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    半纖維素側(cè)鏈降解酶
    ——α-葡萄糖醛酸酶的研究進(jìn)展*

    2014-07-01 23:52:17吳金連黎海龍甘禮惠龍敏南
    新能源進(jìn)展 2014年5期
    關(guān)鍵詞:側(cè)鏈醛酸聚糖

    吳金連,薛 勇,黎海龍,甘禮惠,劉 健,龍敏南

    (廈門大學(xué)能源學(xué)院,廈門 361102)

    半纖維素側(cè)鏈降解酶
    ——α-葡萄糖醛酸酶的研究進(jìn)展*

    吳金連,薛 勇,黎海龍,甘禮惠,劉 健,龍敏南?

    (廈門大學(xué)能源學(xué)院,廈門 361102)

    半纖維素是自然界中最豐富的可再生資源之一,將半纖維素降解為單糖并轉(zhuǎn)化為燃料或化學(xué)品一直是科學(xué)界研究的熱點。半纖維素是由木糖基主鏈以及α-葡萄糖醛酸等側(cè)鏈共同組成的異質(zhì)多聚體。α-葡萄糖醛酸酶是半纖維素完全降解過程中的關(guān)鍵酶之一,能夠水解4-O-甲基葡萄糖醛酸與木糖之間的α-1,2-糖苷鍵。本文綜述了α-葡萄糖醛酸酶的分類、催化機(jī)制及晶體結(jié)構(gòu)、酶學(xué)性質(zhì)和基因克隆表達(dá)等方面的研究進(jìn)展,同時對該研究進(jìn)行了展望。

    半纖維素;α-葡萄糖醛酸酶;結(jié)構(gòu);催化機(jī)理;酶學(xué)特性

    0 前 言

    半纖維素是自然界中最豐富的可再生資源之一,廣泛存在于植物細(xì)胞壁中,其含量約占植物細(xì)胞總干重的25%~40%,儲量僅次于纖維素[1]。半纖維素的利用與轉(zhuǎn)化對于解決目前世界石油危機(jī)、能源與人爭糧、溫室效應(yīng)等全球問題具有非常重要的作用,因此其有效利用日益受到世界各國的廣泛關(guān)注。但是,與纖維素相比,半纖維素結(jié)構(gòu)成分復(fù)雜,除了由 β-D-吡喃木糖殘基經(jīng) β-1,4-糖苷鍵連接而成的主鏈外,還含有不同側(cè)鏈取代基,如4-O-甲基葡萄糖醛酸側(cè)鏈、α-L-呋喃型阿拉伯糖側(cè)鏈以及少量通過L-阿拉伯糖殘基連接的阿魏酸或香豆酸側(cè)鏈等[2]。半纖維素的復(fù)雜結(jié)構(gòu)決定了其徹底的降解需要半纖維素酶水解酶系中各種酶的協(xié)同作用,主要包括降解木聚糖主鏈的內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶,還有降解側(cè)鏈的 α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶和酚酸酯酶等[3]。其中,α-葡萄糖醛酸酶對于半纖維素的生物轉(zhuǎn)化起著非常重要的作用。

    α-葡萄糖醛酸酶(EC 3.2.1.131,EC 3.2.1.-)是一種半纖維素側(cè)鏈水解酶,主要作用于4-O-甲基葡萄糖醛酸與木糖之間的α-1,2-糖苷鍵,在半纖維素降解過程中與半纖維素降解酶系的其他酶相互促進(jìn),實現(xiàn)木聚糖的高效水解[2]。由于該酶的總活性較低,對應(yīng)的酶促反應(yīng)往往是半纖維素系列水解反應(yīng)的控制性步驟。因此,對該酶的研究對于半纖維素的高效利用具有重大意義。相對于半纖維素降解酶系的其他酶,α-葡萄糖醛酸酶被發(fā)現(xiàn)較晚,直到1981年才被人們發(fā)現(xiàn)[4]。隨著對半纖維素及半纖維素酶的深入研究,α-葡萄糖醛酸酶的生物技術(shù)潛力越來越受到人們的重視。

