巴西橡膠樹HbUBC14基因克隆、生物信息學(xué)及表達(dá)分析

李德軍　鄧治　劉向紅　劉輝

摘 要 從巴西橡膠樹中鑒定出一個(gè)泛素結(jié)合酶（UBC）基因，該基因長(zhǎng)653 bp，最長(zhǎng)開放閱讀框504 bp，預(yù)測(cè)編碼蛋白包含167個(gè)氨基酸；序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白具有一段保守的UBC結(jié)構(gòu)域，與擬南芥E2成員UBC14（At3g55380）具有較高的相似性，故將該基因命名為HbUBC14。半定量RT-PCR分析結(jié)果表明，HbUBC14在巴西橡膠樹膠乳中表達(dá)最高，在花藥中表達(dá)最低。與健康橡膠樹相比，死皮樹膠乳中HbUBC14表達(dá)量明顯下降。HbUBC14表達(dá)還受乙烯和茉莉酸調(diào)控。以上結(jié)果表明，HbUBC14可能在巴西橡膠樹死皮、乙烯和茉莉酸反應(yīng)中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹 ；HbUBC14 ；表達(dá)分析

分類號(hào) S794.1

泛素/26S蛋白酶體途徑（Ubiquitin/26S Proteasome Pathway，UPP）是生物體內(nèi)最重要且高效的選擇性降解蛋白質(zhì)途徑，對(duì)生物體維持正常生命活動(dòng)至關(guān)重要。UPP主要由泛素激活酶（ubiquitin activating enzyme，E1）、泛素結(jié)合酶（ubiquitin conjugating enzyme，UBC/E2）、泛素蛋白連接酶（ubiquitin-protein ligase，E3）和26S蛋白酶體組成。在UPP中，泛素（Ubiquitin，Ub）是一個(gè)可被重復(fù)利用識(shí)別靶蛋白的信號(hào)，Ub聚合體通過三步酶接合級(jí)聯(lián)反應(yīng)與靶蛋白共價(jià)結(jié)合，最終導(dǎo)致靶蛋白被26 S蛋白酶體降解為較小的多肽、氨基酸，同時(shí)可被重復(fù)利用的Ub釋放出來[1]。作為高效、專一性和選擇性強(qiáng)的蛋白降解途徑，UPP幾乎涉及植物發(fā)育機(jī)制的所有方面，其核心是激素反應(yīng)，包括激素合成、感知和下游信號(hào)傳導(dǎo)[2-5]。

E2是催化泛素與底物蛋白結(jié)合的第二個(gè)酶，在UPP酶接合級(jí)聯(lián)反應(yīng)中E2發(fā)揮著橋梁和紐帶的作用。E2在UBC結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有一個(gè)高度保守的半胱氨酸（cysteine）位點(diǎn)，接受從E1泛素復(fù)合物轉(zhuǎn)移過來的活化泛素分子后，形成E2-Ub復(fù)合物。在E3的協(xié)同作用下，E2-Ub復(fù)合物把活化的泛素分子轉(zhuǎn)移到底物蛋白上，形成單泛素化或多聚泛素化蛋白，具有泛素標(biāo)記的蛋白最終被26S蛋白酶體降解[6]。研究表明，E2在DNA修復(fù)、植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答等方面均發(fā)揮重要作用。真核生物復(fù)制后DNA修復(fù)主要由RAD6和RAD18控制，在以RAD6為中心的復(fù)制后DNA修復(fù)途徑中，傷害誘導(dǎo)的PCNA泛素化是DNA修復(fù)的前提，而PCNA不同修飾則影響對(duì)DNA損傷的抗性[7-8]。DNA損傷誘導(dǎo)染色質(zhì)相關(guān)蛋白磷酸化使RNF8和UBC13聚集到DNA損傷位點(diǎn)，RNF8-UBCl3復(fù)合物可獨(dú)立完成泛素化，進(jìn)而促RAP80和完整的Brcal A復(fù)合物在DNA損傷位點(diǎn)募集完成DNA修復(fù)[9-10]。在擬南芥基因組中至少存在37個(gè)E2基因，E2可部分決定蛋白泛素化效率和特異性[11]。AtUBC1、AtUBC2和AtUBC3與酵母RAD6基因同源，AtUBC2可互補(bǔ)酵母rad6突變體。AtUBC1和AtUBC2能通過上調(diào)擬南芥開花基因（FLC）表達(dá)抑制開花，AtUBC3則不參與開花過程的調(diào)控[12-14]。擬南芥類E2蛋白—COP10無E2活性，但可通過提高一些E2蛋白活性調(diào)控植物的的生長(zhǎng)發(fā)育過程，UBC19和UBC20除參與分化細(xì)胞泛素化反應(yīng)外，還在細(xì)胞周期中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15-16]。除與DNA修復(fù)和植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)，E2還在脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。徐晨曦等[17]從耐鹽灌木檉柳中獲得了一個(gè)E2基因，在煙草中異源表達(dá)E2基因證明，該基因能提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性。Cui等[18]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥UBC32在油菜素內(nèi)酯介導(dǎo)的植物生長(zhǎng)和耐鹽反應(yīng)中發(fā)揮作用。

