氧濃度及 Notch 通路對大鼠纖維環(huán)細胞增殖和細胞周期的影響

·基礎研究·

氧濃度及Notch通路對大鼠纖維環(huán)細胞增殖和細胞周期的影響

馬俊，張穎，陳元元，石長貴，袁文

作者單位：200003上海，第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院骨科

通信作者：袁文yuanwenspine@163.com

【摘要】目的檢測不同氧濃度條件下椎間盤纖維環(huán)細胞Notch信號通路相關分子的表達變化，明確參與調節(jié)纖維環(huán)細胞增殖的相關靶基因。方法體外分離、培養(yǎng)大鼠纖維環(huán)細胞，運用CCK-8細胞活力檢測試劑盒、流式細胞儀檢測不同氧濃度培養(yǎng)條件下Notch信號通路抑制劑L685458(2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L)對纖維環(huán)細胞增殖及細胞周期的影響；熒光定量RT-PCR檢測不同氧濃度培養(yǎng)條件下纖維環(huán)細胞Notch信號表達水平變化。結果CCK-8結果顯示與常氧條件相比，低氧培養(yǎng)纖維環(huán)細胞時所測吸光度值明顯升高；無論常氧或低氧條件，加入Notch抑制劑干預后所測吸光度值明顯降低；流式細胞儀結果顯示與常氧條件相比，低氧培養(yǎng)纖維環(huán)細胞處于S/G2期細胞所占百分率明顯升高，加入Notch抑制劑干預后處于S/G2期細胞所占百分率明顯降低。低氧干預8～24 h后，Notch3、Notch4、Delta-like1、Delta-like3、Hes1、Hes5、Hes7 mRNA都有不同水平上調，Hey2 mRNA表達水平下調。結論低氧可以通過上調Notch信號通路的表達水平促進纖維環(huán)細胞增殖，Notch信號可能作為一個研究靶點用于延緩椎間盤退變的過程。

【關鍵詞】大鼠; 椎間盤退行性變; 細胞增殖; 受體，Notch; 細胞低氧

基金項目：上海市自然科學基金青年項目(12ZR1454900)

作者簡介：馬俊(1989— )，碩士，醫(yī)師

【中圖分類號】R 349.53 【文獻標志碼】 A

DOI【】

收稿日期：(2014-03-05)

Influences of oxygen tension and Notch signaling pathway on proliferation and cell cycle of rat annulus fibrosus cells

MAJun,ZHANGYing,CHENYuan-yuan,SHIChang-gui,YUANWen.DepartmentofOrthopaedics,ChangzhengHospital,SecondaryMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200003，China

Abstract【】ObjectiveTo observe the influences of O2 concentration on the expression levels of Notch signaling components in rat annulus fibrosus cells(AFCs), and to explore the target gene participates in controlling the proliferation process of AFCs. MethodsRat annulus fibrosus cells were harvested and cultured in vitro under hypoxia or normoxia condition. AFCs were administrated to different concontrations of Notch signal inhibitor, L685458(2 μmol/L， 4 μmol/L， 8 μmol/L)， for 8-24 h, the proliferation and cell cycle of AFCs were examined by CCK-8 assay and flow cytometry. The expression level of Notch signaling components were tested by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Results CCK-8 assay indicated that the optical density value of AFCs under hypoxia was increased when compared with under normoxia, while decreased with different concontrations of L685458 whether under hypoxia or normoxia. Flow cytometry indicated that the viability and percentage of S/G2 phase cells of AFCs under hypoxia was increased when compared with under normoxia, while decreased with different concontrations of L685458 whether under hypoxia or normoxia. When AFCs were cultured under hypoxia for 8-24 h, the expression of Notch3， Notch4， Delta-like1， Delta-like3， Hes1， Hes5， Hes7 were increased and Hey2 was decreased at mRNA level compared with under normoxia . ConclusionHypoxia promotes the proliferation process of AFCs through up-regulation of Notch signaling components, and Notch signaling may become a therapeutic target for retarding the process of disc degeneration.

