馬克斯克魯維酵母制備生物質(zhì)乙醇研究進(jìn)展*

陳小燕，許敬亮，袁振宏，梁翠誼，張 宇

（中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所，中國(guó)科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640）

馬克斯克魯維酵母制備生物質(zhì)乙醇研究進(jìn)展*

陳小燕，許敬亮，袁振宏?，梁翠誼，張 宇

（中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所，中國(guó)科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640）

利用高溫酵母進(jìn)行高溫乙醇發(fā)酵，因其能量損耗低、發(fā)酵速度快、染菌機(jī)率低等優(yōu)點(diǎn)，成為生物質(zhì)乙醇發(fā)酵生產(chǎn)的新方向。相比傳統(tǒng)酵母，馬克斯克魯維高溫酵母具有良好的耐溫適應(yīng)能力、更寬泛的底物利用能力、良好的發(fā)酵性能、超強(qiáng)的分泌能力、適于分子生物學(xué)操作等優(yōu)勢(shì)，在生物質(zhì)乙醇發(fā)酵方面顯示巨大潛力。本文從底物利用能力、基因重組方法、發(fā)酵方法等方面總結(jié)了馬克斯克魯維酵母在生物質(zhì)乙醇發(fā)酵方面的發(fā)展概況。

馬克斯克魯維酵母；生物質(zhì)乙醇；菌株改造

0 引 言

相比傳統(tǒng)酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，高溫酵母乙醇發(fā)酵更適于工業(yè)化生產(chǎn)。首先，高溫發(fā)酵過程減少了高溫預(yù)處理或酶解冷卻至低溫發(fā)酵所需的能量損耗。其次，高溫酵母繁殖速度快，容易形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，能顯著抑制其它微生物的生長(zhǎng)，降低常溫微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，高溫下可以得到更高的糖化與發(fā)酵效率，并且有利于產(chǎn)物的抽提與濃縮。因此，開發(fā)利用性能優(yōu)良的高溫酵母成為乙醇發(fā)酵研究的熱點(diǎn)。馬克斯克魯維酵母（Kluyveromycesmarxianus）由于能在 40℃以上生長(zhǎng)并進(jìn)行乙醇發(fā)酵而備受關(guān)注。馬克斯克魯維酵母在分類學(xué)上與釀酒酵母具有一定的親緣性，并與乳酸克魯維酵母一樣獲得美國(guó)食品添加劑的安全性指標(biāo)（Generally Regarded as Safe, GRAS）認(rèn)證和歐洲“安全資格認(rèn)定”（Qualified Presumption of Safety, QPS）認(rèn)證[1]。與前兩者相比，馬克斯克魯維酵母因其可利用底物廣泛、生長(zhǎng)速率快、耐熱、蛋白分泌能力強(qiáng)以及更適合于生物工程改造與應(yīng)用而備受工業(yè)生產(chǎn)的青睞。本文就馬克斯克魯維酵母菌利用生物質(zhì)乙醇發(fā)酵的研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要的概括和總結(jié)。

1 馬克斯克魯維酵母的分類

馬克斯克魯維酵母最早被命名為Saccharomyces marxianus[2]，后來由于其子囊形態(tài)、發(fā)酵能力、菌株間雜交能力與Saccharomyces（簡(jiǎn)寫為S.）存在較大區(qū)別，于1956年更名Kluyveromyces（簡(jiǎn)寫為K.）[3]。隨著基因測(cè)序的快速發(fā)展，最初基于生理生化形態(tài)等特征的分類方法被弱化，根據(jù)不同菌株核糖體大亞基的26S rDNA的D1/D2區(qū)域序列差異性的菌種分類方法更科學(xué)、合理[4]?；诖朔椒?，Kluyveromyces屬重新被分為6個(gè)分枝，具體的進(jìn)化樹分析見圖1。

圖1 不同Kluyveromyces種的親緣關(guān)系[4]Fig. 1 The relationship betweenKluyveromycesspecies[4]

2 生物質(zhì)原料底物利用能力

馬克斯克魯維酵母能利用多種不同的單糖和多糖復(fù)合物進(jìn)行代謝和生長(zhǎng)，其中生物質(zhì)底物包括：木質(zhì)纖維素原料、乳清、菊粉等。關(guān)于馬克斯克魯維酵母利用生物質(zhì)原料生產(chǎn)乙醇的報(bào)道非常多，本文列舉出其中部分比較典型的例子，見表1。

2.1 木質(zhì)纖維素原料

木質(zhì)纖維素是世界上廣泛存在且最為廉價(jià)的糖發(fā)酵原料，由于其結(jié)構(gòu)緊湊，不易被直接利用，要水解得到可發(fā)酵單糖需要經(jīng)過特定的預(yù)處理和生物酶解過程。纖維素的酶解多數(shù)可在40℃～50℃高溫條件下進(jìn)行，而高溫酵母的乙醇發(fā)酵溫度范圍為30℃～45℃，高溫酵母的利用使得纖維素的酶解和發(fā)酵可以在同一溫度下進(jìn)行，有效減少了傳統(tǒng)釀酒酵母酶解-發(fā)酵降溫過程所造成的能源消耗。

表1 馬克斯克魯維酵母菌株利用生物質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇Table 1 Ethanol production byK.marxianususing various biomass materials

基于其高溫發(fā)酵特性，國(guó)內(nèi)外對(duì)馬克斯克魯維酵母利用各種不同的木質(zhì)纖維素原料成功制備燃料乙醇的研究報(bào)道日益增多。這些研究報(bào)道結(jié)果顯示，馬克斯克魯維酵母可以在30℃～45℃溫度下利用多種纖維素原料進(jìn)行乙醇發(fā)酵，包括各種農(nóng)產(chǎn)品副產(chǎn)物與廢棄物，如稻桿、麥桿、水果榨汁后的殘?jiān)龋约耙恍┠茉床蓊愔参?，如柳枝稷、狼尾草等?/p>

