腫瘤壞死因子α信號(hào)傳導(dǎo)通路在兒童哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用

齊 玲，王瑋瑤，張艷春，蔡尚霞，楊寧江，劉曉麗

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒科，吉林 吉林 132021）

近年來(lái)哮喘的患病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)，哮喘已成為嚴(yán)重威脅公眾健康的一種主要慢性疾病，尤其是兒童哮喘的發(fā)生給患兒及家屬帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。研究［1－3］顯示：哮喘的發(fā)生與腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）有關(guān)聯(lián)，但研究結(jié)果僅限于對(duì)患者血清TNF－α水平的檢測(cè)，而半胱氨酸蛋白酶8（cysteine containing aspirate specific protease－8，Caspase－8）、受體相互作用蛋白（reportor interacting protein，RIP）、腫瘤壞死因子相關(guān)受體2（TNF receptor－associated factors－2，TRAF－2）和半胱氨酸蛋白酶3（cysteine containing aspirate－specific protease－3，Caspase－3）在兒童哮喘發(fā)病中的作用還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究檢測(cè)不同哮喘發(fā)作狀態(tài)時(shí)患兒血清中TNF－α通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，探討兒童哮喘的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2011年1月—2012年1月在北華大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院的33例哮喘患兒，年齡1～14歲，平均年齡（4.8±4.1）歲，其中男性18例，女性15例，患兒診斷均符合2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)修訂的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》［4］。選擇31名正常門(mén)診體檢兒童作為對(duì)照組，其中男性14名，女性17名，年齡1～18歲，平均年齡（5.8±2.9）歲。本研究通過(guò)北華大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核，所有研究對(duì)象均已簽署或由監(jiān)護(hù)人代為簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑和儀器 TNF－α、Caspase－8抗體和二氨基聯(lián)苯胺（3，3′－diaminobenzidine，DAB）顯色試劑（美國(guó) Epitomics公司），TRAF－2和Caspase－3抗體（美國(guó)SANTA CRUZ公司），RIP抗體（美國(guó)BD公司）；J－26XP超低溫高速離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司），超低溫冰箱（MDF－U53V，日本三洋公司），PLUS 384全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)MDC公司）。

1.3 ELISA 法檢測(cè) 研究對(duì)象血清中TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白的表達(dá)水平［5］抽取對(duì)照組研究對(duì)象和哮喘患兒不同時(shí)期（急性發(fā)作期、臨床緩解期及慢性持續(xù)期）的外周靜脈血2mL，室溫靜置4h，將上清小心吸至

1.5 mL Eppendorf管中，做好標(biāo)記后置入4℃冰箱中備用。待收集齊血清樣本，設(shè)空白對(duì)照，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔。取受試者血清，將血清與包被液按1∶1比例包被后4℃過(guò)液。封閉后加入TNF－α、Caspase－8 、TRAF－2、RIP和Caspase－3 抗 體（1∶1000稀釋?zhuān)?，?4℃ 過(guò)夜。次日加入二抗（1∶1000稀釋?zhuān)┦覝叵路跤?h，加顯色液室溫避光顯色。于自動(dòng)酶標(biāo)儀492nm處測(cè)定吸光度（A）值，用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后計(jì)算樣本濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組研究對(duì)象血清中 TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白表達(dá)水平以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

各組研究對(duì)象血清中 TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白表達(dá)水平ELISA結(jié)果顯示：各期哮喘患兒血清中TNF－α表達(dá)水平均升高。與對(duì)照組比較，哮喘患兒急性發(fā)作期血清中 TNF－α、Caspase－3和Caspase－8蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），臨床緩解期及慢性持續(xù)期血清中Caspase－8蛋白表達(dá)水平降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），臨床緩解期血清中Caspase－3蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），而慢性持續(xù)期血清中Caspase－3蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，哮喘患兒臨床緩解期、慢性持續(xù)期和急性發(fā)作期血清中TRAF2及RIP蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