【Key words】Rats; Intervertebral disc degeneration; Cell proliferation; Receptors, notch; Cell hypoxia

J Spinal Surg, 2015,13(1):50-55

椎間盤退變是臨床上引起頸腰痛的最主要原因之一。以椎間盤自身細胞為基礎的細胞治療技術在延緩椎間盤退變的進程中可能具有重要的意義[1]。椎間盤組織細胞始終生活在相對低氧的微環(huán)境中，其細胞本身也形成了一套獨特的適應機制來適應局部低氧微環(huán)境的變化[2]。Notch信號通路是一個對低氧刺激敏感、調節(jié)細胞增殖分化的經典信號通路[3]。在關節(jié)軟骨細胞中，Notch信號通路參與維持軟骨細胞的增殖過程，而在其分化過程中Notch信號及靶基因Hes5表達下調[4]。低氧微環(huán)境可以抑制骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，在這一過程中Notch信號通路被激活，Notch1表達上調；阻斷Notch1表達后骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的能力減弱[5]。目前研究證據顯示體外低氧環(huán)境可以激活Notch信號通路從而促進椎間盤細胞增殖[6]。但Notch受體、配體、靶基因眾多，目前還未完全明確具體哪些因子參與調節(jié)了椎間盤細胞的增殖過程。本實驗旨在通過檢測不同氧濃度條件下椎間盤纖維環(huán)細胞(annulus fibrosus cells，AFCs)Notch信號通路相關分子的表達變化，明確參與調節(jié)AFCs增殖的相關靶基因，為進一步體外調控AFCs增殖和人工椎間盤構建奠定基礎。

1材料和方法

1.1試劑與儀器

雄性SD大鼠購自第二軍醫(yī)大學實驗動物中心，動物實驗經過第二軍醫(yī)大學動物倫理委員會批準。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、Ⅰ型膠原酶、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、1%青霉素/鏈霉素、0.25%胰酶(含/不含EDTA，Gibco)；CO2細胞培養(yǎng)箱及低氧培養(yǎng)箱(Thermo scientific, USA)、倒置相差顯微鏡(Olympus)；4%多聚甲醛，甲苯胺藍染液。RNA提取試劑Trizol(Invitrogen)，反轉錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO)，PCR引物(Invitrogen)，Real time PCR試劑 iQ SYBR Green Supermix(BioRad)。CCK-8細胞活力檢測試劑盒(同仁公司，日本)，酶標儀(Bio-RAD,USA)，細胞周期檢測試劑盒(南京凱基生物公司)，流式細胞儀(BD公司)。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠AFCs的分離和培養(yǎng)

取3月齡雄性SD大鼠4只，腹腔內注射過量戊巴比妥鈉處死。無菌條件下整塊取出腰段脊柱，分離椎間盤，小刮匙刮除啫喱狀髓核組織，留取纖維環(huán)。PBS 清洗2次，用眼科剪將纖維環(huán)剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入不含EDTA的胰酶預消化20 min，之后加入20 mL 0.15%Ⅰ型膠原酶，在37℃搖床中繼續(xù)消化。消化1 h后經200目濾網過濾，收集濾液至15 mL離心管內離心5 min，去上清，將分離得到的細胞重懸于含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12完全培養(yǎng)液并接種于6 cm培養(yǎng)皿內，將濾網上未消化的纖維環(huán)組織繼續(xù)上述步驟重復消化1次，將細胞置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，2～3 d換液1次，約12 d時細胞達到完全匯合。細胞生長完全匯合以后進行傳代。本研究均使用單層培養(yǎng)的第三代AFCs。

1.2.2大鼠AFCs甲苯胺藍染色

細胞爬片成功后去除培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛室溫固定10 min；PBS沖洗1次，滴加甲苯胺藍染液，室溫染色30 min，用自來水輕柔潤洗數秒，蒸餾水洗2次，冷風吹干。

1.2.3實驗分組

將體外培養(yǎng)的第三代AFCs分為2組。A組：常氧培養(yǎng)組(21% O2，5%CO2，74%N2)；B組：低氧培養(yǎng)組(1% O2，5%CO2，94%N2)，分別于干預后8～24 h行相關檢測。

1.2.4CCK-8檢測不同氧濃度干預后AFCs增殖情況

將第三代AFCs以7.5×103/孔的密度接種到96孔板中，加入含10%FBS的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h使細胞貼壁后加入不同濃度的Notch通路抑制劑L685458(2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L)，空白對照組不加入藥物，陰性對照組不加纖維環(huán)細胞，每個濃度梯度設置6個復孔，分別在常氧和低氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后換液，PBS沖洗各孔1次，將CCK-8試劑和完全培養(yǎng)基按1∶10體積比配制成工作液，每孔加入110 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后用酶標儀檢測480 nm處的吸光度(optical density，OD)值。

