神經(jīng)干細胞移植聯(lián)合促紅細胞生成素對大鼠脊髓損傷的修復(fù)作用

趙 巖，肖宇龍，左 媛，王喜良，霍洪軍，江建明，閆慧博

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院脊柱外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院脊柱外科，廣東 廣州 510515；3.南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院脊柱外科，廣東 廣州 510630）

目前，脊髓損傷是神經(jīng)損傷領(lǐng)域的常見疾病，但各國醫(yī)學(xué)界對其治療仍無重大突破。近年來研究［1］結(jié)果顯示：與其他干細胞比較，神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）具有顯著優(yōu)勢，NSCs有較高的自我更新和增殖潛能，具備早期胚胎細胞特性，能夠分化為神經(jīng)系統(tǒng)的各類細胞，其被認為是一種治療脊髓損傷的理想干細胞。目前，研究［2］結(jié)果顯示：促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種新型的組織保護因子，具有神經(jīng)保護和營養(yǎng)作用。但針對NSCs移植聯(lián)合EPO是否可有效地促進脊髓損傷大鼠功能的恢復(fù)尚鮮有研究。因此，本研究將NSCs和EPO聯(lián)合用于治療大鼠脊髓損傷，探討聯(lián)合應(yīng)用治療脊髓損傷的效果是否優(yōu)于單純NSCs移植，為臨床治療脊髓損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 健康成年雌性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量（220±20）g，孕14d的Wistar大鼠2只，均由內(nèi)蒙古大學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK（蒙）2002－0001。DMEM－F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和B27補充液（美國Gibco公司），EPO（沈陽三生制藥公司），SABC免疫組織化學(xué)試劑盒、Nestin抗體和抗神經(jīng)絲 NF－200抗體（武漢博士德公司）。FITC、胰蛋白酶和25cm2培養(yǎng)瓶（美國Corning公司），外科手術(shù)器械和纖維器械1套。

1.2 NSCs原代培養(yǎng)和鑒定 實驗方法參考文獻 ［3］，將孕鼠斷頭處死，迅速在無菌條件下剖腹取出胎鼠，剪開顱骨取腦組織，在解剖顯微鏡下分離中腦、海馬和側(cè)腦室下區(qū)組織。將分離的胎鼠腦組織用D－Hank’s液浸洗，用眼科剪將胎鼠腦組織剪成1mm×1mm×1mm的小組織塊，用等體積0.125%胰酶37℃消化10～15min，反復(fù)機械吹打，然后加入雙倍體積、含10%FBS的DMEM／F12終止消化。經(jīng)200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，800r·min－1離心10min，棄去上清液。加入完全培 養(yǎng) 液 ［DMEM／F12 加 20mol· L－1B27，10μg·L－1堿 性 成 纖 維 生 長 因 子（bFGF），20μg·L－1表皮細胞生長因子（EGF）］。吹打為單細胞懸液后，以活細胞濃度為1×108L－1接種于培養(yǎng)瓶中［3］。于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7d，每隔2～3d離心、半量換液1次，將傳至3～4代的NSCs制作成細胞懸液，將細胞濃度調(diào)至1×109L－1［4－6］，行 Nestin抗原免疫組織化學(xué)和免疫熒光鑒定。

1.3 大鼠脊髓全橫斷模型的建立［7］用3.5%戊巴比妥（1.3mL·100g－1）腹腔內(nèi)注射麻醉，在無菌條件下以T8棘突為標志暴露脊髓T10節(jié)段［8－10］，用鈍頭的鉤針完整地挑起脊髓，尖刀片于大鼠T10節(jié)段處連同硬脊膜和脊髓組織一起切斷，并切除1mm脊髓節(jié)段，彎頭顯微鑷輕抬起橫斷脊髓兩斷端以明確脊髓組織完全橫斷，明膠海綿填塞脊髓損傷處。