巴西橡膠樹是一種重要的熱帶經(jīng)濟(jì)林木，它產(chǎn)生的膠乳是天然橡膠的主要原料。中國天然橡膠供需矛盾日益凸顯，目前自給率已降至20%以下。中國植膠區(qū)域有限，因此提高單產(chǎn)是保障我國天然橡膠供給能力的唯一出路。在影響天然橡膠單產(chǎn)的因素中，橡膠樹死皮是主要限制因子之一。Chua[19]研究發(fā)現(xiàn)，死皮橡膠樹中可溶性蛋白質(zhì)含量低于健康橡膠樹，說明橡膠樹死皮發(fā)生過程中蛋白質(zhì)代謝以降解代謝為主。范思偉和楊少瓊[20]研究發(fā)現(xiàn)，死皮發(fā)生發(fā)展過程中膠乳組織蛋白酶活性增加，表明乳管細(xì)胞蛋白分解代謝增強(qiáng)。Li等[21]進(jìn)一步研究表明，UPP為橡膠樹死皮發(fā)生關(guān)鍵調(diào)控途徑之一。盡管以上研究表明，UPP在橡膠樹在死皮中發(fā)揮重要作用，但有關(guān)UPP在橡膠樹中的研究報(bào)道較少。本研究從巴西橡膠樹中克隆了一個(gè)UBC基因—HbUBC14，對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)及在不同組織、死皮和健康橡膠樹膠乳、乙烯利（ET）和茉莉酸（JA）處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式分析，以期為進(jìn)一步揭示HbUBC14的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以優(yōu)良巴西橡膠樹品系熱研7-33-97為實(shí)驗(yàn)材料，該材料于1990年定植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)五隊(duì)，采用4 d 1刀、1/2螺旋割線加1.5%乙烯利刺激割膠，其中死皮樹選用割面不排膠長(zhǎng)度為2 cm至1/4割線間的橡膠樹。不同組織及健康和死皮橡膠樹膠乳均來源于上述材料；ET（乙烯利）和JA（茉莉酸）處理參考Hao和Wu[22]的方法進(jìn)行，ET和JA的處理濃度分別為1%和0.3%。ET和JA處理植株為2003年定植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)七隊(duì)的未開割幼樹，以不作任何處理的幼樹為對(duì)照，采集處理后0、4、8、24、48、72和120 h（只取ET處理樣品）的膠乳。

1.2 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

根據(jù)Xu等[23]的方法提取樹皮、膠乳、葉片、花等組織總RNA，用DNase I處理去除RNA中殘留的少量DNA。cDNA第一鏈合成按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit說明書提供的方法和步驟進(jìn)行。endprint

1.3 HbUBC14克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)橡膠樹已知基因片段（TSA：JR349640.1和JT967526.1）拼接序列設(shè)計(jì)引物HbUBC14F和HbUBC14R（表1），用PyrobestTM DNA酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序擴(kuò)增產(chǎn)物以驗(yàn)證基因序列。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后連接到pMD18-T載體，挑取陽性克隆送公司測(cè)序。

利用DNAstar 7.0查找序列開放閱讀框并翻譯成蛋白的分子量和等電點(diǎn)。利用在線NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析HbUBC14蛋白保守結(jié)構(gòu)域、活性部位、硫酯中間體互作殘基和E3互作殘基。

1.4 HbUBC14表達(dá)分析

根據(jù)HbUBC14基因序列設(shè)計(jì)特異引物HbUBC14-RTF和HbUBC14-RTR（表1），以橡膠樹18S RNA基因作為內(nèi)參，采用半定量PCR分析HbUBC14在巴西橡膠樹不同組織、死皮和健康橡膠樹膠乳及ET和JA處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式。半定量PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸35 s，30～35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，然后用凝膠成像儀掃描膠圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbUBC14克隆及序列分析

在分析健康橡膠樹樹皮轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，2個(gè)基因片段（TSA：JR349640.1和JT967526.1）與UBC高度相似[24-25]。通過組裝2個(gè)基因片段獲得長(zhǎng)653 bp基因，為驗(yàn)證拼接序列，在基因兩端設(shè)計(jì)引物HbUBC14F和HbUBC14R并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，連接pMD18-T載體并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，該基因長(zhǎng)653 bp，最長(zhǎng)開放閱讀框504 bp（圖1）；以獲得基因?yàn)椴樵冃蛄校贜CBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.org）進(jìn)行BLASTX比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該預(yù)測(cè)蛋白具有一段高度保守的UBC結(jié)構(gòu)域，與擬南芥At3g55380蛋白高度相似，而At3g55380蛋白為擬南芥E2成員UBC14，因此，將從巴西橡膠樹中得到的基因命名為HbUBC14。