Castro等[5]發(fā)現(xiàn)五株K. marxianus都能在45℃高溫條件下利用酸處理后的稻桿進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)醇，其中發(fā)酵性能最佳的是K. marxianusNRRL Y-6860。該菌株在 30℃和 45℃的發(fā)酵溫度下的發(fā)酵能力均優(yōu)于S.cerevisiae，在45℃時(shí)生成乙醇濃度達(dá)21.5 g/L，轉(zhuǎn)化率為0.44 g/g葡萄糖，達(dá)理論轉(zhuǎn)化率的86%，產(chǎn)醇速率為3.63 g/(L·h)。Tomás-Pejó等[6]以蒸氣爆破后的麥麩為底物，分析不同發(fā)酵策略對(duì)K. marxianusCECT 10875乙醇產(chǎn)率的影響，結(jié)果顯示經(jīng)過 12 h的分批補(bǔ)料同步糖化發(fā)酵過程，CECT 10875可利用含 10%固形物的麥麩混合液進(jìn)行發(fā)酵生成乙醇最高濃度達(dá)36.2 g/L，轉(zhuǎn)化率為0.33 g/g葡萄糖，為理論值的 64.5%。Suryawati等[7]利用K. marxianusIMB4以高溫液態(tài)水處理后的柳枝稷為原料進(jìn)行乙醇發(fā)酵，同時(shí)分析了預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)后續(xù)乙醇發(fā)酵的影響，結(jié)果顯示210℃處理15 min后的柳枝稷，經(jīng)過45℃同步糖化發(fā)酵得到乙醇的最高濃度為16.8 g/L，轉(zhuǎn)化率為72%。腰果梨渣含有豐富的纖維素，是巴西果梨汁產(chǎn)業(yè)中的副產(chǎn)物，其稀酸水解液中約含有29 g/L葡萄糖、25 g/L木糖，Rocha等[8]以腰果梨渣為原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，經(jīng)過K. marxianusCE025發(fā)酵48 h后達(dá)到最高乙醇濃度為12.36 g/L，乙醇得率為0.417 g/g葡萄糖，轉(zhuǎn)化率為81.6%。由于纖維素原料需要經(jīng)過一定的預(yù)處理過程才能將其緊致結(jié)構(gòu)破壞，不同的預(yù)處理方式對(duì)后續(xù)的酶解發(fā)酵有較大影響，導(dǎo)致馬克斯克魯維酵母對(duì)各種纖維素底物的轉(zhuǎn)化能力也有一定的差別。但是已知的這些數(shù)據(jù)表明，馬克斯克魯維酵母的乙醇轉(zhuǎn)化能力基本可達(dá)65%以上，最高可達(dá)86%。

通過改善預(yù)處理工序以及優(yōu)化發(fā)酵工藝，馬克斯克魯維酵母對(duì)纖維素底物的乙醇發(fā)酵能力會(huì)得到進(jìn)一步提高。研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中，添加一定量的纖維素酶與半纖維素酶也有利于高溫酵母纖維素乙醇發(fā)酵效率的提高。García-Aparicio等[9]發(fā)現(xiàn)在乙醇發(fā)酵過程中添加一定量的內(nèi)切木聚糖酶有利于葡聚糖的轉(zhuǎn)化，得到更高的乙醇得率，尤其是在酶解早期效果更加顯著。經(jīng)過木聚糖酶的處理后，K. marxianusCECT 10875對(duì)含10%不可溶固體的大麥桔桿底物的乙醇轉(zhuǎn)化率提高了10%。漆酶能有效地去除發(fā)酵原料中木質(zhì)素酚類物質(zhì)對(duì)高溫酵母的毒性抑制作用。K. marxianusCECT 10875不能在蒸氣爆破的小麥桔桿原漿中生長(zhǎng)，更不能進(jìn)行發(fā)酵，Moreno等[10]用漆酶對(duì)底物進(jìn)行處理后，K. marxianusCECT 10875的生長(zhǎng)能力和乙醇發(fā)酵能力得到完全改善，最終獲得的乙醇得率為0.36 g/g葡萄糖，為理論值的70%。同步糖化發(fā)酵過程中，通過添加纖維素酶的作用不僅可以使發(fā)酵菌株直接利用纖維素底物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，同時(shí)，菌株的發(fā)酵溫度以及發(fā)酵性能也會(huì)得到很大的提高。Pessani等[11]在同步糖化發(fā)酵過程中添加了一定量纖維素酶后，K. marxianusIMB3對(duì)高溫液態(tài)水預(yù)處理柳枝稷的發(fā)酵能力有大幅度提高，發(fā)酵最佳溫度達(dá)45℃，最高乙醇濃度達(dá)22.5 g/L，得率達(dá)到理論值的86%。Yanase等[12]通過表面展示技術(shù)將葡萄糖苷酶和葡聚糖酶固定在K. marxianusNBRC1777細(xì)胞表面，產(chǎn)生的重組菌株K1在 48℃的發(fā)酵能力最佳，比原菌株的最佳發(fā)酵溫度提高了8℃，同時(shí)乙醇發(fā)酵能力提高了1.7倍，乙醇轉(zhuǎn)化率為0.47 g/g葡萄糖，達(dá)到理論值的92%，分析其原因，可能是由于纖維素酶分解生成的葡萄糖產(chǎn)物高濃度地富集在發(fā)酵菌株細(xì)胞表面，非常有利于葡萄糖被及時(shí)有效地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行下一步的乙醇發(fā)酵。纖維素酶、半纖維素酶在高溫乙醇發(fā)酵過程中不僅僅發(fā)揮酶解的作用，同時(shí)也起到脫毒的效果。因此，合理有效地利用纖維素酶、半纖維素酶，對(duì)馬克斯克魯維酵母發(fā)揮高溫發(fā)酵優(yōu)勢(shì)有極大促進(jìn)作用，進(jìn)而有效提高乙醇轉(zhuǎn)化效率。

2.2 乳清

乳清是乳制品行業(yè)的主要副產(chǎn)物，乳清中的主要成分包括乳糖、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和脂類物質(zhì)，其中乳糖含量達(dá)4%～6%。雖然有多種方式可以對(duì)乳清進(jìn)行再利用，但是每年全世界的乳清產(chǎn)量可達(dá)108t[13]，仍會(huì)帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染問題和資源浪費(fèi)。

分子生物學(xué)研究結(jié)果顯示K. marxianus具有乳糖轉(zhuǎn)化所需的的β-半乳糖苷酶基因 LAC4和乳糖通透酶基因LAC12，二者在K. marxianus基因組位置毗鄰，且由同一個(gè)雙向的啟動(dòng)子控制表達(dá)[14]。馬克斯克魯維酵母利用乳糖的能力被應(yīng)用于乳清的再利用，通過將乳清中的乳糖轉(zhuǎn)化成乙醇，避免了乳酪生產(chǎn)的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染問題，同時(shí)增加了清潔能源——生物質(zhì)乙醇的生產(chǎn)原料來源。目前，已有許多乳制品大國(guó)都在致力于開發(fā)研究性能優(yōu)良的克魯維酵母用于乳清的再利用，并對(duì)酵母的乳糖發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，許多研究均已取得不錯(cuò)的進(jìn)展。