1.2.5流式細胞儀檢測不同氧濃度干預后AFCs細胞周期變化

將第三代纖維環(huán)細胞以1.0×105/孔的密度接種到6 cm培養(yǎng)皿中，隔天換液。待細胞生長至50%～60%融合時，加入4 μmol/L Notch通路抑制劑L685458，后分別置于低氧和常氧條件下培養(yǎng)24 h，PBS清洗1次，消化、離心，收集并調整細胞濃度為1×106/mL。制備的單細胞懸液用體積分數為70%的冰乙醇固定，4℃過夜。進行細胞周期測定前，用PBS洗去固定液；加100 μL RNase A 37℃水浴30 min；再加入400 μL PI染色混勻，4℃避光孵育30 min，上機檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光，分析細胞周期各時相百分比。每處理組2個重復，實驗重復3次。

1.2.6Real-time PCR檢測Notch信號相關分子mRNA表達水平

將第三代纖維環(huán)細胞等密度接種至10 cm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待細胞生長至約80%融合時，將其分別置于低氧和常氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)8～24 h收集細胞。Trizol抽提細胞總RNA，運用ReverTra Ace qPCR RT Kit進行逆轉錄反應，37℃ 15 min，98℃ 5 min，反應結束之后，保存于-20℃以便進行后續(xù)反應。運用iQ SYBR Green Supermix進行RT-PCR反應，實驗重復3次。引物序列見表1。

表1　RT-PCR 分析所使用的引物序列

1.3統(tǒng)計學處理

2結果

2.1纖維環(huán)細胞形態(tài)學觀察及甲苯胺藍染色

原代纖維環(huán)細胞接種24 h后陸續(xù)貼壁，繼續(xù)培養(yǎng)，見貼壁細胞呈多邊形或梭形，培養(yǎng)12 d左右細胞接近融合，連續(xù)傳代。典型的第三代纖維環(huán)細胞多伸出突起，呈梭形(見圖1a,b)；纖維環(huán)細胞甲苯胺藍染色后細胞核染成紫色，胞漿染成深藍色(見圖1c,d)。

2.2CCK-8檢測結果

CCK-8細胞活力檢測顯示常氧條件下培養(yǎng)24 h后，所測OD值為0.794±0.018，低氧組OD值為0.908±0.018，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明低氧培養(yǎng)可以促進AFCs增殖。分別在常氧和低氧培養(yǎng)條件下加入不同濃度Notch抑制劑L685458(2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L)，干預24 h后所測OD值分別為：0.741±0.016、0.670±0.025、0.569±0.019、0.832±0.018、0.756±0.021、0.643±0.013，不管在低氧或是常氧培養(yǎng)條件下，與對照組相比，L685458干預后OD值明顯降低，且OD值與濃度呈負相關，各濃度之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明L685458可以抑制 AFCs增殖，濃度越大，抑制效果越明顯(見圖2)。

a: 倒置相差顯微鏡下細胞形態(tài)(×40)b: 倒置相差顯微鏡下細胞形態(tài)(×100)c:甲苯胺藍染色后細胞形態(tài)(×40)d: 甲苯胺藍染色后細胞形態(tài)(×100)

a: Morphology of AFCs under light microscope(×40)b: Morphology of AFCs under light microscope(×100)c:Morphology of AFCs under Toluidine blue staining(×40)d: Morphology of AFCs under Toluidine blue staining(×100)

圖1第三代纖維環(huán)細胞鏡下觀察和甲苯胺藍染色

Fig.1Light microscope and Toluidine blue staining of P3 annulus fibrosus cells

注：不同氧濃度培養(yǎng)條件下，各組加入不同濃度Notch抑制劑，空白對照組不加藥物，各組測得的OD值比較，**與空白對照相比，P<0.01

Note: Annulus fibrosus cells were cultured under different concentration of O2, and were added with different concentration of Notch signal inhibitor(except control group),OD values were compared between different groups,**compared with control group，P<0.01