    1 α-葡萄糖醛酸酶的分類

    1991年,Henrissat等[5]根據(jù)氨基酸序列的相似性把糖基水解酶分成不同的家族。2009年 Cantarel等[6]將來自不同微生物的 α-葡萄糖醛酸酶分為兩大類,即糖苷水解酶(Glycoside hydrolases)第67(GH 67)和第115(GH 115)家族,見表1。其中第67家族α-葡萄糖醛酸酶大多都來自細(xì)菌,而第115家族大多來自真菌。

    不同家族的α-葡萄糖醛酸酶在作用于葡萄糖醛酸木聚糖時顯示出不同的底物特異性。第67家族的α-葡萄糖醛酸酶只能作用于殘基數(shù)在2~5之間的小分子 4-O-甲基葡糖醛酸低聚木糖,且只能水解非還原末端的4-O-甲基葡萄糖醛酸側(cè)鏈[7,8]。而GH 115家族的α-葡萄糖醛酸酶具有更廣泛的底物特異性,不僅能夠從4-O-甲基葡糖醛酸低聚糖的非還原端水解下4-O-甲基葡萄糖醛酸,還能夠作用于長鏈4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖內(nèi)部的4-O-甲基葡萄糖醛酸側(cè)鏈將 4-O-甲基葡萄糖醛酸從木聚糖主鏈的 α-1,2-糖苷鍵中釋放[9,10],見圖1。

    表1 α-葡萄糖醛酸酶的分類Table 1 Classification of α-glucuronidase

    圖1 α-葡萄糖醛酸酶GH 67和GH 115底物特異性差異Fig. 1 The substrate specificity between α-glucuronidase GH 67 and GH 115 (A) α-Glucuronidase GH 67 (n=0, 1, 2, 3) and GH 115 (n ≥ 0) release 4-O-methyl glucuronic acid from the terminal non-reducing end xylopyranosyl unit of xylo-oligosaccharides; (B) Family 115 α-glucuronidase also release 4-O-methyl glucuronic acid which is linked to the internal xylosyl residues

    2 α-葡萄糖醛酸酶的催化機(jī)理及晶體結(jié)構(gòu)

    2.1 α-葡萄糖醛酸酶降解葡萄糖醛酸木聚糖的催化機(jī)理

    在半纖維素的水解過程中,α-葡萄糖醛酸酶(EC 3.2.1.131,EC 3.2.1.-)主要作用于α-葡萄糖醛酸或 4-O-甲基葡萄糖醛酸與主鏈木糖殘基之間的α-1,2-糖苷鍵,圖2簡要地顯示了半纖維素的結(jié)構(gòu)及半纖維素降解酶系中各酶的作用位點[9]。

    目前關(guān)于 α-葡萄糖醛酸酶在木聚糖水解過程中具體的催化機(jī)制研究較少。迄今為止,研究認(rèn)為α-葡萄糖醛酸酶在酶水解過程中的催化機(jī)制有單一置換機(jī)制(Single displacement mechanism)和底物輔助催化機(jī)制(Substrate-assisted catalysis mechanism)。不管是屬于GH 67家族還是GH 115家族,單一置換機(jī)制是目前被廣泛認(rèn)同的 α-葡萄糖醛酸酶催化機(jī)制。這種催化機(jī)制認(rèn)為:α-葡萄糖醛酸酶在水解4-O-甲基葡萄糖醛酸低聚糖底物時,酶與底物結(jié)合后,底物上的4-O-甲基葡萄糖醛酸(MeGlcA)異頭碳構(gòu)型發(fā)生反轉(zhuǎn)(α-端基異構(gòu)反轉(zhuǎn)成 β-端基異構(gòu))從而水解α-1,2-糖苷鍵;一般在水解過程中,酶分子中的一個羧酸殘基作為酸而其他(如底物)作為一般的堿。2000年,Biely等[10]首次提出Aspergillus tubingensis的GH 67家族α-葡萄糖醛酸酶屬于這一催化機(jī)制。此后,Kolenová等[11]用類似的方法研究,發(fā)現(xiàn)GH 115家族的α-葡萄糖醛酸酶也屬于這一催化機(jī)制。此外,Golan等[12]通過 α-葡萄糖醛酸酶在催化水解底物時“open”和“closed”(催化)構(gòu)象的改變推測:Asp-364和Glu-392共同激活親核水分子,親核水分子將 Glu-285質(zhì)子化,而質(zhì)子化了的Glu-285更容易接近帶負(fù)離子的底物,進(jìn)而推測α-葡萄糖醛酸酶在水解木聚糖時的催化機(jī)制是底物輔助催化機(jī)制。