巴西某奶制品廠[14]發(fā)現(xiàn)1株名為UFV-3的馬克斯克魯維酵母菌株具有很高的 β-半乳糖苷酶活性，通過發(fā)酵優(yōu)化，K. marxianusUFV-3能有效地將乳清轉(zhuǎn)化成乙醇，乙醇濃度最高可達(dá)80 g/L，得率為0.535 g/g乳糖。Aktas等[15]發(fā)現(xiàn)K. marxianusY-8281具有很高的乳清利用效率，經(jīng)18 h發(fā)酵過程后，95%的乳糖被轉(zhuǎn)化再利用。Salman等[16]也嘗試?yán)肒. marxianusMTCC 1288直接從粗乳清液進(jìn)行乙醇發(fā)酵，經(jīng)過22 h的發(fā)酵過程，乳糖基本消耗完全。

為了減少乳清中其他微生物（主要是乳酸菌）的污染，往往在乳清進(jìn)入下一步的發(fā)酵之前進(jìn)行一定的處理，主要的處理方式有三種：（1）噴霧制成干粉，此方法成本比較高，但是后期可以對(duì)乳糖含量進(jìn)行調(diào)控，獲得最優(yōu)的乳糖發(fā)酵濃度；（2）滅菌法，運(yùn)行成本也比較高，但是處理后的乳清能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持無菌狀態(tài)；（3）冷凍法，將乳清存儲(chǔ)于2℃～5℃的空間內(nèi)，此方法運(yùn)行成本相對(duì)低廉，但如需長(zhǎng)時(shí)間的轉(zhuǎn)運(yùn)將會(huì)增加存儲(chǔ)成本。目前也有報(bào)道[17]顯示不滅菌或不冷凍的乳清中乳糖的含量會(huì)有所降低，但是不會(huì)影響K. marxianus對(duì)乳糖利用，即使開始時(shí)有部分乳糖被乳酸菌轉(zhuǎn)化成乳酸，但是K. marxianus仍能將剩余的乳糖有效地發(fā)酵成乙醇，阻止乳酸的繼續(xù)生成。Christensen[17]等發(fā)現(xiàn)滅菌或冷凍處理后的的乳清能保證幾乎所有的乳糖被轉(zhuǎn)化生成乙醇，且冷凍與滅菌處理的效果沒有明顯區(qū)別，在相同的發(fā)酵條件下，乙醇轉(zhuǎn)化率相近，為（0.44～0.48）g/g乳糖。因此，各個(gè)單位對(duì)乳清的前期保存方法可以因地制宜，選擇更適合自身的處理方式。

K. marxianus利用乳清發(fā)酵產(chǎn)乙醇過程中的各個(gè)條件也被考察。通過對(duì)耗氧量和乳糖濃度的摸索，Silveira等[14]發(fā)現(xiàn)在乳糖濃度為50～170 g/L、溫度為 30℃、氧含量相當(dāng)?shù)偷臈l件下，K. marxianusUFV-3的乳糖–乙醇轉(zhuǎn)化率接近理論值，乳糖濃度為130 g/L時(shí)生成乙醇的濃度最高。K. marxianusY-8281[15]的乳清-乙醇發(fā)酵分析表明，最優(yōu)的發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度31℃、pH值6.0、乳糖濃度45 g/L。Zoppellari等[13]考察了不同的發(fā)酵條件，包括批料、溫度、耗氧量、半連續(xù)發(fā)酵等因素對(duì)K. marxianus var. marxianusCBS712發(fā)酵乳酪廢料的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在溫度為28℃、厭氧、半連續(xù)發(fā)酵條件下得到的乙醇濃度最高為19.32 g/L，廢料中的乳糖在發(fā)酵結(jié)束時(shí)基本消耗完全。Diniz等[18]開展了 29個(gè)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并利用響應(yīng)面法分析不同因素對(duì)K. marxianusUFV-3乳清乙醇發(fā)酵的影響，結(jié)果顯示溫度是最重要的影響因素，其次為pH、菌體濃度和乳糖含量。在溫度為33.3℃～38.5℃、pH值為4.7～5.7、菌體濃度OD6002.4～3.3、乳糖濃度為50～108 g/L發(fā)酵條件下，乙醇轉(zhuǎn)化率可達(dá) 90%以上。研究進(jìn)展顯示，雖然不同K. marxianus菌株的最佳發(fā)酵工藝條件各不相同，但仍然保持在一定的范圍之內(nèi)：溫度為30℃～40℃、pH值為弱酸性（4.5～6）或自然pH值、厭氧或低氧濃度環(huán)境，K. marxianus的發(fā)酵性能最優(yōu)。

由上可見，馬克斯克魯維酵母生產(chǎn)乳清乙醇在乳制品行業(yè)尤其是乳制品大國(guó)起著相當(dāng)重要的作用，也為清潔能源的生產(chǎn)拓寬新的發(fā)展道路。

2.3 菊粉

菊粉（inulin）是由果糖分子經(jīng)β-2,1糖苷鍵脫水形成的線型分子，是菊芋塊莖中糖的主要存在形式，其含量可達(dá)菊芋干重的70%。菊芋，又稱洋姜，在我國(guó)大部分地區(qū)均有種植，其生命力極強(qiáng)，能耐受零下40℃甚至更低的溫度。在我國(guó)荒漠地區(qū)可大面積種植，起到治沙、固沙、保水的作用。1939年，馬克斯克魯維酵母（當(dāng)時(shí)稱為Saccharomyces marxianus）的菊粉發(fā)酵能力就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，該菌株能產(chǎn)生將菊粉水解成寡糖的菊粉酶（inulinase）。基于這一特性，研究人員逐漸開展馬克斯克魯維酵母高效生產(chǎn)菊粉酶的研究[19,20]。由于菊芋粉能夠被馬克斯克魯維酵母直接酶解，菊芋塊莖的處理過程也相對(duì)簡(jiǎn)單、容易，主要包括去皮、切片、干燥及磨粉等過程。目前，馬克斯克魯維酵母利用菊芋的發(fā)酵條件研究也有一定的進(jìn)展，對(duì)于同一菌株，不同的發(fā)酵溫度、pH值對(duì)發(fā)酵效率影響不大，乙醇轉(zhuǎn)化率多數(shù)可達(dá)80%～90%。