2.2 HbUBC14生物信息學(xué)分析

HbUBC14蛋白包含167個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為18.66 ku，等電點(diǎn)為5.128。以HbUBC14氨基酸為查詢序列，利用NCBI網(wǎng)站在線保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)HbUBC14蛋白保守結(jié)構(gòu)域。從第9到第160位氨基酸為保守的UBC結(jié)構(gòu)域區(qū)。此外，HbUBC14還預(yù)測(cè)到1個(gè)活性半胱氨酸位點(diǎn)（第90位）、21個(gè)泛素硫酯中間體互作殘基和5個(gè)E3互作殘基（圖1）。UBC結(jié)構(gòu)域及上述特征對(duì)HbUBC14行使E2功能至關(guān)重要。

2.3 HbUBC14在不同組織及死皮和健康橡膠樹膠乳中的表達(dá)分析

以Hb18S rRNA為內(nèi)參，利用半定量RT-PCR方法分析HbUBC14在不同組織及死皮和健康橡膠樹膠乳中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，HbUBC14在巴西橡膠樹膠乳中高表達(dá)，接下來是葉片、雌花、雄花、樹皮和花藥（圖2A）。如圖2B所示，與健康橡膠樹膠乳相比，HbUBC14在死皮橡膠樹膠乳中表達(dá)量明顯下降。

2.4 HbUBC14在乙烯和茉莉酸處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式分析

HbUBC14在乙烯和茉莉酸處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式分析如圖3所示。ET和JA處理均能調(diào)控HbUBC14基因表達(dá)。在ET處理下，HbUBC14表達(dá)在8 h開始上升，24 h達(dá)最大值，之后開始下降，72和120 h基本維持在8h表達(dá)水平（圖3A）。與ET處理不同，JA處理后HbUBC14表達(dá)量持續(xù)增加，處理4和8 h 時(shí)有所上升，24 h表達(dá)量明顯增加，72 h表達(dá)量達(dá)到最大值（圖3B）。

3 討論

E2是UPP的一個(gè)重要成員，在UPP酶接合級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起到橋梁和紐帶的作用[6]。本研究克隆了1個(gè)橡膠樹E2成員—HbUBC14，生物信息學(xué)分析表明，HbUBC14同其它生物E2蛋白一樣，含有高度保守的UBC結(jié)構(gòu)域、半胱氨酸活性位點(diǎn)、泛素硫酯中間體互作殘基和E3互作殘基，根據(jù)以上特征推測(cè)HbUBC14可行使E2蛋白功能。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，HbUBC14與擬南芥AtUBC14相似性最高，但AtUBC14功能仍不清楚，因此不能通過AtUBC14推測(cè)HbUBC14功能[26]。本研究發(fā)現(xiàn)HbUBC14表達(dá)無組織特異性，但在膠乳中高表達(dá)，說明HbUBC14可能在橡膠樹膠乳生物合成和代謝中具有重要作用。與健康橡膠樹相比，死皮橡膠樹中可溶性蛋白質(zhì)含量顯著低于健康橡膠樹，死皮發(fā)生發(fā)展過程中膠乳組織蛋白酶活性增加，說明乳管細(xì)胞蛋白分解代謝增強(qiáng)[19-20]。Li等[21]研究發(fā)現(xiàn)，死皮相關(guān)基因在UPP途徑中富集，提出UPP是橡膠樹死皮發(fā)生關(guān)鍵調(diào)控途徑。UPP是高度選擇性的蛋白降解途徑，E2作為UPP途徑中的關(guān)鍵成員必然在蛋白選擇性降解中發(fā)揮重要作用。RT-PCR分析結(jié)果表明，HbUBC14在健康橡膠樹膠乳中高表達(dá)，而在死皮橡膠樹膠乳中基本無表達(dá)，其是否與死皮橡膠樹蛋白含量低相關(guān)，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

在橡膠樹中，對(duì)ET和JA兩個(gè)激素的研究和應(yīng)用較為深入。ET作為橡膠樹增產(chǎn)刺激劑，通過延長(zhǎng)排膠時(shí)間提高橡膠產(chǎn)量[27]，而過度割膠和強(qiáng)乙烯利刺激容易誘發(fā)橡膠樹死皮[20]；JA能誘導(dǎo)橡膠樹乳管分化，乳管分化能力和數(shù)目多少是橡膠樹是否高產(chǎn)的一個(gè)重要標(biāo)志[22]。本研究結(jié)果表明，ET和JA可調(diào)控HbUBC14表達(dá)，因此可能與ET和JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。綜合本研究結(jié)果，推測(cè)HbUBC14為多功能基因，可能參與橡膠樹死皮、ET和JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、膠乳再生和乳管分化等過程。HbUBC14基因克隆、生物信息學(xué)及表達(dá)分析為進(jìn)一步研究HbUBC14在橡膠樹中的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。endprint

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