    圖2 半纖維素結(jié)構(gòu)及半纖維素酶系對其降解作用Fig. 2 Schematic of hemicellulose and hemicellulose-hydrolases

    通過對功能性氨基酸殘基的深入研究,進(jìn)一步揭示了α-葡萄糖醛酸酶的催化機(jī)制。2002年,Didier等[13]在研究Pseudomonas cellulosaα-葡萄糖醛酸酶GlcA67A的晶體結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn) Arg325、Lys288和Lys360有助于酶與底物的識別,Trp543能夠促進(jìn)酶與底物的結(jié)合,而Glu292是酶催化活性中心的關(guān)鍵殘基。2003年,Nagy等[14]也在Cellvibrio japonicusα-葡萄糖醛酸酶發(fā)現(xiàn)了功能性氨基酸 Glu-393和Asp-365具有催化功能;Lys-288、Arg-325和Lys-360在酶與底物的4-O-甲基葡萄糖醛酸羧基結(jié)合中起著重要作用,因此這三個氨基酸為酶的底物結(jié)合位點功能性氨基酸。同樣,Golan等[15]也通過晶體結(jié)構(gòu)和定點突變的研究確定了Geobacillus stearothermophilusα-葡萄糖醛酸酶中Glu386對于酶的催化活性起重要作用,而三個保守氨基酸殘基(Glu285、Asp364和 Glu392)是該酶的催化殘基;最近,Rogowski等[9]詳細(xì)研究了Bacteroides ovatusα-葡萄糖醛酸酶的結(jié)構(gòu)后確定了一些功能性氨基酸的催化功能:His422和Tyr420決定酶的底物特異性,Trp249參與酶的催化活力,Tyr792對于酶與木聚糖底物的結(jié)合有重大貢獻(xiàn),His422是酶催化裝置的重要組成部分,Asp-332或Glu-375在酶水解催化過程中也具有重要作用,但是它們的具體作用還不太清楚,有待進(jìn)一步深入研究。一般酸性氨基酸諸如谷氨酸、天冬氨酸參與酶的催化活性,一些堿性氨基酸如精氨酸、組氨酸、賴氨酸等是酶底物結(jié)合域的關(guān)鍵殘基。

    2.2 晶體結(jié)構(gòu)

    隨著對α-葡萄糖醛酸酶研究的不斷深入,其分子結(jié)構(gòu)也不斷得到確認(rèn)。通過對酶晶體結(jié)構(gòu)的研究表明,來源于細(xì)菌的 α-葡萄糖醛酸酶一般以二聚體的形式實現(xiàn)其催化功能,而大部分來源于真菌的α-葡萄糖醛酸酶在催化水解時沒有三維二聚體結(jié)構(gòu),只以單體蛋白的形式實現(xiàn)酶催化水解[12]。2004年,Golan等[15]通過X射線單晶衍射首次確定了來自G. stearothermophilusα-D-葡萄糖醛酸酶的結(jié)構(gòu),該酶以二聚體形式存在,每個單體由三個獨立的結(jié)構(gòu)域通過環(huán)(loops)相互聯(lián)系:N-末端結(jié)構(gòu)域(1~142)、一個(β/α)8TIM桶狀結(jié)構(gòu)域(143~471)和C-末端結(jié)構(gòu)域(472~780)。其中每個結(jié)構(gòu)域之間通過如下位點連接:(β/α)8結(jié)構(gòu)域的Trp-328和Arg-329,C-末端的Glu-536、Arg-548、Glu-654、Asp-657、Arg-665和Lys-666,該酶的結(jié)構(gòu)可見圖3。2010年,F(xiàn)ujimoto等[17]對Streptomyces pristinaespiralisα-葡萄糖醛酸酶進(jìn)行了結(jié)晶,并初步分析了該酶的晶體結(jié)構(gòu)。2014,Rogowski等[9]更精確地確定了GH 115家族α-葡萄糖醛酸酶的結(jié)構(gòu),這是GH 115家族最具代表性的蛋白結(jié)構(gòu),該酶含有四個結(jié)構(gòu)域:N-末端結(jié)構(gòu)域(33~196)、(β/α)8TIM桶狀結(jié)構(gòu)域(197~482)、由5個螺旋束組成的結(jié)構(gòu)域(488~641)和一個典型的β-三明治折疊的C端結(jié)構(gòu)域(1~32,673~844和483~487),通過結(jié)構(gòu)的研究以及結(jié)合突變研究技術(shù),該酶的功能性氨基酸也得到了確認(rèn)。

