕動泵進樣方式將17 種CKs 標準溶液（1 μg／mL）分別注入質(zhì)譜系統(tǒng)，結(jié)果表明，所有分析物均在正離子模式下獲得最佳靈敏度，且主要形成［M＋H］＋準分子離子峰。通過二級質(zhì)譜優(yōu)化，得到了17 種CKs 的最佳SRM 采集參數(shù)（見表1），其中離子反應通道1 為定量離子，通道2 為定性離子。

2.4 方法的線性關(guān)系、檢出限、回收率和精密度

將1.3 節(jié)中1 μg／mL 的混合標準溶液用20%甲醇配制成系列濃度的混合標準工作液，按照1.5節(jié)條件進行測定，每個濃度測定3 次。以目標化合物定量離子的峰面積平均值（y）對標準溶液質(zhì)量濃度（x，ng／mL）進行線性回歸分析，得到17 種CKs的線性方程和相關(guān)系數(shù)（r）（見表2）。結(jié)果顯示，各目標化合物均在0.01 ～100 ng／mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r 均大于0.998 4。

表2 17 種細胞分裂素的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients （r）and limits of detection （LODs）of the 17 cytokinins

圖2 17 種細胞分裂素標準溶液（1 ng／mL）的選擇反應監(jiān)測色譜圖Fig.2 Selected reaction monitoring chromatograms of the 17 cytokinin standard solution （1 ng／mL）

在水稻樣品中添加不同濃度的待測物，按本方法進行檢測，以信噪比S／N ＝3 確定各目標化合物的檢出限（LOD），由表2 可知，17 種目標化合物的檢出限在0.01 ～0.05 ng／g 之間。

取水稻根、莖和葉樣品，分別添加0.2、1 和5 ng／g 3 個濃度水平的17 種目標化合物，每個水平重復測定6 次，平均回收率和精密度見表3。可以看出，各目標化合物在3 個加標水平下，平均回收率為60.2% ～125.4%，RSD 為5.4% ～29.7%。

2.5 實際樣品測定

按本方法對水稻3 個部位的17 種CKs 含量進行了分析，每個部位樣品重復測定3 次，取平均值，具體分析結(jié)果見表4?？梢钥闯?，水稻根和葉中均有5 種CKs（tZ9G、cZ、iP9G、cZR 和iPR）檢出，而莖中只有4 種CKs（tZ9G、cZ、iP9G 和cZR）檢出。所有檢出的CKs 含量在0.02 ～0.93 ng／g 范圍內(nèi)，這與之前文獻報道的結(jié)果［21］相似。

表3 水稻基質(zhì)中17 種細胞分裂素的加標回收率和RSD（n＝6）Table 3 Recoveries and RSDs of the 17 cytokinins spiked in rice matrix （n＝6）

表4 水稻樣品根、莖和葉中細胞分裂素含量Table 4 Contents of cytokinins in rice roots，stems and leaves ng／g

3 結(jié)論

本文建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定水稻樣品中17 種CKs 的分析方法，該方法靈敏度高、選擇性強。采用甲醇-水溶液提取、混合型陽離子交換反相樹脂純化，實現(xiàn)了水稻基質(zhì)中各分析物的高效提取，同時有效降低了基質(zhì)效應。采用小粒徑（1.8 μm）超高效C18 分析柱，優(yōu)化了流動相條件，實現(xiàn)了多種同分異構(gòu)體的基線分離和準確定量。結(jié)果表明，該方法能滿足水稻中17 種CKs 的分析。

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