大連理工大學(xué)的袁文杰[21]馴化了一株馬克斯克魯維酵母K.marxianusYX01用于乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)。通過對(duì)該菌株的產(chǎn)菊粉酶培養(yǎng)條件的研究，在最佳產(chǎn)酶條件下，即菊粉濃度為235 g/L時(shí)，乙醇最終濃度達(dá)到92.2 g/L，轉(zhuǎn)化率為理論值的85.5%。Hu等[22]發(fā)現(xiàn)K.marxianusPT-1在35℃和40℃條件下的菊芋粉發(fā)酵效率相近，經(jīng)過48 h的批式發(fā)酵，乙醇最高濃度達(dá)到74.4 g/L，乙醇得率為理論值的90.0%。Kim等[23]將整個(gè)菊芋作為生物質(zhì)乙醇生產(chǎn)原料，包括莖桿處理得到的葡聚糖以及塊莖中的菊粉分別用K. marxianusCBS1555進(jìn)行乙醇發(fā)酵，批式補(bǔ)料發(fā)酵工藝后產(chǎn)出的乙醇濃度為 70.2 g/L，最高乙醇得率為0.265 g/g總菊芋生物質(zhì)，轉(zhuǎn)化率為理論值的83.6%。Bajpai等[24]發(fā)現(xiàn)固定化的馬克斯克魯維酵母對(duì)乙醇發(fā)酵性能高于游離細(xì)胞。酵母細(xì)胞未固定時(shí)，在25℃～35℃溫度條件下乙醇得率較為穩(wěn)定，溫度超過35℃后，發(fā)酵能力迅速下降。酵母細(xì)胞固定后，在25℃～45℃溫度下乙醇得率都很穩(wěn)定，在40℃時(shí)達(dá)到峰值。

菊芋具有耐旱、耐鹽的特點(diǎn)，可以不占用耕地，還可以促進(jìn)我們荒漠地帶和灘涂地的開發(fā)，有利于減少水土流失 ，促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。與淀粉質(zhì)原料相比，菊芋是燃料乙醇產(chǎn)業(yè)規(guī)?；l(fā)展的理想原料之一。利用克魯維酵母直接發(fā)酵菊粉生產(chǎn)乙醇的一步法工藝，省去了菊粉的酸解或酶解過程，降低過程成本；同時(shí)，一步法工藝可以防止菊粉酶解產(chǎn)物的抑制現(xiàn)象，具有良好的工業(yè)發(fā)展前景。

3 高效乙醇發(fā)酵馬克斯克魯維酵母菌株的選育與改良

3.1 高效乙醇發(fā)酵馬克斯克魯維酵母菌株的選育

長(zhǎng)期以來，高效的乙醇發(fā)酵高溫酵母的選育主要來自于自然界篩選結(jié)合高溫馴化，目前已從各種酒精發(fā)酵產(chǎn)物、奶制品或乳酸發(fā)酵液中篩選得到數(shù)量可觀的馬克斯克魯維酵母菌株。王遠(yuǎn)微等[25]從川西北部分牧區(qū)的 10份傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶樣品分離得到16株馬克斯克魯維酵母。李新玲等[26]從新疆天潤(rùn)公司西山奶牛場(chǎng)原料乳中分離、純化得到一株K. marxianus var. marxianusA3，該菌株生長(zhǎng)速度快，8 h后即達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。從酒精飲料中分離得到的馬克斯克魯維酵母也有不少，如分離自香蕉酒精飲料的K. marxianusNRRL Y-6860[5]，分離自柑橘皮壓榨汁的K. marxianusNRRL Y-6373[5]。

高溫篩選是得到性能優(yōu)良馬克斯克魯維酵母的有效途徑，多數(shù)的克魯維酵母菌株都可在大于30℃，如37℃、42℃、45℃、50℃和52℃等高溫條件下，通過底物篩選或富集培養(yǎng)的方法篩選得到。Margaritis等[27]對(duì)8株K. marxianus的木糖發(fā)酵乙醇能力進(jìn)行了分析，其中1株K. marxianusSUB-80-S菌株表現(xiàn)最為突出，能在48 h內(nèi)將20%木糖全部消耗，乙醇轉(zhuǎn)化率為0.28 g/g木糖，是理論值的55%。Banat等[28]通過富集培養(yǎng)方法成功地分離得到幾株高溫酵母：K. marxianusIMB1，IMB2，IMB3，IMB4，IMB5，這些菌株均能在高達(dá)52℃高溫條件下生長(zhǎng)，并能在45℃和50℃高溫下進(jìn)行乙醇發(fā)酵。從甘蔗汁的乙醇發(fā)酵液中分離到的K. marxianusDMKU 3-1042能夠在 40℃和 45℃利用苷蔗汁發(fā)酵產(chǎn)出高濃度的乙醇[29]。Grba等[30]對(duì)5株K. marxianus菌株利用脫蛋白乳清生產(chǎn)乙醇的能力進(jìn)行了分析，從中篩選到兩株優(yōu)秀菌株K. marxianusVST 44和ZIM 75。Hu[22]等以洋姜莖桿和塊莖以及水果為原料，在40℃高溫孵育 5 d后，篩選得到發(fā)酵性能優(yōu)于S. cerevisiaeJZ1C的K. marxianusPT-1。從甘蔗渣水解液中分離得到的K. marxianusDMB1能在48℃高溫下生長(zhǎng)并發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，且48℃條件下乙醇得率（0.467 g/g總糖）高于30℃（0.415 g/g總糖）[31]。

3.2 馬克斯克魯維酵母菌株的改良

雖然部分自然篩選得到的馬克斯克魯維酵母菌株能在高溫條件下進(jìn)行乙醇的發(fā)酵，但多數(shù)菌株在某些方面卻表現(xiàn)出一定的不足，如耐醇能力較低，不能進(jìn)行高濃度乙醇的生產(chǎn)；部分菌株雖能在高溫條件下生長(zhǎng)，但其發(fā)酵效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于釀酒酵母；不能直接利用木糖、長(zhǎng)鏈葡萄糖寡糖等底物；底物反饋抑制等因素降低乙醇發(fā)酵效率。為了獲得能應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的性能優(yōu)良的發(fā)酵菌株，研究人員廣泛地采取分子生物學(xué)手段提高馬克斯克魯維酵母的乙醇發(fā)酵能力。

