DNMT3b基因多態(tài)性及其在胃癌組織中的表達水平與胃癌的關(guān)聯(lián)性分析

王 川，賈志芳，曹東慧，武 興，曹雪源，姜 晶

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院臨床流行病學(xué)研究中心，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院胃結(jié)直腸外科，吉林 長春 130021）

胃癌是我國常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均位于第3位［1］。中國成年人中有50%以上感染幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp），但只有少數(shù)個體最終發(fā)展成胃癌，提示宿主遺傳因素在胃癌的易感性方面有重要作用［2］。隨著近年來胃癌分子遺傳學(xué)研究的深入，與基因轉(zhuǎn)錄過程相關(guān)酶的基因多態(tài)性研究得到了廣泛開展。DNA甲基化是常見的表觀遺傳修飾，由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMTs）家族催化，包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b［3］。DNMT3b的主要功能是參與從頭甲基化，以非甲基化的DNA為模板，催化新的甲基化位點形成［4］。抑癌基因啟動子區(qū)CpG島如果呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，則抑癌基因失活。國內(nèi)外研究［5］顯示：胃黏膜組織中異常表達的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，可能為癌癥發(fā)生的早期階段創(chuàng)造了條件。個體單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）差異可能使DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達水平不同，從而使得個體對腫瘤的易感性存在差異。已有研究［6－7］結(jié)果顯示：DNMT3b基因多態(tài)性與人類結(jié)直腸癌、肺癌等腫瘤易感性有關(guān)。目前國內(nèi)對DNMT3b基因多態(tài)性的研究多局限于啟動子區(qū)或單個SNPs位點。本研究選擇DNMT3b基因的5個SNPs位點，采用病例對照研究方法，探討DNMT3b基因多態(tài)性是否影響其蛋白表達水平及其與胃癌的關(guān)系，為胃癌的病因?qū)W研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 采用病例對照設(shè)計。病例組為2008—2010年本院收治的胃癌患者，共447例。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：來自吉林省長春市，中國北方漢族人，年齡30～90歲，在本院胃結(jié)直腸外科行手術(shù)治療，并經(jīng)病理報告明確診斷為非賁門部胃癌；其中男性322例，女性125例，年齡35～90歲，平均年齡（61.70±11.09）歲。對照組為同時期在本院體檢中心體檢的健康對照者，共961名，其中男性564名，女性397名，年齡35～79歲，平均年齡（50.40±8.51）歲。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：血清Hp－IgG檢測陰性（＜30EIU），無萎縮性胃炎和惡性腫瘤史，常規(guī)體檢結(jié)果均正常，按年齡、性別頻數(shù)匹配挑選。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡小于30歲或大于90歲者，非中國漢族北方人群，并發(fā)其他嚴(yán)重疾病可能會影響到胃癌病情進展者。所有受試者均知情同意，研究方案經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器 HpIgG抗體（Biohit公司，芬蘭），全血基因組DNA提取試劑盒（Axygen公司，美國）；Multiskan GO1510全波長酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientifc公司，美國），S1000TM熱循環(huán)儀（Bio－Rad公司，美國）。基因分型檢測由美國Applied Biosystems公司完成。

1.3 Hp感染檢測和基因組DNA提取 采集所有研究對象外周血500μL并冷凍保存（EDTA K2抗凝，－80℃）。酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測所有研究對象血清中HpIgG抗體（Biohit公司，芬蘭），使用Multiskan GO 1510全波長酶標(biāo)儀檢測450nm波長處的吸光度（A）值，計算樣本的酶免疫單位（EIU）數(shù)值，結(jié)果≥30EIU判定為陽性。使用Axyprep血基因組DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA，按照說明書進行操作。

