RNA干擾YWHAZ基因?qū)Y(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞增殖的影響

張成才，宋艷艷，周夢嬌，崔志倩，張西臣，邢沈陽

(1. 吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院動物科學(xué)系，吉林 長春 130062；2. 吉林大學(xué)第二醫(yī)院腎病內(nèi)科，吉林 長春 130041；3. 吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)系，吉林 長春 130062)

RNA干擾YWHAZ基因?qū)Y(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞增殖的影響

張成才1，宋艷艷2，周夢嬌1，崔志倩1，張西臣3，邢沈陽1

(1. 吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院動物科學(xué)系，吉林 長春 130062；2. 吉林大學(xué)第二醫(yī)院腎病內(nèi)科，吉林 長春 130041；3. 吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)系，吉林 長春 130062)

目的：探討中RNA干擾YWHAZ基因?qū)Y(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞增殖的影響，闡明其作用機(jī)制。方法：構(gòu)建靶向基因YWHAZ的siRNA載體重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-792、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-733、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-612和pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-505作為RNA干擾質(zhì)粒組，同時設(shè)立陰性對照質(zhì)粒組(pGPU6/GFP/Neo-shNC質(zhì)粒)；采用熒光定量PCR檢測YWHAZ mRNA的表達(dá)水平和表達(dá)抑制率；采用MTT法檢測HCT-8細(xì)胞的增殖率。結(jié)果：倒置熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率為60%。熒光定量PCR檢測，RNA干擾組YWHAZ mRNA表達(dá)水平低于陰性對照組(P<0.01)，平均抑制率為52.86%。MTT檢測，與陰性對照組比較，RNA干擾質(zhì)粒組細(xì)胞增殖率明顯降低(P<0.01)，平均細(xì)胞增殖率為68.75%。結(jié)論：干擾YWHAZ可抑制該基因的轉(zhuǎn)錄，并抑制HCT-8細(xì)胞的增殖。

YWHAZ基因；結(jié)腸腫瘤；HCT-8細(xì)胞；RNA干擾

在常見的惡性腫瘤中，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年增加趨勢，尋找特異的診斷及治療靶點(diǎn)十分重要。YWHAZ屬于14-3-3基因家族，其家族成員有7種亞型β、γ、ζ、η、ε、σ和τ，是一個在真核生物中廣泛表達(dá)的酸性蛋白家族，其中14-3-3ζ的編碼基因?yàn)閅WHAZ。研究[1-8]表明：YWHAZ在腫瘤遷移、抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)控信號傳導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用，其在胃癌、肺癌及肝癌等多種惡性腫瘤組織中均表達(dá)異常。YWHAZ與腫瘤的發(fā)生有密切的關(guān)聯(lián)，其過表達(dá)可引起抑癌基因p53表達(dá)水平下降導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[9-10]，但YWHAZ對結(jié)腸腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過干擾結(jié)腸癌細(xì)胞系中YWHAZ mRNA的表達(dá)，觀察結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖情況，采用RNAi技術(shù)了解YWHAZ對結(jié)腸癌的影響，以期為結(jié)腸癌的有效治療提供一個新的基因靶點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、質(zhì)粒和主要試劑結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；干擾YWHAZ質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成；細(xì)胞總RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海TOYOBO生物科技有限公司，F(xiàn)uGENE HD轉(zhuǎn)染試劑購自美國Promega公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自上海浩然生物技術(shù)有限公司，SYBR Green熒光定量染料購自大連Takara寶生物工程有限公司。

1.2干擾質(zhì)粒的構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)分組由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司根據(jù)NM003406基因序列設(shè)計合成干擾質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)分為RNA干擾質(zhì)粒組(干擾質(zhì)粒分別為pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-792、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-733、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-612、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-505)和陰性質(zhì)粒對照組(pGPU6/GFP/Neo-shNC)。

1.3結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染待轉(zhuǎn)細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，待細(xì)胞融合度達(dá)60%～70%時棄去上清，加入室溫孵育15 min后的干擾質(zhì)粒與FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑的混合液(轉(zhuǎn)染試劑∶質(zhì)粒=5 μL∶2 μg)及不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h。倒掉含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h。在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)情況，統(tǒng)計發(fā)光細(xì)胞數(shù)量，計算轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率=發(fā)光細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4細(xì)胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA利用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度，并調(diào)整一致。TOYOBO反轉(zhuǎn)錄體系：Total RNA 7.0 μL、RT-primer 0.5 μL、RT Enzyme Mix 0.5 μL、5×RT Buffer 2.0 μL，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80℃保存?zhèn)溆?，在進(jìn)行PCR反應(yīng)之前以1∶10稀釋。