3.2.1 基因重組技術(shù)用于馬克斯克魯維酵母菌株的改良

基因重組技術(shù)是分子生物學(xué)的基本手段，研究人員可借其深入了解馬克斯克魯維酵母菌株的生理生化性能，同時(shí)為工業(yè)菌株的改良向可控方向發(fā)展提供了良好的技術(shù)保障。馬克斯克魯維酵母與釀酒酵母、乳酸克魯維酵母具有很近的親緣關(guān)系，最初對(duì)馬克斯克魯維酵母的基因重組操作多數(shù)是參照后二者的成功經(jīng)驗(yàn)。目前，應(yīng)用于馬克斯克魯維酵母菌株的轉(zhuǎn)化方法主要為釀酒酵母改良電轉(zhuǎn)化法和醋酸鋰方法。1984年，研究人員對(duì)克魯維酵母外源基因?qū)敕椒ㄟM(jìn)行了初步嘗試[32]。隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)來源于K. drosophilarum的質(zhì)粒pKD1的基因組成與釀酒酵母的2μ質(zhì)粒很相似，含有3個(gè)開放閱讀框、一對(duì)反向重復(fù)序列（IR序列）、自主復(fù)制序列（Autonomously replicating sequence, ARS）和一個(gè)順式作用元件。不同的是，pKD1不能在釀酒酵母中自主復(fù)制，而能夠在K. lactis中自主復(fù)制，并且在宿主菌中極其穩(wěn)定。經(jīng)過特定的改造，包括引入抗性基因和篩選基因等操作，pKD1被成功轉(zhuǎn)化至馬克斯克魯維酵母K. marxianusCBS 6556和CBS 712菌株中并保持遺傳穩(wěn)定性。雖然pKD1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率仍然相當(dāng)?shù)?，但是以該質(zhì)粒為基礎(chǔ)的改良載體成為之后馬克斯克魯維酵母菌株表達(dá)質(zhì)粒的首選?；趐KD1改良的穿梭載體pKDU7能在多個(gè)Kluyveromyces和Saccharomyces菌株中表達(dá)外源基因，通過對(duì)質(zhì)粒中各個(gè)元件的分析，發(fā)現(xiàn)pKD1任何一個(gè)功能元件被打斷后形成的質(zhì)粒都極不穩(wěn)定，pKD1所有重要功能元件的完整性對(duì)于pKDU7的穩(wěn)定性與轉(zhuǎn)化效率起到關(guān)鍵作用。

除了通過利用質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法外，線性PCR片段也被成功轉(zhuǎn)化至馬克斯克魯維酵母菌株中。在轉(zhuǎn)化過程中添加DNA轉(zhuǎn)運(yùn)載體，Nonklang等[33]將含有S.cerevisiae的ScURA3線性DNA片段成功重組至URA3缺陷型菌株K. marxianus的基因組上，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)4.2 × 103個(gè)菌落/μg DNA。同時(shí)，在S. cerevisiae和K. lactis菌株中成熟運(yùn)用的Cre-loxP重組交換系統(tǒng)也被用于K. marxianusCBS 6556的基因交換[34]，基因組上LAC4基因序列被成功敲除。

除優(yōu)良的基礎(chǔ)表達(dá)元件-自主復(fù)制序列（ARS）外，外源基因的表達(dá)強(qiáng)度還依賴于啟動(dòng)子的強(qiáng)度以及信號(hào)肽能否及時(shí)有效地將外源蛋白分泌至培養(yǎng)基中。外源蛋白分泌到細(xì)胞外，不僅能有效減少冗余蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的毒害性，同時(shí)也可以加強(qiáng)目的蛋白的有效富集，便于酶蛋白的下游收集與純化工作。到目前為止，已開展了大量的工作用于尋找馬克斯克魯維酵母表達(dá)外源蛋白的理想啟動(dòng)子和信號(hào)肽序列。Bergkamp等[35]基于馬克斯克魯維酵母良好的菊粉酶生產(chǎn)分泌能力，將菊粉酶的啟動(dòng)子（INU）和信號(hào)肽序列用于外源α-半乳糖苷酶基因的高效表達(dá)。相比釀酒酵母PGK和GAL7啟動(dòng)子，在INU調(diào)控下蛋白生產(chǎn)量可達(dá)153 mg/L，且99%的目的蛋白都分泌到培養(yǎng)基中。該啟動(dòng)子的另一優(yōu)勢(shì)還在于通過改變碳源的添加時(shí)間可以控制外源蛋白的表達(dá)時(shí)間。Pecota等[36]也嘗試用四環(huán)素可抑制啟動(dòng)子系統(tǒng)來調(diào)控外源蛋白的表達(dá)。這一系統(tǒng)不需要特定的誘導(dǎo)物，外源蛋白在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期基本不表達(dá)，在生長(zhǎng)期后期外源蛋白濃度迅速增加，外源蛋白的表達(dá)不會(huì)抑制宿主的繁殖。除了誘導(dǎo)型啟動(dòng)子外，研究人員也分析了組成型啟動(dòng)子在馬克斯克魯維酵母蛋白表達(dá)效率，如嘌呤-嘧啶通透酶基因的啟動(dòng)子[37]，來源于釀酒酵母的組成型啟動(dòng)子 PCYC、PTEF、PGPD和PADH等[38]。

目前，已有大量關(guān)于通過基因重組方法來提高和改善馬克斯克魯維酵母乙醇發(fā)酵能力的報(bào)道，并取得一定的效果。Hong等[39]將耐熱的葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、葡萄糖苷酶引入K. marxianusNBRC1777，3個(gè)酶在宿主菌株中獲得成功表達(dá)，并以纖維二糖和羧甲基纖維素為底物產(chǎn)生乙醇量達(dá)43.4 g/L。Yanase等[12]將Trichoderma reesei的內(nèi)切葡聚糖酶和Aspergillus aculeatusβ-葡萄糖苷酶在K. marxianus表面展示表達(dá)，重組菌株在24 h內(nèi)將纖維素葡聚糖轉(zhuǎn)化成乙醇，轉(zhuǎn)化率高達(dá)92.2%。

3.2.2 原生質(zhì)體融合技術(shù)用于馬克斯克魯維酵母菌株的改良

原生質(zhì)體融合技術(shù)因其雜交效率高、遺傳信息傳遞量大等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于微生物菌種的改良，這一技術(shù)也被用于馬克斯克魯維酵母菌株的改良。Sakanaka等[40]分離到一株耐熱K. marxianusTS87菌株，將其與釀酒酵母S. cerevisiaeTS8進(jìn)行融合，但是產(chǎn)生的融合子發(fā)酵能力嚴(yán)重下降，且耐熱性也不及親本菌株。針對(duì)酵母菌株原生質(zhì)體制備困難的問題，李英軍[41]、包偉霞[42]等分別研究了親本菌株的菌齡、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶濃度對(duì)原生質(zhì)體制備與再生的影響。親本菌株的菌齡以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期早期至中期（8～12 h）較佳，太早會(huì)降低再生率，但一旦進(jìn)入穩(wěn)定期后，細(xì)胞老化，不易破壁。酶的濃度以1%～1.5%為宜，原生質(zhì)的生成率隨酶濃度升高而提高，但再生率則相反。常用的滲透壓穩(wěn)定劑有KCl、NaCl等無機(jī)鹽和蔗糖、甘露醇、山梨醇等，不同的穩(wěn)滲劑對(duì)原生質(zhì)體的制備影響不大，但對(duì)再生率有一定的影響，可根據(jù)不同的菌株進(jìn)行選擇。