3 討 論

TNF－α是一種由活化的巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子，其在炎癥反應(yīng)和細(xì)胞免疫等多種病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。因此，有關(guān)TNF－α信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究一直是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)內(nèi)容。TNF－α和TNF－β雖不同，但其DNA序列同源性可達(dá)56%，氨基酸水平同源性可達(dá)36%，而且兩者作用的受體均為腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）。TNFR 有TNFR1和TNFR2兩種形式，均為Ⅰ型跨膜糖蛋白，前者在體內(nèi)的大多細(xì)胞表面均廣泛分布，后者僅局限在免疫細(xì)胞。當(dāng)TNF－α與TNFR1結(jié)合后，與細(xì)胞中TNFR死亡域結(jié)合蛋白（TNFR－associated death domain protein，TRADD）結(jié)合，再與細(xì)胞中Fas相關(guān)死亡域蛋白（Fas－associated with death domain protein，F(xiàn)ADD）和Caspase－8結(jié)合，進(jìn)而激活其下游Caspase－3蛋白，通過(guò)經(jīng)典的凋亡途徑使細(xì)胞發(fā)生凋亡［6－7］。另一方面，TNF－α與TNFR1相結(jié)合后，會(huì)募集TRAF2和RIP，進(jìn)而激活NF－κB信號(hào)通路而發(fā)揮多重生理調(diào)控功能［8－10］。

表1 各組研究對(duì)象血清中 TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of TNF－α，Caspase－8，Caspase－3，TRAF－2，and RIP proteins in serum of objects in various groups［，ρB／（μg·L－1）］

表1 各組研究對(duì)象血清中 TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of TNF－α，Caspase－8，Caspase－3，TRAF－2，and RIP proteins in serum of objects in various groups［，ρB／（μg·L－1）］

＊P＜0.05compared with control group.

ase－3 TRAF2 RIP Control 31 14.01±0.51 20.34±0.80 1.23±0.07 4.13±0.21 0.77±0.07 Asthma 33 Clinical remission 15.75±0.96 18.12±1.12 1.03±0.09＊ 2.76±0.08 0.71±0.08 Chronic persistent 17.33±0.51 16.11±1.02 1.36±0.21＊ 4.28±0.42 0.79±0.04 Acute exacerbation 19.86±0.76＊ 32.99±5.04＊ 1.40±0.20＊3.77±0.37 0.77±0.16 Group n TNF－α Caspase－8 Casp

國(guó)內(nèi)外關(guān)于哮喘與TNF－α的關(guān)系已有大量臨床血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果來(lái)支持，但具體TNF－α通路在哮喘發(fā)生機(jī)制中如何發(fā)揮作用尚不清楚［11－13］。本研究結(jié)果顯示：臨床緩解期、慢性持續(xù)期和急性發(fā)作期哮喘患兒血清中TNF－α表達(dá)水平均升高，尤其是急性發(fā)作期哮喘患兒血清中TNF－α表達(dá)水平明顯升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明哮喘兒童血清TNF－α水平與哮喘的發(fā)生有密切關(guān)聯(lián)，與此前研究［1－3］結(jié)果一致。同時(shí)，哮喘患兒處于臨床緩解期和慢性持續(xù)期時(shí)，血清中TNF－α表達(dá)水平升高，提示TNF－α可能全程參與了兒童哮喘的發(fā)生發(fā)展。

急性發(fā)作期哮喘患兒血清中Caspase－8蛋白表達(dá)水平明顯升高，這一結(jié)果與TNF－α表達(dá)規(guī)律一致。說(shuō)明哮喘急性發(fā)作可能通過(guò)激活TNF－α通路，活化細(xì)胞中的Caspase－8蛋白，使之表達(dá)增加，引起凋亡經(jīng)典途徑激活而引發(fā)細(xì)胞凋亡，促使哮喘發(fā)生。Caspase－3是凋亡傳導(dǎo)通路的下游凋亡執(zhí)行蛋白［14－15］，急性發(fā)作期患兒血清中 Caspase－3蛋白表達(dá)水平亦升高。這進(jìn)一步驗(yàn)證了哮喘急性發(fā)作時(shí)TNF－α通路激活，引起細(xì)胞中Caspase－8蛋白活化后繼而激活Caspase－3蛋白，使細(xì)胞凋亡發(fā)生，最終誘發(fā)哮喘。