1.4 動物分組和給藥 40只大鼠隨機分為4組，每組10只。對照組：造模后大鼠在明膠海綿中給予DMEM／F12培養(yǎng)液10μL，并腹腔注射等量生理鹽水；NSCs組：大鼠造模成功后，將制備好的NSCs懸液用臺式離心機離心5min（1000r·min－1），再用 DMEM 調(diào)整細胞濃度至1×109L－1，在損傷局部明膠海綿中注入NSCs懸液10μL，在損傷處上下各1mm范圍內(nèi)用微量注射器于0.25、0.50和0.75mm深度各注入 NSCs懸液共3μL，每個注射點0.5μL；EPO組：大鼠腹腔注射EPO 5000IU·kg－1，每天1次，連續(xù)注射7d，造模后在明膠海綿中給予DMEM／F12培養(yǎng)液10μL；NSCs＋EPO組：移植NSCs并聯(lián)合腹腔注射EPO，5000IU·kg－1，每天1次，連續(xù)注射7d。

1.5 免疫組織化學(xué)染色和FITC－NF－200免疫熒光染色觀察大鼠NSCs和脊髓組織形態(tài)學(xué) 術(shù)后大鼠存活8周，8周后應(yīng)用4%多聚甲醛磷酸鹽溶液經(jīng)心臟灌注固定，取脊髓損傷處及上下各1cm脊髓組織置于質(zhì)量分數(shù)30%蔗糖溶液中4℃過夜。部分脊髓組織常規(guī)梯度脫水、透明、石蠟包埋，切片行抗神經(jīng)纖維絲蛋白抗體NF－200免疫組織化學(xué)染色；部分脊髓組織行縱向連續(xù)冰凍切片，片厚為30μm，隔3張取1張，NF－200為一抗，行FITC熒光標記的NF－200神經(jīng)纖維絲蛋白染色。

1.6 大鼠后肢運動功能評分的檢測 應(yīng)用實驗性脊 髓 損 傷 運 動 功 能（Basso－Beattie－Bresnahan）BBB評分法［11］對大鼠后肢運動功能恢復(fù)情況進行評價，評價時間為術(shù)前12h和術(shù)后3、7、14、28、42和56d。所有數(shù)據(jù)均由2名非本研究組但熟悉本評分標準的人員進行隨機雙盲評分，取平均值作為最終得分。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。各組大鼠后肢運動功能BBB評分以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 體外培養(yǎng)的NSCs形態(tài)學(xué) 從胎鼠中腦、海馬和側(cè)腦室下區(qū)組織分離的單個細胞近似圓形、大小相近，培養(yǎng)2～3d后大多數(shù)細胞死亡，只有少數(shù)細胞進入有絲分裂期，鏡下可見明顯細胞核分裂象，分裂象的細胞逐漸聚集成團。細胞培養(yǎng)4～5d后，可見數(shù)個到數(shù)十個由細胞組成呈懸浮狀的球狀細胞團，這些細胞團體積很小，折光性強，突起不明顯，邊界清楚，大多呈褐色，邊緣見較小毛刺，稱為 “神經(jīng)干細胞球”，中心部分顏色較深，但邊緣顏色較淺（圖1A，見插頁五）。將傳代后的神經(jīng)干細胞球制備成單細胞懸液，經(jīng)2～3d培養(yǎng)，可見這些單個細胞出現(xiàn)分裂現(xiàn)象，并重新形成小的細胞團，經(jīng)5～6d培養(yǎng)，培養(yǎng)液中出現(xiàn)散在的、大小不等的神經(jīng)干細胞球，7d時形成大的神經(jīng)干細胞球，其邊界清楚、折光性強。NSCs標記性蛋白Nestin在原代和傳代培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞球中均有表達，并呈現(xiàn)綠色熒光（圖1B，見插頁五）。

2.2 大鼠損傷脊髓組織的形態(tài)學(xué) 術(shù)后8周，肉眼見損傷處脊髓組織因瘢痕組織增生而顏色變深，損傷處脊髓組織輕度萎縮（圖2，見插頁五）。橫斷處脊髓組織縱向切片NF－200染色顯示：對照組大鼠橫斷處脊髓組織殘端萎縮，橫斷區(qū)均為透明、不著色的瘢痕組織所代替，脊髓白質(zhì)和灰質(zhì)間可見大量空洞形成（圖3A，見插頁六）；NSCs＋EPO組大鼠橫斷處脊髓組織殘端輕度萎縮，橫斷區(qū)可見大量呈雜亂、無序生長的神經(jīng)纖維，并可見有連續(xù)性神經(jīng)纖維通過脊髓橫斷區(qū)，脊髓白質(zhì)和灰質(zhì)間可見少量空洞形成（圖3B，見插頁六）。對照組和EPO組大鼠未見有明顯的神經(jīng)纖維再生；NSCs組大鼠可見少量的神經(jīng)纖維再生，未通過損傷區(qū)到達尾側(cè)；NSCs＋EPO組大鼠中，F(xiàn)ITC共軛抗神經(jīng)絲蛋白抗體NF－200標記的再生神經(jīng)纖維在橫斷區(qū)頭側(cè)大量再生，呈無序狀生長，并通過損傷區(qū)到達尾側(cè)（圖4，見插頁六）。