1.5熒光定量PCR法檢測YWHAZ基因mRNA的表達(dá)水平和表達(dá)抑制率根據(jù)YWHAZ序列設(shè)計引物，上游引物：5′-ATTGAGACGGAGCTAAGAGATATCT-3′;下游引物：5′-CTCAGCCAAGTAACGGTAGTAATCT-3′;設(shè)置內(nèi)參為β-actin，內(nèi)參上游引物：5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′；下游引物：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。熒光定量PCR反應(yīng)20.0 μL體系：cDNA 2.0 μL、PCR-Master Mix 10.0 μL、PCR-F-Primer 0.5 μL、PCR-R-Primer 0.5 μL、RNase free H2O 7.0 μL，每份樣本重復(fù)3次。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)。產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^Ct值計算機(jī)自動生成原始定量結(jié)果，按照相對定量的方法，利用YWHAZ基因與內(nèi)參β-actin的定量結(jié)果計算2-ΔΔCt值，YWHAZ mRNA表達(dá)抑制率=(1-YWHAZ基因相對表達(dá)水平)×100%。

1.6MTT法檢測HCT-8細(xì)胞增殖率將含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，接種到96孔板內(nèi)(每孔200 μL，約含5×103個細(xì)胞)，每組6個重復(fù)，37℃、5%CO2培養(yǎng)12～24 h，每孔加入20 μL MTT溶液，4 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，放入搖床振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。利用酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長處測定各孔吸光度(A)值。以時間、A490值分別為橫、縱坐標(biāo)繪制生長曲線。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組平均A值/對照組平均A值×100%。

2　結(jié)　果

2.1RNA提取收集轉(zhuǎn)染后RNA干擾質(zhì)粒組及陰性質(zhì)粒對照組細(xì)胞，利用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測可知，RNA提取效果較好，5s、18s和28s條帶清晰。見圖1。

Lanes 1-4:RNA interference plasmid group; Lane 5:Negative control plasmid group.

圖1各組YWHAZ RNA表達(dá)電泳圖

Fig.1Electrophoregram of expressions of YWHAZ RNA in various groups

2.2重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率利用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，可觀察到綠色熒光(圖2，見插頁五)，表明重組的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入HCT-8細(xì)胞中，通過細(xì)胞計數(shù)，計算轉(zhuǎn)染效率為60%。

2.3各組YWHAZ mRNA表達(dá)水平和表達(dá)抑制率RNA干擾質(zhì)粒組YWHAZ mRNA表達(dá)水平分別為0.40±0.01、0.42±0.03、0.56±0.02和0.40±0.04，均低于陰性質(zhì)粒對照組(1.05±0.05)(P<0.01)；RNA干擾質(zhì)粒組YWHAZ mRNA表達(dá)抑制率分別為57.14%、55.23%、41.90%和57.14%，平均抑制率為52.86%。

2.4各組HCT-8細(xì)胞增殖率以各組HCT-8細(xì)胞A490值的平均值作為縱坐標(biāo)，以時間作為橫坐標(biāo)繪制生長曲線(圖3)。RNA干擾質(zhì)粒組HCT-8細(xì)胞7 d后A值分別為1.62±0.14、1.49±0.11、1.49±0.15和1.55±0.14，均低于陰性質(zhì)粒對照組(2.23±0.12)(P<0.01)；RNA干擾質(zhì)粒組HCT-8細(xì)胞增殖率分別為72.65%、66.82%、66.82%和69.51%，平均增殖率為68.75%。

圖3　各組HCT-8細(xì)胞生長曲線

Fig.3Proliferation curves of HCT-8 cells in various groups

3　討　論

14-3-3蛋白家族在腫瘤的形成和發(fā)展過程中扮演著重要的角色，研究[11]表明：其可以調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用并作為信號分子參與到腫瘤生長過程中。在其家族基因中，14-3-3σ已被證實(shí)為抑癌基因[12]，14-3-3β與14-3-3γ也被證明有促進(jìn)腫瘤形成的作用[13]。作為一個潛在的原癌基因[14]，YWHAZ基因?qū)δ[瘤的影響及作用機(jī)制正逐步成為一個新的研究方向。Bajpai等[15]在對食管鱗狀上皮癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)的研究中發(fā)現(xiàn)：14-3-3ζ在ESCC組織中呈高表達(dá)。TsuKamoto等[16]對轉(zhuǎn)染miRNA-375的胃癌細(xì)胞中14-3-3ζ mRNA和蛋白表達(dá)的研究表明：14-3-3ζ有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的作用。Maxwell等[17]在CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強(qiáng)的松)化療方案耐藥細(xì)胞系的研究結(jié)論也與這一觀點(diǎn)一致。這些研究結(jié)果均表明YWHAZ與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)。