圖2不同氧濃度及Notch抑制劑對纖維環(huán)細胞增殖影響

Fig.2Influences of different concentration of O2and Notch signal inhibitor on cell proliferation process of annulus fibrosus cells

2.3流式細胞儀檢測結果

常氧培養(yǎng)條件下空白對照組AFCs處于G1期、S/G2期細胞所占百分比分別為(75.48±0.85)%、(24.52±0.85) %，而4 μmol/L Notch抑制劑干預后處于G1期、S/G2期細胞所占百分比為(83.09±1.65) %、(16.91±1.65) %，Notch抑制劑干預后處于G1期細胞所占百分比明顯升高(P<0.01)，處于S/G2期細胞所占百分比明顯下降(P<0.01)，各期兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。低氧培養(yǎng)條件下空白對照組G1期、S/G2期細胞所占百分比為(71.93±1.57)%、(28.08±1.57)%，而4 μmol/L Notch抑制劑干預后處于G1期、S/G2期細胞所占百分比為(87.50±1.47)%、(12.50±1.47)%，Notch抑制劑干預后處于G1期細胞所占百分比明顯升高(P<0.01)，處于S/G2期細胞所占百分比明顯下降(P<0.01)，各期兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義。與常氧培養(yǎng)相比，低氧培養(yǎng)條件下AFCs處于G1期細胞所占百分比明顯下降(P<0.05)，S/G2期細胞所占百分比明顯升高(P<0.05)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖3)。

2.4Notch信號熒光定量RT-PCR結果

以GAPDH作為內參，獲得目的基因和GAPDH的Ct值，通過取兩者差值ΔCt，再取2-ΔCt作為相對表達量的值，計算出各時間點Notch信號相關分子的相對表達量。結果發(fā)現AFCs表達Notch受體Notch1、Notch2、Notch4、Notch4，Notch配體Jagged1、Delta-like1、Delta-like3，Notch靶基因Hes1、Hes5、Hes7、Hey1、Hey2，而不表達Notch配體Jagged2、Delta-like4及靶基因Hes2(結果未列出)。AFCs在低氧干預8 h后，Notch4及Jagged1 mRNA表達水平上調，與常氧對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，配體Delta-like3及靶基因Hes7 mRNA表達水平有上升趨勢，但與常氧對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；AFCs在低氧干預24 h后，Notch3、Notch4、Delta-like1、Delta-like3、Hes1、Hes5、Hes7 mRNA都有不同水平上調，與常氧對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而Hey2 mRNA表達水平明顯下調，與常氧對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。不同氧濃度培養(yǎng)條件下，AFCsNotch1、Notch2及靶基因Hey1 mRNA表達水平無明顯改變(見圖4)。

注：不同氧濃度培養(yǎng)條件下，各組加入4 μmol/L Notch抑制劑，空白對照組不加藥物，測得各組細胞周期各期所占百分比比較，**與空白對照相比，P<0.01；*與空白對照相比，P<0.05

Note: Annulus fibrosus cells were cultured under different concentration of O2, and were added with 4 μmol/L Notch signal inhibitor(except control group), percentage of G1 and S/G2 phase were compared between different groups,** compared with control groupP<0.01；* compared with control groupP<0.05

圖3不同氧濃度培養(yǎng)下Notch抑制劑對纖維環(huán)細胞細胞周期影響

Fig.3Influences of different concentration of O2and Notch signal inhibitor on cell cycle of annulus fibrosus cells

3討論

研究椎間盤細胞增殖和細胞外基質合成的機制對延緩椎間盤退變有十分重要的意義。椎間盤中從外層纖維環(huán)到內層髓核，形成了一個氧濃度逐漸減低的濃度梯度，體內外局部的低氧環(huán)境對椎間盤細胞正常功能和基質代謝有重要的影響[7]。本實驗通過CCK-8和流式細胞儀檢測證實體外低氧微環(huán)境可以促進大鼠椎間盤纖維環(huán)細胞的增殖，這與Hiyama等[6]報道的結果是類似的。Yang等[8]也證實低氧培養(yǎng)更有利于人已退變的髓核細胞維持其增殖的潛能。Huang等[9]將來源于猴的椎間盤細胞置于不同氧濃度條件下培養(yǎng)，發(fā)現椎間盤細胞低氧培養(yǎng)(3.5%O2)時增殖率明顯高于常氧培養(yǎng)(20% O2)，但在連續(xù)培養(yǎng)10 d之后，椎間盤細胞凋亡率明顯增加。Bertolo等[10]將人退變椎間盤細胞接種至海藻酸鹽凝膠微球中培養(yǎng)，發(fā)現低氧條件(2%O2)并不能促進椎間盤細胞增殖。由此可見，氧濃度調節(jié)椎間盤細胞的增殖是一個相對復雜的過程，筆者推測上述實驗之所以取得不同的結果，可能與各學者選擇的細胞種屬、細胞培養(yǎng)方法和氧濃度不同有關。