1.4 SNPs位點的選擇和分型 使用SNP browser軟件篩選HapMap數(shù)據(jù)庫中國漢族人群DNMT3b基因的標(biāo)簽SNP位點，要求最小等位基因頻率（MAF）＞0.10，同時r2＞0.8。共22個SNPs位點滿足 MAF＞0.10，其中18個SNPs顯示與標(biāo)簽SNPs的完全連鎖不平衡（D′＝1，r2＞0.8），最終選擇了rs6119954、rs4911107、rs4911259和rs8118663共4個標(biāo)簽SNPs位點以及基因啟動子區(qū)rs1569686位點進行測定，采用TaqMan技術(shù)確定每個SNPs位點的基因分型。BIO－RAD S1000TM熱循環(huán)儀設(shè)置的擴增程序：95°C、10min，95°C、15s，60°C、1min，共40個循環(huán)。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測胃癌組織和癌旁組織中DNMT3b多態(tài)性與基因表達的關(guān)系 采用鏈霉素－生物素－過氧化物酶法對104例胃癌患者的胃癌組織和85例患者的癌旁對照組織進行了免疫組織化學(xué)染色，由2名獨立的病理學(xué)家進行評分。采用HSCORE評分系統(tǒng)評估染色強度及特定強度范圍內(nèi)細胞染色的百分比：HSCORE＝∑Pi（i）（i＝0，1，2，3，Pi＝0～100%）。i代表腫瘤細胞的染色強度（無染色＝0，弱染色＝1，中度染色＝2，強染色＝3），Pi是每一個強度下腫瘤細胞染色的百分比，范圍0～100%。HSCORE總分為各強度得分之和，結(jié)果為0～300，依據(jù)表達水平的高低分為高表達（HSCORE＞200）、中度表達（100＜HSCORE＜200）、低表達（HSCORE≤100）和陰性（HSCORE＝0），結(jié)果以中位數(shù)（四分位數(shù)）表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用擬合優(yōu)度χ2檢驗分析對照組研究對象的基因型頻率分布是否符合Hardy－Weinberg（H－W）平衡。病例組和對照組研究對象的基因型及其他指標(biāo)的分布情況比較采用χ2檢驗或Fisher’s確切概率法。調(diào)整性別、年齡和Hp感染的作用后，采用非條件Logistic回歸分析計算基因型與胃癌危險性的OR值及95%可信區(qū)間（CI）。DNMT3b基因多態(tài)性與表達水平的關(guān)聯(lián)分析采用Mann－Whitney U 檢驗或Kruskal－Wallis H 檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 研究對象的一般特征 與對照組比較，病例組患者的年齡大，男性所占比例高，故后續(xù)的統(tǒng)計分析均調(diào)整了年齡和性別因素的影響；病例組患者中Hp抗體陽性率明顯高于對照組（69.1%vs 49.7%，P＜0.001）；病理分期方面，病例組進展期胃癌患者居多，Ⅱ、Ⅲ期共占72.7%；分化程度方面，低分化者占62.9%；Lauren分型顯示病例組腸型胃癌為主要病理類型，占68.2%。2組研究對象的一般特征見表1。

2.2 DNMT3b基因多態(tài)性與胃癌的關(guān)聯(lián)性 對照組研究對象DNMT3b的5個SNPs位點rs6119954、rs1569686、rs4911107、rs4911259和rs8118663均進行了 Hardy－Weinberg平衡檢驗，其P 值分別為 0.036、0.321、0.341、0.362和0.874。rs1569686、rs4911107、rs4911259和rs8118663均符合Hardy－Weinberg平衡，但rs6119954偏離了Hardy－Weinberg平衡，隨機挑選了100例研究者進行了實驗驗證，結(jié)果相同，故仍將該位點納入分析。調(diào)整年齡、性別和Hp感染等因素，利用非條件Logistic回歸分析DNMT3b基因多態(tài)性與胃癌的關(guān)聯(lián)結(jié)果表明：與攜帶GG基因型比較，攜帶rs6119954AA基因型的個體發(fā)生胃癌的危險性是其1.25倍（95%CI：0.86～2.10，P＝0.19）。在其他4個SNPs位點上，同樣均未發(fā)現(xiàn)DNMT3b基因多態(tài)性與胃癌的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。見表2。

表1 研究對象的一般特征Tab.1 General characteristics of subjects［n（η／%）］

2.3 DNMT3b基因多態(tài)性和胃癌組織中DNMT3b蛋白表達水平的關(guān)系 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：多數(shù)患者DNMT3b蛋白在胃癌組織的細胞核中呈高表達，僅在少數(shù)患者胃癌組織的細胞質(zhì)中呈弱表達。在胃癌組織中DNMT3b的HSCORE為180（140～240），癌旁對照組織中DNMT3b的HSCORE為90（0～240），胃癌組織中DNMT3b的表達水平顯著高于癌旁對照組織（P＜0.001）。DNMT3b基因的5個SNPs的不同基因型間DNMT3b蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

3 討 論

DNA異常甲基化導(dǎo)致的抑癌基因失活在腫瘤早期發(fā)生過程中起重要作用［8－9］。既往對DNMT3b基因多態(tài)性的研究［10］中，大都局限于啟動子區(qū)單個轉(zhuǎn)錄起始位點（如－149C→T），本研究通過SNPs數(shù)據(jù)庫篩選，挑選出覆蓋DNMT3b基因的4個標(biāo)簽SNPs，還添加了1個位于啟動子區(qū)域的SNP，更全面地分析了DNMT3b基因多態(tài)性與胃癌之間的關(guān)系。