YWHAZ基因在結(jié)腸癌的相關(guān)研究中報道較少，本實(shí)驗(yàn)利用RNAi技術(shù)特異性識別并降解具有同源序列mRNA的能力，觀察干擾YWHAZ基因后，其在結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平及細(xì)胞增殖水平的差異。本研究結(jié)果顯示：在HCT-8細(xì)胞中，YWHAZ mRNA的表達(dá)水平明顯下降，細(xì)胞增殖率顯著降低，說明YWHAZ基因與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有一定的聯(lián)系。研究[18-19]顯示：在肺癌細(xì)胞系中下調(diào)YWHAZ的表達(dá)水平時，細(xì)胞中Bad、Bim/Mcl和Bax等促凋亡因子表達(dá)水平升高，肺癌細(xì)胞凋亡率升高。Matta等[20-22]發(fā)現(xiàn)：14-3-3ζ蛋白通過與NF-κB、β-連環(huán)蛋白和Bcl-2結(jié)合參與到細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來提高口腔鱗狀癌細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示：結(jié)腸癌細(xì)胞增殖率降低，可能為干擾YWHAZ mRNA的表達(dá)使相應(yīng)的14-3-3ζ表達(dá)水平下降，導(dǎo)致細(xì)胞中促凋亡因子表達(dá)水平升高所致，也可能是14-3-3ζ表達(dá)水平降低造成和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中斷所致。有關(guān)YWHAZ基因在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過RNAi技術(shù)成功干擾HCT-8細(xì)胞中YWHAZ mRNA的表達(dá)水平，使得細(xì)胞增殖率顯著降低，初步了解了YWHAZ基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞的影響。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)及其他學(xué)者的研究推測：YWHAZ基因有可能作為一個新的診斷和治療結(jié)腸癌的靶點(diǎn)。

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Effect of RNA interference of YWHAZ gene on proliferation of colon cancer HCT-8 cells

ZHANG Chengcai1，SONG Yanyan2，ZHOU Mengjiao1，CUI Zhiqian1，ZHANG Xichen3，XING Shenyang1

(1. Department of Animal Science,School of Animal Science,Jilin University,Changchun 130062, China;2. Department of Nephrology,Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China; 3. Department of Preventive Veterinary Medicine,School of Veterinary Medicine, Jilin University,Changchun 130062,China)

ObjectiveTo investigate the effect of RNA interference of YWHAZ gene on the cell proliferation of colon cancer HCT-8 cells,and to elucidate the mechanism.Results Four siRNA plasmids targeting human YWHAZ gene,including pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-792,pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-733,pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-612,and pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-505, were constructed and regarded as RNA interference plasmid groups. pGPU6/GFP/Neo-shNC plasmid was regarded as negative control plasmid group. RT-PCR was used to detect the expression of YWHAZ mRNA and the inhibitory rates of HCT-8 cells; the proliferation rate of HCT-8 cells was detected by MTT method. ResultsThe transfection rate of cells was 60% under inverted fluorescence microscope;the RT-PCR results showed that the levels of YWHAZ mRNA in RNA interference plasmid groups were lower than those in negative control plasmid group(P<0.01),and the average inhibitory rate was 52.86%. The MTT results showed that compared with negative control plasmid group,the proliferation rates of HCT-8 cells in RNA interference plasmid groups were decreased (P<0.01),and the average proliferation rate was 68.75%. ConclusionInterference of YWHAZ gene might inhibit the transcription of the gene,and further inhibit the proliferation of HCT-8 cells.

YWHAZ gene;colon neoplasms;HCT-8 cells;RNA interference

1671-587Ⅹ(2015)02-0307-04

10.13481/j.1671-587x.20150220

2014-11-06

吉林省科技廳科技發(fā)展計劃項(xiàng)目資助課題(2003055025，20106044)；吉林省自然科學(xué)基金資助課題(20101585)

張成才(1989-)，男，山東省濰坊市人，在讀動物科學(xué)碩士，主要從事腫瘤遺傳學(xué)方面的研究。

邢沈陽，教授，碩士研究生導(dǎo)師(Tel:0431-87835138,E-mail:xingsy6177@163.com)

R735.3

A