本研究結(jié)果顯示：臨床緩解期、慢性持續(xù)期和急性發(fā)作期哮喘患兒血清中TRAF2和RIP蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明TRAF2和RIP蛋白可能不參與TNF－α信號(hào)通路在哮喘中的作用。但由于本實(shí)驗(yàn)患兒例數(shù)較少，不能完全排除該2種蛋白的作用。具體哪種細(xì)胞發(fā)生了凋亡，引起患兒哮喘發(fā)生尚未完全定論，也可能有其他的凋亡傳導(dǎo)通路在哮喘發(fā)生中起作用，但哮喘與TNF－α的關(guān)系還需更多的動(dòng)物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

［1］Yang G，Chen J，Xu F，et al.Association between tumor necrosis factor－αpolymorphism and risk of asthma：a metaanalysis［J］.PLoS One，2014，9（6）：e99962.

［2］Nam HS，Lee SY，Kim SJ，et al.The soluble tumor necrosis factor－alpha receptor suppresses airway inflammation in a murine model of acute asthma［J］.Yonsei Med J，2009，509（4）：569－575.

［3］Brightling C，Berry M，Amrani Y.Targeting TNF－alpha：a novel therapeutic approach for asthma ［J］.J Allergy Clin Immunol，2008，121（1）：5－10.

［4］中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組，中華兒科雜志編輯委員會(huì).兒童支氣管哮喘診斷與防治指南 ［J］.中華兒科雜志，2008，46（10）：745－753.

［5］齊 玲，金 宏，趙東海，等.五味子木脂素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤神經(jīng)球細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究 ［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2014，49（2）：113－116.

［6］Depuydt B，Van Loo G，Vandenabeele P，et al.Induction of apoptosis by TNF receptor 2in a T－cell hybridoma is FADD dependent and blocked by caspase－8inhibitors ［J］.J Cell Sci，2005，118（Pt 3）：497－504.

［7］Chattopadhyay A，Hood BL，Conrads TP，et al.Extrinsic apoptosis is impeded by direct binding of the APL fusion protein NPM－RAR to TRADD ［J］.Mol Cancer Res，2014，12（9）：1283－1291.

［8］Eum HA，Vallabhaneni R，Wang Y，et al.Characterization of DISC formation and TNFR1translocation to mitochondria in TNF－α－treated hepatocytes ［J］.Am J Pathol，2011，179（3）：1221－1229.

［9］Kesanakurti D，Chetty C，Bhoopathi P，et al.Suppression of MMP－2attenuates TNF－αinduced NF－κB activation and leads to JNK mediated cell death in glioma ［J］.PLoS One，2011，6（5）：e19341.

［10］Ruspi G，Schmidt EM，McCann F，et al.TNFR2increases the sensitivity of ligand－induced activation of the p38MAPK and NF－κB pathways and signals TRAF2protein degradation in macrophages［J］.Cell Signal，2014，26（4）：683－690.

［11］Fotin－Mleczek M，Henkler F，Samel D，et al.Apoptotic crosstalk of TNF receptors：TNF－R2－induces depletion of TRAF2and IAP proteins and accelerates TNF－R1－dependent activation of caspase－8 ［J］.J Cell Sci，2002，115（13）：2757－2770.

［12］Manthei DM，Schwantes EA，Mathur SK，et al.Nasal lavage VEGF and TNF－αlevels during a natural cold predict asthma exacerbations ［J］.Clin Exp Allergy，2014，8.doi：10.1111／cea.12387.

［13］Choi JP，Kim YM，Choi HI，et al.An important role of tumor necrosis factor receptor－2on natural killer T cells on the development of dsRNA－enhanced Th2cell response to inhaled allergens［J］.Allergy，2014，69（2）：186－198.

［14］鐘 越，齊 玲，沈 楠，等.越桔原花青素調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制研究 ［J］.中國(guó)病理生理雜志，2014，30（4）：603－608.

［15］齊 玲，王 爽，溫 娜，等.白附子提取物對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及其機(jī)制 ［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2014，49（4）：768－771.