表2 病例組和對照組DNMT3b基因型頻數(shù)分布Tab.2 Distribution of genotypic frequencies of DNMT3bin case and control groups

表3 DNMT3b基因多態(tài)性與胃癌組織中DNMT3b蛋白表達水平的關(guān)系Tab.3 Relationship between DNMT3bgene polymorphisms and expression level of DNMT3bprotein in gastric cancer tissue

Hu等［11］研究發(fā)現(xiàn)：啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始點上游－579G＞T位點（rs1569686）的基因多態(tài)性與胃癌的易感性相關(guān)，與對照組比較，攜帶G等位基因的個體患胃癌的易感性顯著降低。本研究雖然在更大規(guī)模的中國人群中進行驗證，卻未發(fā)現(xiàn)rs1569686基因多態(tài)與胃癌的易感性有關(guān)聯(lián)。有研究［12－13］顯示：DNMT3b基因啟動子區(qū)－149位的SNP（rs2424913）T等位基因變異可以使轉(zhuǎn)錄活性增加30%，使DNMT3bmRNA和蛋白表達水平升高，T等位基因攜帶者患肺癌風(fēng)險幾乎是CC型的2倍，而乳腺組織中攜帶C等位基因者更易罹患乳腺癌，因此研究者們也關(guān)注了rs2424913位點與胃癌發(fā)生的關(guān)系［10－11，14］。Aung等［15］對日本人群進行了研究，在病例組與對照組中未發(fā)現(xiàn)等位基因頻率分布的差異，這與 Wang等［10］和Hu等［11］對中國人群的研究結(jié)論一致。不同研究結(jié)果的差異可能是由于SNPs的罕見基因型頻率在不同種族間分布差異引起的，中國漢族人群和日本人群rs2424913位點的C等位基因頻率分別為1.2%和0.6%，而美國白人C等位基因的頻率為59.7%（HapMap數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果），因此以中國漢族人群和日本人群為對象的研究其檢驗效能不足，難以發(fā)現(xiàn)rs2424913和胃癌之間的關(guān)聯(lián)。由于本研究中病例組人數(shù)僅為447人，漢族人群中C等位基因的頻率也僅為1.2%，其檢驗效能遠低于0.8，因此本研究未納入該位點。Yang等［14］在中國南方人群中對DNMT3b的rs2424908SNP進行了研究，但未發(fā)現(xiàn)rs2424908SNP與胃癌發(fā)生有關(guān)聯(lián)，由于rs2424908和rs8118663有完全的連鎖不平衡（D′＝1，r2＝1），本研究則選擇rs8118663進行研究，同樣未發(fā)現(xiàn)其基因變異與胃癌發(fā)生有關(guān)聯(lián)。本研究所選取的胃癌患者均為非賁門癌，而在Yang等［14］的研究中包括了賁門癌和非賁門癌的患者，目前公認(rèn)這2種組織類型的胃癌在病因、生存和預(yù)后方面存在明顯差異，因此病例的抽樣是否導(dǎo)致結(jié)論發(fā)生偏倚還需要更大規(guī)模研究的驗證。

蛋白質(zhì)是基因表達的產(chǎn)物，其功能是參與維持DNA甲基化狀態(tài)，本文作者推測腫瘤組織中如能檢出DNMT3b蛋白的高表達，可能提示DNMT3b參與了腫瘤的形成。Su等［16－17］研究發(fā)現(xiàn)：DNMT3b主要在原發(fā)性胃腫瘤中過表達，這種表達水平上的差異與臨床病理學(xué)有關(guān)聯(lián)，同時Hp感染可能導(dǎo)致DNMT3b高表達。本課題組雖然發(fā)現(xiàn)了胃癌患者腫瘤組織中DNMT3b蛋白高表達，但未發(fā)現(xiàn)胃癌患者中攜帶不同基因型的個體腫瘤組織中DNMT3b表達的差異。因此腫瘤組織中DNMT3b高表達可能來源于表觀遺傳學(xué)改變和蛋白翻譯后修飾，而與基因多態(tài)性無關(guān)聯(lián)。

綜上所述，DNMT3b基因的rs6119954、rs1569686、rs4911107、rs4911259和rs8118663位點的SNPs與胃癌的發(fā)病風(fēng)險無關(guān)聯(lián)，并且該基因多態(tài)性與DNMT3b蛋白表達水平也無關(guān)聯(lián)，提示DNMT3b基因多態(tài)性在中國北方漢族人群中尚不能作為預(yù)測個體對胃癌易感性的遺傳標(biāo)記。

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