4 馬克斯克魯維酵母的乙醇發(fā)酵工藝

目前乙醇發(fā)酵工藝已經(jīng)相當(dāng)成熟，K. marxianus生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵培養(yǎng)方式也有不少：不同底物濃度下的批式發(fā)酵（Batch fermentation）、補(bǔ)料批式發(fā)酵（Fed-batch）、連續(xù)式發(fā)酵（Continuous system）、分步發(fā)酵（Separate hydrolysis and fermentation）、同步糖化發(fā)酵（Simultaneous saccharification and fermentation, SSF）等。目前，實(shí)驗(yàn)室多數(shù)采用批式發(fā)酵和同步糖化發(fā)酵方法來研究K. marxianus的乙醇發(fā)酵能力[5-7,10-14,16]。

4.1 批式發(fā)酵和補(bǔ)料批式發(fā)酵

批式發(fā)酵，是指每一次發(fā)酵通過一個(gè)批次完成?；玖鞒倘缦拢簩⑺械呐囵B(yǎng)基一次性加入發(fā)酵罐中，滅菌、接種后進(jìn)行發(fā)酵。由于其操作簡(jiǎn)單，批式發(fā)酵多數(shù)在實(shí)驗(yàn)室階段尤其是小量試驗(yàn)中用于研究溫度、pH、需氧量、接種量等對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響。

補(bǔ)料批式發(fā)酵，又稱為半連續(xù)發(fā)酵或流加發(fā)酵，在發(fā)酵早期先加入部分體積的發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵菌株，發(fā)酵期間連續(xù)或間歇性地補(bǔ)加新鮮的培養(yǎng)基。補(bǔ)料批式發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)在于可以降低高深度底物的抑制、減緩中間產(chǎn)物累積產(chǎn)生的反饋抑制等對(duì)發(fā)酵過程的不良影響。Hadiyanto等[43]分析比較了批式發(fā)酵與補(bǔ)料批式發(fā)酵在K. marxianus乳清發(fā)酵乙醇的不同效率，結(jié)果顯示無論是菌株生物質(zhì)生長(zhǎng)速率還是乙醇生成量、乙醇生成速率，補(bǔ)料批式發(fā)酵都優(yōu)于前者。補(bǔ)料批式發(fā)酵后的乙醇濃度為7.9626 g/L，是批式發(fā)酵（4.6362 g/L）的1.7倍。

4.2 同步糖化發(fā)酵

批式發(fā)酵中的原料多為可以直接被酵母利用的單糖或多糖，由于馬克斯克魯維酵母不含有將木質(zhì)纖維素降解成單糖的纖維素酶，它不能直接利用木質(zhì)纖維素。同步糖化發(fā)酵即在發(fā)酵過程中添加一定量的纖維素酶，使得酶解與發(fā)酵過程同時(shí)進(jìn)行。

目前，K. marxianus通過同步糖化發(fā)酵方法生產(chǎn)乙醇的報(bào)道為數(shù)很多，利用多種不同的天然底物，如柳枝稷、大麥桔桿、麥麩、甘蔗渣等。然而，同步糖化發(fā)酵工藝中糖化溫度與發(fā)酵溫度的不一致仍是其重大缺陷，還需要大量的工作來解決這一問題以達(dá)到更優(yōu)的乙醇發(fā)酵效率。

4.3 發(fā)酵方法的優(yōu)化改良

針對(duì)目前各種不同發(fā)酵工藝存在的不足之處，對(duì)發(fā)酵工藝的改良優(yōu)化工作正在不斷開展。Tomáspejó等[6]采用的分批補(bǔ)料同步糖化方法（batch-SSF）可以直接利用含固體懸漿進(jìn)行發(fā)酵，比常規(guī)的 SSF發(fā)酵方法產(chǎn)出的乙醇多20%。Suryawati等[7]嘗試將酵母細(xì)胞固定在不同的介質(zhì)表面，如鈣凝微球、磁珠、礦物質(zhì)微珠等，可以將乙醇發(fā)酵的最佳溫度提高10℃，同時(shí)大大縮短發(fā)酵時(shí)間，提高乙醇產(chǎn)率。在同步糖化發(fā)酵工藝中添加一定量的木聚糖酶可促進(jìn)早期的酶水解過程，提高高溫酵母利用含固體懸漿液的發(fā)酵能力，乙醇得率最高達(dá)到70%。添加葡萄糖苷酶能有效地消除纖維二糖對(duì)纖維素水解酶的抑制作用，提高同步糖化發(fā)酵的乙醇濃度和產(chǎn)率[44]。改變?nèi)苎趿繉?duì)馬克斯克魯維酵母的醇發(fā)酵也有一定影響，K. marxianusYX01在通氣量為50 mL/min和100 mL/min時(shí)菌體生長(zhǎng)速度快、發(fā)酵時(shí)間縮短，然而在不通氣條件下醇轉(zhuǎn)化率則更高[21]。與好氧環(huán)境相比較，K. marxianusUFV-3在低氧和缺氧條件下乙醇得率與底物轉(zhuǎn)化效率更高[14]。

5 展 望

馬克斯克魯維酵母表現(xiàn)出的耐高溫、快速的生長(zhǎng)速率、可利用多種生物質(zhì)底物、適于高溫發(fā)酵等特性，為生物質(zhì)乙醇發(fā)酵開拓了新的發(fā)展思路。然而，目前對(duì)克魯維酵母的研究仍處于初級(jí)階段，關(guān)于該菌株的報(bào)道仍然相對(duì)較少，對(duì)高溫酵母的基礎(chǔ)代謝、生理生化特性仍有待進(jìn)一步了解與深入。要更好利用馬克斯克魯維酵母進(jìn)行高溫乙醇發(fā)酵，還需要持續(xù)不斷的研究與創(chuàng)新。針對(duì)目前存在的一些問題，對(duì)今后的研究提出幾點(diǎn)建議：

（1）在原料方面，繼續(xù)拓展可利用原料，尋找類似菊芋易水解、易繁殖，不與人畜競(jìng)爭(zhēng)的原料；進(jìn)一步分析和完善各種原料的物料特征和發(fā)酵效率，形成不同類型原料有不同的利用模式，保證各種原料的利用效率。