    圖3 G. stearothermophilusα-D-葡萄糖醛酸酶的結(jié)構(gòu)[16]Fig 3. Structure ofG. stearothermophilusα-D-glucuronidase [The polypeptide chain is coloured from N terminus (blue) to C terminus (red)]

    3 α-葡萄糖醛酸酶的酶學(xué)特性

    不同微生物所產(chǎn)的α-葡萄糖醛酸酶的分子量、等電點、pH值作用范圍、溫度作用范圍等都有一定的差異,而酶學(xué)性質(zhì)的差異直接影響其使用條件和應(yīng)用領(lǐng)域,尤其是最適pH和熱穩(wěn)定性。

    一般來說,大多數(shù)來自細(xì)菌的α-葡萄糖醛酸酶的預(yù)測分子量約為70 kDa,而來自真菌的葡萄糖醛酸酶單體蛋白分子量較大,約為90 kDa[18]。至今已報道的α-葡萄糖醛酸酶的等電點多數(shù)為弱酸性。各種不同來源α-葡萄糖醛酸酶的酶學(xué)性質(zhì)見表2。

    表2 幾種不同來源α-葡萄糖醛酸酶的酶學(xué)特性Table 2 Enzymatic charaterization of α-glucuronidase from different microorganisms

    3.1 溫度對α-葡萄糖醛酸酶活性的影響

    溫度對酶活性有很大的影響,在較低的溫度范圍內(nèi),酶反應(yīng)速率隨溫度升高而增大,但隨著溫度的升高,酶蛋白逐漸變性而失活,引起酶反應(yīng)速率下降。因此,在工業(yè)應(yīng)用中,酶的熱穩(wěn)定性成為重要的考慮因素。

    α-葡萄糖醛酸酶的最適反應(yīng)溫度隨來源于不同的菌株有較大的差異,一般在40℃~65℃(見表2),但是從海棲熱袍菌(Thermotoga maritimeMSB8)中分離純化得到的α-葡萄糖醛酸酶最適反應(yīng)溫度達(dá)到85℃,其活性可在75℃維持140 h以上,在95℃保持5 h以上還有20%的酶活力[20]。耐熱菌株的出現(xiàn)有利于酶的貯存和工業(yè)化處理,具有很高的工業(yè)應(yīng)用價值。

    3.2 pH值對α-葡萄糖醛酸酶活性的影響

    多數(shù)α-葡萄糖醛酸酶的最適pH值在3.5~6.0之間,但也有部分菌株所產(chǎn)α-葡萄糖醛酸酶的最適pH值為接近中性或弱堿性。如2008年,Iihashi等[28]從細(xì)菌Paenibacillus sp.TH501b中純化的α-葡萄糖醛酸酶在pH值6.0~7.0表現(xiàn)出最大的酶活力,且在pH值為7.0時該酶最穩(wěn)定。2012年,Lee等[29]從堆肥中的微生物中分離并克隆得到α-葡萄糖醛酸酶基因,該基因表達(dá)的酶最適pH值為7~8;還有,從Thermotoga maritima菌中獲得的α-葡萄糖醛酸酶最適pH值為7.8[31]。