2.3 各組大鼠后肢運動功能BBB評分 正常大鼠后肢運動功能BBB評分為21分。在本實驗中，術(shù)后3d內(nèi)4組大鼠后肢運動功能的BBB評分均為0分。而后隨著時間的推移，4組大鼠后肢運動功能BBB評分均有不同程度升高，提示大鼠后肢運動功能均出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)。尤以NSCs＋EPO組大鼠更為顯著，并呈一定規(guī)律，脊髓橫斷損傷后各組大鼠后肢運動功能喪失，1周后開始恢復(fù)，其中2～5周恢復(fù)較快，6～8周后恢復(fù)明顯減慢。術(shù)后1～4周，NSCs組和EPO組大鼠后肢運動功能BBB評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），4周后NSCs組與EPO組大鼠后肢運動功能BBB評分比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；NSCs＋EPO組大鼠后肢運動功能BBB評分高于其他各組（P＜0.05）。術(shù)后8周末，NSCs＋EPO組大鼠前、后肢運動協(xié)調(diào)、有規(guī)律，后肢腳掌可負重，但仍無法使軀體抬離地面；NSCs組大鼠前、后肢運動協(xié)調(diào)功能欠佳，只有少數(shù)大鼠后肢腳掌可負重，其余大鼠后肢腳趾呈彎曲狀，負重功能欠佳；對照組和EPO組大鼠后肢運動均為不協(xié)調(diào)、無規(guī)律的滑動。各組大鼠后肢運動功能BBB評分 見表1。

表1 各組大鼠后肢運動功能BBB評分Tab.1 BBB scores of motor function of hind limbs of rats in various groups （n＝10，）

表1 各組大鼠后肢運動功能BBB評分Tab.1 BBB scores of motor function of hind limbs of rats in various groups （n＝10，）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs NSCs group；#P＜0.05 vs EPO group.

7 14 28 42 56 Control 0.00±0.00 3.16±0.36 6.78±0.40 7.76±Group BBB score（t／d）0.46 7.90±0.45 NSCs 0.96±0.31＊# 4.79±0.46＊# 8.70±0.57＊# 9.89±0.82＊# 10.90±0.61＊#EPO 0.00±0.00 3.36±0.32 7.49±0.44 7.80±0.48 8.16±0.51 NSCs＋EPO 1.51±0.46＊△# 6.32±0.58＊△# 10.87±0.63＊# 11.70±0.72＊△# 12.61±0.64＊△#

3 討 論

脊髓損傷后很難再生修復(fù)，其主要原因包括損傷局部神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏和大量抑制性因子的分泌導(dǎo)致軸突再生的微環(huán)境遭到破壞；脊髓損傷后脊髓再生能力不足；損傷局部有膠質(zhì)瘢痕形成。如能解決上述問題則有望解決脊髓損傷后神經(jīng)修復(fù)和功能恢復(fù)的難題。自Reynolds等［12］首次在成年小鼠腦紋狀體中分離出可在體外分裂增殖、具有分化潛能的細胞群，并正式提出了 “NSCs”的概念以來，人們對其研究一直沒有中斷，并發(fā)現(xiàn)其有以下幾方面的基本特性［13－14］：可自我更新，從而維持穩(wěn)定的細胞儲備；具有多向分化潛能，可分化為神經(jīng)系統(tǒng)的各種細胞。鑒于其上述獨特的生物學(xué)特性，因此被認為是一種理想的移植種子細胞。本實驗從胎鼠腦組織中提取NSCs進行體外培養(yǎng)，觀察到其具有很好的克隆能力，并可穩(wěn)定傳代。但NSCs在體內(nèi)自然分化為神經(jīng)元的比例僅占1%，分化為膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞卻分別占31.2%和50.3%［15］，這嚴重影響NSCs移植后對脊髓損傷的修復(fù)效果。Watt等［16］和Hermanson等［17］采用各種神經(jīng)生長因子或藥物對NSCs進行體外誘導(dǎo)，但分化為神經(jīng)元的比例報道不一。近年來隨著人們對EPO研究的深入，證實其是一種新型的組織保護因子，具有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用。研究［18］結(jié)果顯示：在實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型中，EPO能夠增強少突膠質(zhì)細胞的增殖和髓鞘的再生，促進脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。袁麗麗等［19］觀察EPO對體外培養(yǎng)的大鼠NSCs凋亡和分化的影響結(jié)果顯示：EPO可降低體外培養(yǎng)的大鼠NSCs的凋亡率，促進NSCs向神經(jīng)元方向分化。盡管近些年的研究［20－22］顯示：EPO具有神經(jīng)保護、神經(jīng)營養(yǎng)的作用，但很少有人將NSCs和EPO聯(lián)合用于治療大鼠脊髓損傷。