（2）菌株方面，積極發(fā)掘性能優(yōu)良的發(fā)酵菌株。利用分子生物學(xué)技術(shù)，逐步深入對(duì)馬克斯克魯維酵母的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)的研究，通過對(duì)優(yōu)良菌株的適當(dāng)改造，進(jìn)一步優(yōu)化高溫酵母的發(fā)酵特性，加強(qiáng)菌株的高溫發(fā)酵優(yōu)勢(shì)，縮小酶解和發(fā)酵之間的溫度變化。逐步解決發(fā)酵過程存在的毒性影響與抑制作用，例如利用外部介質(zhì)優(yōu)化菌株的發(fā)酵性能，保證發(fā)酵菌株的發(fā)酵壽命和再生能力。

（3）發(fā)酵工藝方面，優(yōu)化和完善現(xiàn)有發(fā)酵工藝。綜合幾種發(fā)酵工藝的優(yōu)點(diǎn)，例如可將間歇式發(fā)酵與同步糖化發(fā)酵結(jié)合，減緩產(chǎn)物抑制，提高原料利用率。引入高效的產(chǎn)物收集分離裝置，減緩乙醇高濃度累積產(chǎn)生的有機(jī)溶劑毒性。另一方面，將高濃度乙醇發(fā)酵應(yīng)用于高溫發(fā)酵，開發(fā)相應(yīng)的發(fā)酵工藝。

參考文獻(xiàn)：

[1] Hensing M C, Rouwenhorst R J, Heijnen J J, et al. Physiological and technological aspects of large-scale heterologous protein production with yeasts[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 1995, 67(3): 261-279.

[2] Lodder J, Kreger-Van R N. The yeasts: a taxonomic study[M]. NHPC, Amsterdam. 1952.

[3] van der Walt J P.Kluyveromyces-a new yeast genus of the Endomycetales[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 1956, 22(3): 265-272.

[4] Lane M M, Morrissey J P.Kluyveromyces marxianus: A yeast emerging from its sister's shadow[J]. Fungal Biology Reviews, 2010, 24: 17-26.

[5] Castro R C, Roberto I C. Selection of a ThermotolerantKluyveromyces marxianusstrain with potential application for cellulosic ethanol production by simultaneous saccharification and fermentation[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2014, 172(3): 1553-1564

[6] Tomás-pejó E, Oliva J M, González A, et al. Bioethanol production from wheat straw by the thermotolerant yeastKluyveromyces marxianusCECT 10875 in a simultaneous saccharification and fermentation fed-batch process[J]. Fuel, 2009, 88(11): 2142-2147.

[7] Suryawati L, Wilkins M R, Bellmer D D, et al. Effect of hydrothermolysis process conditions on pretreated switchgrass composition and ethanol yield by SSF withKluyveromyces marxianusIMB4[J]. Process Biochem, 2009, 44(5): 540-545.

[8] Rocha M V, Rodrigues T H, Melo V M, et al. Cashew apple bagasse as a source of sugars for ethanol production byKluyveromyces marxianusCE025[J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2011, 38(8): 1099-1107.

[9] García-Aparicio M P, Oliva J M, Manzanares P, et al. Second-generation ethanol production from steam exploded barley straw byKluyveromyces marxianusCECT 10875[J]. Fuel, 2011, 90 (4): 1624-1630.

[10] Moreno A D, Ibarra D, Ballesteros I, et al. Comparing cell viability and ethanol fermentation of the thermotolerant yeastKluyveromyces marxianusandSaccharomyces cerevisiaeon steam-exploded biomass treated with laccase[J]. Bioresour Technol, 2013, 135: 239-245.

[11] Pessani N K, Atiyeh H K, Wilkins M R, et al. Simultaneous saccharification and fermentation of Kanlow switchgrass by thermotolerantKluyveromyces marxianusIMB3: the effect of enzyme loading, temperature and higher solid loadings[J]. Bioresour Technol, 2011, 102(22): 10618-10624.

[12] Yanase S, Hasunuma T, Yamada R, et al. Direct ethanol production from cellulosic materials at high temperature using the thermotolerant yeastKluyveromycesmarxianusdisplaying cellulolytic enzymes[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 88(1): 381-388.

[13] Zoppellari F, Bardi L. Production of bioethanol from effluents of the dairy industry byKluyveromyces marxianus[J]. N Biotechnol, 2013, 30(6): 607-613.

[14] Silveira W B, Passos F J V, Mantovani H C, et al. Ethanol production from cheese whey permeate byKluyveromyces marxianusUFV-3: A flux analysis of oxido-reductive metabolism as a function of lactose concentration and oxygen levels[J]. Enzyme Microb Technol, 2005, 36(7): 930-936.

[15] Akta? N, Boyaci I H, Mutlu M, et al. Optimization of lactose utilization in deproteinated whey byKluyveromyces marxianususing response surface methodology (RSM)[J]. Bioresour Technol, 2006, 97(18): 2252-2259.

[16] Salman Z, Mohammad O. Ethanol production from crude whey byKluyveromyces marxianus[J]. Biochem Eng J, 2006, 27(3): 295-298.

[17] Christensen A D, Kádár Z, Oleskowicz-Popiel P, et al. Production of bioethanol from organic whey usingKluyveromyces marxianus[J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2011, 38(2): 283-289.

[18] Diniza R H S, Rodriguesb M Q R B, Fiettob L G, et al. Optimizing and validating the production of ethanol from cheese whey permeate byKluyveromyces marxianusUFV-3[J]. Biocatal Agric Biotechnol, 2014, 3(2): 111-117.

[19] Rouwenhorst R J, Visser L E, van der Baan A A, et al. Production, distribution, and kinetic properties of inulinase in continuous culture ofKluyveromyces marxianusCBS 6556[J]. Appl Environ Microbiol, 1988, 54(5): 1131-1137.

[20] Esteban B F, Mariano G G, Lorena G R, et al. Immobilization system ofKluyveromycesmarxianuscells in barium alginate for inulin hydrolysis[J]. Proc Biochem, 2001, 37(5): 513-519.

[21] 袁文杰. 克魯維酵母同步糖化發(fā)酵菊芋生產(chǎn)乙醇的研究[D]. 大連: 大連理工大學(xué), 2009, 17-74.

[22] Hu N, Yuan B, Sun J, et al. ThermotolerantKluyveromycesmarxianusandSaccharomyces cerevisiaestrains representing potentials for bioethanol production from Jerusalem artichoke by consolidated bioprocessing[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 95(5): 1359-1368.

[23] Kim S, Park J M, Kim C H. Ethanol production using whole plant biomass of Jerusalem artichoke byKluyveromyces marxianusCBS1555[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2013, 169(5): 1531-1545.