    3.3 金屬離子對 α-葡萄糖醛酸酶酶活性的影響

    除溫度和pH值外,α-葡萄糖醛酸酶的結(jié)構(gòu)及活性也會受到金屬離子的影響,在工業(yè)應(yīng)用中某些金屬離子對酶的激活或抑制作用也是衡量該酶工業(yè)用途的重要參數(shù)。研究表明,金屬離子的種類以及濃度均會對 α-葡萄糖醛酸酶的活性產(chǎn)生顯著影響。例如,一般重金屬(Hg2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等)和一些有機(jī)物(尿素、EDTA、DMSO等)會抑制α-葡萄糖醛酸酶的活力,而Ca2+和Mg2+能夠穩(wěn)定“酶-底物”復(fù)合物從而提高酶活力[16]。Ruile等[22]曾報道了Ag+、Cd2+、Hg2+、Pb2+、Cu2+和Zn2+對α-葡萄糖醛酸酶有強烈的抑制作用,而低濃度的Fe2+、Ca2+及K+均可以提高酶的活力。

    4 α-葡萄糖醛酸酶基因的克隆及表達(dá)

    近年來,越來越多的α-葡萄糖醛酸酶從細(xì)菌和真菌等微生物中被純化、克隆和表達(dá)(見表2)。細(xì)菌來源的酶有Thermoanaerobacteriumpolysaccharolyticum、Cellvibrio japonicus、Ruminococcus albus、Thermotoga maritima、Bacteroides ovatus和Paenibacillus polymyxa等。例如,Ruile等[22]從Thermotoga maritimeMSB8基因文庫中篩選得到6.5 kb DNA片段,并對其進(jìn)行核酸序列分析、缺失實驗及在大腸桿菌中表達(dá),最后分離到一個編碼674個氨基酸的α-葡萄糖醛酸酶基因。在國內(nèi),薛業(yè)敏等[32]也從極端嗜熱厭氧細(xì)菌海棲熱袍菌(Thermotoga maritime)中克隆了α-葡萄糖醛酸酶基因并實現(xiàn)了其在大腸桿菌中的高效表達(dá)。真菌來源被研究的酶有Aspergillus niger、Talaromyces emersonii、Botryotinia fuckeliana、Pichia stipitis、Schizophyllum commune、Sporisorium reilianum、Thielavia terrestris、Paenibacillussp、Phanerochaete chrysosporium、Aureobasidium pullulans等。被克隆和表達(dá)的 α-葡萄糖醛酸酶基因也都大部分來自真菌,如1997年首次從T. reeseiRut-30克隆的α-葡萄醛酸基因grlI,其核酸序列含有2541 bp的開放閱讀框,編碼847個氨基酸[33];2007年,Heneghan等[19]從嗜熱真菌Talaromyces emersonii克隆了 α-葡萄糖醛酸酶aguA基因,該基因沒有內(nèi)含子,由一個2511 bp的開放閱讀框組成,能夠編碼837個氨基酸。2008年,Lee等[29]利用燕麥木聚糖、樺木木聚糖和山毛櫸木聚糖作為碳源從堆肥中的混合種群微生物中分離到 3.9 kb的基因組 DNA,進(jìn)而將克隆到的α-葡萄糖醛酸酶基因deg75-AG轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21(DE3)pLysE中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。Rogowski等[9]又從Bacteroides ovatus基因組DNA中克隆得到GH 115家族α-葡萄糖醛酸酶基因BoAgu115A,該基因編碼一個824個氨基酸的蛋白質(zhì)。將來,隨著對木聚糖酶系的深入研究,具有各種不同酶學(xué)特性的α-葡萄糖醛酸酶將會被一一克隆與表達(dá)。