本研究將NSCs和EPO共同作用于橫斷性脊髓損傷大鼠，利用EPO對NSCs的增殖及分化的影響，以期有效促進脊髓損傷大鼠脊髓功能的恢復(fù)，從而為臨床治療脊髓損傷提供實驗理論依據(jù)。本研究結(jié)果顯示：脊髓損傷大鼠如術(shù)后未給予任何的干預(yù)措施，自然恢復(fù)后其后肢運動功能BBB評分一般均在10分以下，大多集中在8分左右；術(shù)后8周，NSCs＋EPO組大鼠后肢功能恢復(fù)明顯優(yōu)于其他各組，對照組和EPO組大鼠后肢運動功能BBB評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；隨著時間的延長，NSCs＋EPO組大鼠后肢功能恢復(fù)更為顯著，NSCs＋EPO組大鼠在術(shù)后28d時后肢運動功能BBB評分達即可到10分以上，證明其對脊髓功能的恢復(fù)作用顯著。

目前判定損傷脊髓是否再生修復(fù)的標志是檢測是否有神經(jīng)軸突的再生，NF－200是構(gòu)成神經(jīng)細胞體和神經(jīng)軸突的框架，脊髓損傷后隨著神經(jīng)軸突的變性壞死，構(gòu)成神經(jīng)軸突框架的NF－200也隨之崩潰減少，甚至消失為空洞或為瘢痕組織所替代。本研究中術(shù)后8周NF－200免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：對照組大鼠橫斷處脊髓組織殘端萎縮，橫斷區(qū)均為透明、不著色的瘢痕組織，脊髓白質(zhì)和灰質(zhì)間可見大量空洞形成；NSCs＋EPO組大鼠橫斷處脊髓組織殘端輕度萎縮，橫斷區(qū)可見大量呈雜亂、無序生長的神經(jīng)纖維，并有連續(xù)性神經(jīng)纖維通過脊髓橫斷區(qū)，脊髓白質(zhì)和灰質(zhì)間可見少量空洞形成；NSCs＋EPO組大鼠FITC共軛抗神經(jīng)絲蛋白抗體NF－200標記的再生神經(jīng)纖維在橫斷區(qū)頭側(cè)大量再生，呈無序狀生長，并通過損傷區(qū)到達尾側(cè)；對照組大鼠未見有明顯的神經(jīng)纖維再生；NSCs組大鼠可見少量神經(jīng)纖維再生，未通過損傷區(qū)到達尾側(cè)。本研究結(jié)果表明：無論是單純NSCs移植治療脊髓損傷還是NSCs聯(lián)合EPO治療脊髓損傷，二者均可以促進大鼠脊髓橫斷損傷后后肢運動功能的恢復(fù)，但NSCs聯(lián)合EPO治療脊髓損傷的修復(fù)作用更加顯著。

本研究結(jié)果表明：NSCs移植聯(lián)合腹腔注射EPO較單純NSCs移植能更有效地促進脊髓損傷大鼠后肢運動功能的恢復(fù)，該方法是探索脊髓損傷治療策略的一種有意義的、積極的嘗試，同時也為臨床治療脊髓損傷提供了非常重要的實驗理論依據(jù)。

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