注：Nx，常氧培養(yǎng)；Hx，低氧培養(yǎng)；ns，與Nx組相比P>0.05；*與Nx組相比P<0.05

Note: Nx,21% O2; Hx,1% O2; ns, compared with control groupP>0.05; * compared with control groupP<0.05

圖4不同氧濃度培養(yǎng)對纖維環(huán)細胞Notch信號mRNA表達影響

Fig.4Notch signal mRNA expression levels of annulus fibrosus cells under different concentration of O2

Notch信號通路是一個對低氧刺激敏感，調節(jié)干細胞、腫瘤細胞增殖分化的經典信號通路[3, 11]。Notch受體與配體結合后可以引起受體胞內段解離，從而激活下游靶基因，運用Notch信號抑制劑干預后可以阻斷其受體胞內段解離，從而達到阻斷Notch信號的目的。本實驗中應用不同濃度Notch信號抑制劑干預AFCs后，發(fā)現AFCs增殖過程被抑制，且濃度越高，抑制效應越明顯，說明Notch信號通路參與調節(jié)了AFCs的增殖過程。同時還發(fā)現，在低氧培養(yǎng)條件下，Notch抑制劑對AFCs增殖的抑制效果更明顯。體內椎間盤細胞生活在一個低氧張力的環(huán)境中，因此有理由相信低氧可以通過激活Notch信號通路而參與調節(jié)椎間盤細胞增殖的過程。在一些神經干細胞中，局部低氧環(huán)境可促進低氧誘導因子-1α和Notch受體胞內段結合，促進Notch下游靶基因的轉錄，從而維持干細胞的未分化狀態(tài)[11]。椎間盤細胞持續(xù)也表達低氧誘導因子-1α[12]，但椎間盤細胞中低氧誘導因子-1α是否具有類似效應還不得而知。

鑒于Notch信號通路配體、受體、靶基因數目眾多，為了篩選出參與調節(jié)AFCs增殖過程可能的信號分子及氧濃度對其表達水平的影響，本研究通過熒光定量PCR鑒定了AFCs在不同氧濃度培養(yǎng)條件下Notch信號表達水平變化。結果發(fā)現在低氧培養(yǎng)條件下，AFCs Notch受體Notch3、Notch4，配體Jagged1、Delta-like1、Delta-like3及靶基因Hes1、Hes5、Hes7 都有不同水平上調，其中以Hes5上升趨勢最為明顯。與此同時，靶基因Hey2 mRNA表達下調。AFCs中Notch信號表達水平與同樣處于低氧環(huán)境中的關節(jié)軟骨細胞類似，而在關節(jié)軟骨細胞中，Hes5參與調節(jié)其增殖分化過程[4]。Hes1參與調節(jié)多種干細胞增殖分化的過程[13]，低氧誘導因子-1α與Notch受體胞內段結合后再與Hes1基因啟動子結合，維持干細胞的未分化狀態(tài)[11]。Hes1也參與小鼠胚胎干細胞的分化過程，低水平Hes1促進胚胎干細胞向神經元細胞分化，而高水平的Hes1促進胚胎干細胞向中胚層細胞分化[14]。由此可知Notch信號通路靶基因在調節(jié)細胞增殖分化方面發(fā)揮著十分重要的作用。