    5 α-葡萄糖醛酸酶的應(yīng)用前景及展望

    α-葡萄糖醛酸酶具有良好的應(yīng)用前景。能源工業(yè)方面,α-葡萄糖醛酸酶能夠協(xié)同內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶將半纖維素徹底降解為木糖,而木糖可被細(xì)菌或真菌轉(zhuǎn)化為液體燃料如酒精等。食品領(lǐng)域方面,α-葡萄糖醛酸酶能夠與其他半纖維素酶共同降解果汁、啤酒中的一些多糖,有利于果汁、啤酒的澄清,α-葡萄糖醛酸酶對于提高低聚木糖的產(chǎn)率也具有重要應(yīng)用價值。在工程菌株的構(gòu)建方面,α-葡萄糖醛酸酶的研究對于構(gòu)建能夠合理地高產(chǎn)所有半纖維素酶系的工程菌株具有重要作用。

    雖然近幾年對于α-葡萄糖醛酸酶的研究進(jìn)展很快,但還存在一些問題需要更加深入的研究。首先,詳細(xì)闡明 α-葡萄糖醛酸酶催化反應(yīng)機(jī)制對于更好地利用該酶具有重大的意義,然而,現(xiàn)在的研究還不夠深入,比如酶與底物相互作用的精確模式等還有待進(jìn)一步深入研究。其次,目前雖然有文獻(xiàn)報道α-葡萄糖醛酸酶能與內(nèi)切木聚糖酶或 β-木糖苷酶協(xié)同并促進(jìn)降解木聚糖,但還無法完全解釋α-葡萄糖醛酸酶與內(nèi)切木聚糖酶或 β-木糖苷酶協(xié)同降解機(jī)理;同時,不同家族的α-葡萄糖醛酸酶有不同的水解催化特性,研究也報道了這些差異的存在可能與酶的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān),但明確的機(jī)理還有待更深入的證實。目前,α-葡萄糖醛酸酶已經(jīng)從不同的微生物中被純化或克隆表達(dá)獲得,但所獲得的酶活力均不高,因此探索合適的培養(yǎng)基來實現(xiàn)該酶的高效表達(dá),對于工業(yè)應(yīng)用具有很高的價值,這也是今后研究的一個重要方向。此外,如何利用葡萄糖醛酸酶與阿拉伯糖糖苷酶或β-木糖苷酶等半纖維素酶協(xié)同作用可控地降解半纖維素,以獲得高價值產(chǎn)品,也將是科研工作者的研究方向。

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    Research Progress of α-Glucuronidase, an Enzyme for Degrading Hemicellulose Side-Chain

    WU Jin-lian, XUE Yong, LI Hai-long, GAN Li-hui, LIU Jian, LONG Min-nan
    (College of Energy, Xiamen University, Xiamen 361102, China)

    Hemicellulose is one of the most abundant renewable resources in nature. The bioconversion of hemicellulose into biofuels or chemicals is a research hotspot in the world. Hemicellulose consists of a backbone of xylan residues and some branches like glucuronic acid. α-Glucuronidase, which is capable to hydrolysis the α-1,2-glycosidic bond between xylan and glucuronic acid, is one of the key enzyme to degrade hemicellulose completely. The recent research progresses on catalysis mechanism, structure, charaterization, and gene cloning of α-glucuronidase are summarized in this paper.

    hemicellulose; α-glucuronidase; structure; catalysis mechanism; enzymatic charaterization

    TK6;Q55

    A

    10.3969/j.issn.2095-560X.2014.05.001

    2095-560X(2014)05-0327-07

    吳金連(1989-),女,碩士研究生,主要從事半纖維素酶的表達(dá)與生物質(zhì)能源研究。

    2014-08-29

    2014-09-06

    國家自然科學(xué)基金(31170067,21303142);國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃,2010CB732201);福建省自然科學(xué)基金(2012J05029);農(nóng)業(yè)部“引進(jìn)國際先進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)”項目(2013-Z70)

    ? 通信作者:龍敏南,E-mail:longmn@xmu.edu.cn

    龍敏南(1965-),男,博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事生物質(zhì)轉(zhuǎn)化制生物基燃料與生物基化學(xué)品的研究與技術(shù)開發(fā)。

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