[24] Bajpai P, Margaritis A. The effect of temperature and pH on ethanol production by free and immobilized cells ofKluyveromyces marxianusgrown on Jerusalem artichoke extract[J]. Biotechnol Bioeng, 1987, 30(2): 306-313.

[25] 王遠(yuǎn)微, 張誠(chéng)民, 索化夷, 等. 傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中馬克斯克魯維酵母菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J/OL].食品科學(xué). 2014. http://www.cnki.net/kcms/detail/11. 2206.TS.20140113.1516.061.html.

[26] 李新玲, 顧瑞霞, 閆輝, 等. 馬克斯克魯維酵母的篩選鑒定與應(yīng)用[J]. 中國(guó)奶牛, 2013, 15: 44-46.

[27] Margaritis A, Bajpai P. Direct Fermentation of D-Xylose to Ethanol byKluyveromycesmarxianusStrains[J]. Appl Environ Microbiol, 1982, 44(5): 1039-1041.

[28] Banat I M. Nigam P, Marchant R. The isolation of thermotolerant fermentative yeasts capable of growth at 52oC and ethanol production at 45oC and 50oC [J]. World J Microbiol Biotechnol, 1992, 8: 259-263.

[29] Limtong S, Sringiew C, Yongmanitchai W. Production of fuel ethanol at high temperature from sugar cane juice by a newly isolatedKluyveromyces marxianus[J]. Bioresour Technol, 2007, 98(17): 3367-3374.

[30] Grba S, Stehlik-Tomas V, Stanzer D, et al. Selection of yeast strainKluyveromyces marxianusfor alcohol and biomass production on whey[J]. Chem Biochem Eng, 2002, 16(1): 13-16.

[31] Goshima T, Tsuji M, Inoue H, et al. Bioethanol production from Lignocellulosic biomass by a novelKluyveromyces marxianusstrain[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2013, 77(7): 1505-1510.

[32] Das S, Kellermann E, Hollenberg C P. Transformation ofKluyveromyces fragilis[J]. J Bacteriol, 1984, 158(3): 1165-1167.

[33] Nonklang S, Abdel-Banat B M, Cha-aim K, et al. High-temperature ethanol fermentation and transformation with linear DNA in the thermotolerant yeastKluyveromyces marxianusDMKU3-1042[J]. Appl Environ Microbiol, 2008, 74(24): 7514-7521.

[34] Ribeiro O, Gombert A K, Teixeira J A, et al. Application of the Cre-loxP system for multiple gene disruption in the yeastKluyveromycesmarxianus[J]. J Biotechnol, 2007, 131(1): 20-26.

[35] Bergkamp R J, Bootsman T C, Toschka H Y, et al. Expression of an α-galactosidase gene under control of the homologous inulinase promoter inKluyveromyces marxianus[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1993, 40(2/3): 309-317.

[36] Pecota D C, Da Silva N A. Evaluation of the tetracycline promoter system for regulated gene expression inKluyveromyces marxianus[J]. Biotechnol Bioeng, 2005, 92(1): 117-123.

[37] Ball M M, Raynal A, Guerineau M, et al. Construction of efficient centromeric, multicopy and expression vectors for the yeastKluyveromycesmarxianususing homologous elements and the promoter of a purinecytosine-like permease[J]. J Mol Microbiol Biotechnol, 1999, 1(2): 347-353.

[38] Lee K S, Kim J S, Heo P, et al. Characterization ofSaccharomyces cerevisiaepromoters for heterologous gene expression inKluyveromyces marxianus[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(5): 2029-2041.

[39] Hong J, Wang Y, Kumagai H, et al. Construction of thermotolerant yeast expressing thermostable cellulase genes[J]. J Biotechnol, 2007, 130(2): 114-123.

[40] Sakanaka K, Yan W, Kishida M, et al. Breeding a fermentative yeast at high temperature using protoplast fusion[J]. J Ferment Bioeng, 1996, 81(2): 104-108.

[41] 李英軍, 馬曉燕, 趙紅梅, 等. 馬克斯克魯維酵母原生質(zhì)體制備和再生條件的研究[J]. 釀酒科技, 2006, 7: 51-54.

[42] 包偉霞, 王靜潔, 王曉斐, 等. 釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母原生質(zhì)體制備與再生研究[J]. 中國(guó)釀造, 2010, 9: 42-44.

[43] Hadiyanto H, Ariyanti D, Aini A P, et al. Batch and fed-batch fermentation system on ethanol production from whey usingKluyveromyces marxianus[J]. Int Journal of Renewable Energy Development, 2013, 2 (3): 127-131.

[44] 梁翠誼, 許敬亮, 袁振宏, 等. 葡萄糖苷酶高溫同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇應(yīng)用研究[J]. 化學(xué)工程, 2012, 40(3): 4-7.

Studies in Biomass Ethanol Production by Kluyveromyces marxianus

CHEN Xiao-yan, XU Jing-liang, YUAN Zhen-hong, LIANG Cui-yi, ZHANG Yu
(CAS Key Laboratory of Renewable Energy, Guangzhou Institute of Energy Conversion, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510640, China)

With the advantages of low energy-cost, rapid fermentative rate, and less contaminant probabilities, ethanol fermentation at high-temperature has becomes the emerging preference for biofuel production. Compared to conventional yeast,Kluyveromyces marxianusshows the abilities of wider substrate utilization, favorable fermentative performance, powerful capability of protein secretion, suitable for molecular manipulation, which is potential for bio-ethanol production. This paper reviewed the advances ofKluyveromyces marxianusin the field of biomass ethanol production.

Kluyveromyces marxianus; biomass ethanol; DNA recombinant technology

TK6

A

10.3969/j.issn.2095-560X.2014.05.007

2095-560X（2014）05-0364-09

陳小燕（1981-），女，碩士，助理研究員，主要從事生物質(zhì)醇工程菌株構(gòu)建研究。

許敬亮（1977-），男，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事纖維素生物醇和酶工程研究。

袁振宏（1953-），男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，長(zhǎng)期從事生物質(zhì)能技術(shù)的研究、開發(fā)與管理。

梁翠誼（1986-），女，學(xué)士，助理研究員，主要從事纖維素酶菌株篩選及酶性質(zhì)研究。

張 宇（1982-），男，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事燃料乙醇等木質(zhì)纖維素資源化研究。

2014-08-01

2014-08-19

國(guó)家自然科學(xué)基金（2117623，21211140237）；國(guó)家 863計(jì)劃（2013AA065803）；中科院院地合作項(xiàng)目和廣州市科技攻關(guān)項(xiàng)目（2013J4300026）

? 通信作者：袁振宏，E-mail：yuanzh@ms.giec.ac.cn