本實驗探討了氧濃度及Notch信號對AFCs增殖的影響，證明體外低氧環(huán)境和Notch信號參與調節(jié)AFCs的增殖過程。在以自體椎間盤細胞為基礎的針對椎間盤退變的細胞治療中，如何在體外培養(yǎng)條件下獲得較多的椎間盤細胞、維持細胞的正常表型是一個懸而未決的問題。有文獻證實，在成人退變椎間盤中也存在成體干細胞，在合適誘導條件下可以向椎間盤細胞分化，不斷補充椎間盤細胞的數目[1]。體外利用基因工程方法、某些生長因子的誘導作用、特殊的三維培養(yǎng)方法、培養(yǎng)條件的改良等都可以達到促進椎間盤細胞增殖、維持正常表型表達的目的。本實驗結果顯示，通過局部低氧環(huán)境的刺激或者通過基因工程方法使椎間盤細胞某些Notch靶基因(如Hes5)過表達，可能起到促進椎間盤細胞增殖的作用，這也為椎間盤退變的細胞學治療提供了另一種可行的方法。當然，本實驗僅在mRNA水平對不同氧濃度下AFCs Notch通路受體、配體和靶基因表達水平改變做了初步探討，其蛋白質表達水平是否也具有一致的改變還不明確，Notch靶基因參與AFCs增殖調控的具體機制、低氧誘導因子-1α是否也參與這一過程還有待后續(xù)實驗進一步證實。

參 考 文 獻

[1] Risbud MV, Guttapalli A, Tsai TT, et al. Evidence for skeletal progenitor cells in the degenerate human intervertebral disc[J]. Spine (Phila Pa 1976), 2007, 32(23): 2537-2544.

[2] Risbud MV, Schipani E, Shapiro IM. Hypoxic regulation of nucleus pulposus cell survival: from niche to notch[J]. Am J Pathol, 2010, 176(4): 1577-1583.

[3] Silvan U, Díez-Torre A, Arluzea J, et al. Hypoxia and pluripotency in embryonic and embryonal carcinoma stem cell biology[J]. Differentiation, 2009, 78(2-3): 159-168.

[4] Karlsson C, Jonsson M, Asp J, et al. Notch and HES5 are regulated during human cartilage differentiation[J]. Cell Tissue Res, 2007, 327(3): 539-551.

[5] Xu N, Liu H, Qu F, et al. Hypoxia inhibits the differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts by activation of Notch signaling[J]. Exp Mol Pathol, 2013, 94(1): 33-39.

[6] Hiyama A, Skubutyte R, Markova D, et al. Hypoxia activates the notch signaling pathway in cells of the intervertebral disc: implications in degenerative disc disease[J]. Arthritis Rheum, 2011, 63(5): 1355-1364.

[7] Chen JW, Li B, Yang YH, et al. Significance of hypoxia in the physiological function of intervertebral disc cells[J]. Crit Rev Eukaryot Gene Expr, 2014, 24(3): 193-204.

[8] Yang SH, Hu MH, Sun YH, et al. Differential phenotypic behaviors of human degenerative nucleus pulposus cells under normoxic and hypoxic conditions: influence of oxygen concentration during isolation, expansion, and cultivation[J]. Spine J，2013, 13(11): 1590-1596.

[9] Huang S, Leung VY, Long D, et al. Coupling of small leucine-rich proteoglycans to hypoxic survival of a progenitor cell-like subpopulation in Rhesus Macaque intervertebral disc[J]. Biomaterials, 2013, 34(28): 6548-6558.

[10]Bertolo A, Ettinger L, Aebli N, et al. The in vitro effects of dexamethasone, insulin and triiodothyronine on degenerative human intervertebral disc cells under normoxic and hypoxic conditions[J]. Eur Cell Mater, 2011, 21: 221-229.

[11]Gustafsson MV, Zheng X, Pereira T, et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state[J]. Dev Cell, 2005, 9(5): 617-628.

[12]Risbud MV, Guttapalli A, Stokes DG, et al. Nucleus pulposus cells express HIF-1 alpha under normoxic culture conditions: a metabolic adaptation to the intervertebral disc microenvironment[J]. J Cell Biochem, 2006, 98(1): 152-159.

[13]Grogan SP, Olee T, Hiraoka K, et al. Repression of chondrogenesis through binding of notch signaling proteins HES-1 and HEY-1 to N-box domains in the COL2A1 enhancer site[J]. Arthritis Rheum, 2008, 58(9): 2754-2763.

[14]Kobayashi T, Mizuno H, Imayoshi I, et al. The cyclic gene Hes1 contributes to diverse differentiation responses of embryonic stem cells[J]. Genes Dev, 2009, 23(16): 1870-1875.

(本文編輯于倩)