Ames試驗(yàn)假陽(yáng)性的判斷方法

陳穎，姜娟，楊陽(yáng)，李瑩，周莉，孫祖越

上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所 藥理毒理學(xué)研究室，中國(guó)生育調(diào)節(jié)藥物毒理學(xué)檢測(cè)中心，上海 200032

Ames等經(jīng)十余年努力[1-2]，于1975年建立并不斷發(fā)展完善的沙門菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（亦稱Ames試驗(yàn)），是一種快速檢測(cè)化合物致突變性和潛在致癌性的方法[3-5]，目前已成為世界范圍內(nèi)基因突變檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛的一種方法[6]，也是我國(guó)藥物遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合中必選的一項(xiàng)。鼠傷寒沙門菌的組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型（異養(yǎng)型his-）菌株不能生長(zhǎng)在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基中，受誘變劑作用后，大量細(xì)菌發(fā)生回復(fù)突變成野生型（原養(yǎng)型his+），自行合成組氨酸，使其在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上也能生長(zhǎng)發(fā)育成肉眼可見(jiàn)的菌落[7-9]。

在Ames平皿摻入試驗(yàn)中，一般會(huì)在上層瓊脂中添加少量組氨酸，在含微量組氨酸的培養(yǎng)基中，除極少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌外，一般只能分裂幾次，形成在顯微鏡下才能見(jiàn)到的微菌落（即背景菌落）[10]。通常判斷受試物毒性的方法是通過(guò)觀察背景菌落的生長(zhǎng)狀態(tài)及瓊脂培養(yǎng)基的清亮程度，一般來(lái)說(shuō)背景菌苔生長(zhǎng)良好時(shí)瓊脂呈乳白色，若瓊脂清亮透明，則說(shuō)明背景菌苔生長(zhǎng)不良，受試物具有細(xì)菌毒性。但是，由于各廠家生產(chǎn)的瓊脂質(zhì)量不一，很難通過(guò)觀察瓊脂培養(yǎng)基來(lái)判斷受試物是否具有細(xì)菌毒性，在低倍鏡下觀察背景菌落的生長(zhǎng)狀態(tài)也會(huì)受到瓊脂的干擾而影響觀察，因此這些方法并不可靠。在此，我們提供了判斷Ames試驗(yàn)假陽(yáng)性結(jié)果的可靠辦法。

1 材料與方法

1.1 材料

5株標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535購(gòu)自Moltox公司，在液氮或-80℃冰箱中貯存。陽(yáng)性對(duì)照誘變劑為敵克松（Dexon）、疊氮鈉（SA）（上海楷洋生物有限公司），2-氨基芴（2-AF）、2-氨基蒽（2-AN）（Alfa Aesar公司）。

菌株TA97、TA98、TA100和TA102除具有組氨酸合成缺失突變外，還具有細(xì)胞壁脂多糖缺失突變（可增加受試物滲透進(jìn)入細(xì)胞的能力），含有pKM101質(zhì)粒（可增強(qiáng)細(xì)胞DNA損傷的誤修復(fù)，促使有可能被修復(fù)的前突變轉(zhuǎn)變?yōu)檎嬲耐蛔儯蕴岣呔甑拿舾行裕憩F(xiàn)為具有氨芐西林抗性）[11]。TA1535不含pKM101質(zhì)粒。TA97、TA98、TA100和TA1535菌株具有切除修復(fù)系統(tǒng)缺失突變（紫外線敏感）；而TA102則含有pAQ1質(zhì)粒，表現(xiàn)為具有四環(huán)素抗性。

1.2 抑菌試驗(yàn)

根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局2007頒布的《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[12]，對(duì)于可溶性的無(wú)毒化合物，推薦的最高測(cè)試濃度一般為5 mg/皿；對(duì)于可溶性的有細(xì)菌毒性的受試物，應(yīng)根據(jù)殺菌或抑菌情況確定最高濃度。因此，在抑菌試驗(yàn)中采用5.0、2.5、1.25、0.625 和 0.3125 mg/皿，對(duì)受試物的毒性進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 正式試驗(yàn)

根據(jù)抑菌試驗(yàn)中受試物的毒性情況確定最高濃度后，設(shè)計(jì)5個(gè)劑量組，在加或不加S9代謝活化系統(tǒng)的條件下采用平皿摻入法進(jìn)行正式試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)溶媒對(duì)照和陽(yáng)性誘變劑對(duì)照。直接誘變劑敵克松為實(shí)驗(yàn)菌株TA97、TA98、TA100和TA102的診斷性陽(yáng)性誘變劑；直接誘變劑疊氮鈉為實(shí)驗(yàn)菌株TA1535的診斷性陽(yáng)性誘變劑；間接誘變劑2-氨基芴為實(shí)驗(yàn)菌株TA97、TA98、TA100和TA102的診斷性陽(yáng)性誘變劑；間接誘變劑2-氨基蒽為實(shí)驗(yàn)菌株TA1535的診斷性陽(yáng)性誘變劑。

1.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

在正式試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)部分菌株的菌落數(shù)有所增加，在不能確定受試物是否具有致突變效應(yīng)的情況下，將 1.0 mg/皿劑量作用的 TA1535 和 0.25 mg/皿劑量作用的TA97中疑似突變的菌落，以及相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照物作用的菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)，劃線接種于無(wú)組氨酸的底層瓊脂培養(yǎng)基上，以驗(yàn)證增加的菌落是否為突變菌落。

2 結(jié)果

2.1 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

在5.0 mg/皿劑量下5株菌均無(wú)菌落形成，在2.5 mg/皿劑量下僅出現(xiàn)極少量菌落，在 1.25 mg/皿劑量下各菌株菌落數(shù)明顯少于自發(fā)回變菌落數(shù)，表明該化合物在上述劑量下具有細(xì)菌毒性。故正式試驗(yàn)中采用1.0 mg/皿為最高劑量濃度。

2.2 正式試驗(yàn)結(jié)果

采用平皿摻入法檢測(cè)受試物在 1.0、0.5、0.25、0.125 和 0.0625 mg/皿 劑 量 下 對(duì) 測(cè) 試 菌 株 TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535的致突變性時(shí)，發(fā)現(xiàn)TA97在0.5和0.25 mg/皿劑量下，無(wú)論有無(wú)S9活化系統(tǒng)，對(duì)測(cè)試菌株TA97產(chǎn)生的回變菌落數(shù)與溶媒對(duì)照組相比呈增加趨勢(shì)；TA1535在1.0 mg/皿劑量下，無(wú)論有無(wú)S9活化系統(tǒng)，對(duì)TA1535產(chǎn)生的回變菌落數(shù)與溶媒對(duì)照組相比雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但能觀察到菌落數(shù)增加（表1，圖1）。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

給予受試物的菌株不能生長(zhǎng)在無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基上，而給予陽(yáng)性對(duì)照物的菌株卻可以生長(zhǎng)在無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基上，說(shuō)明受試物造成的TA97和TA1535菌落數(shù)增加并非致突變作用所致（圖2），而是毒性作用導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果。

表1 受試物平皿摻入試驗(yàn)結(jié)果

圖1 平皿摻入試驗(yàn)結(jié)果

圖2 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

在驗(yàn)證試驗(yàn)中，經(jīng)受試物處理的TA1535增菌后劃線接種于無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生了星星點(diǎn)點(diǎn)的菌落（圖2C、D），可能在挑取菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)時(shí)挑取了部分發(fā)生自發(fā)回變的菌落，因此其可以生長(zhǎng)在無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基中。

受試物的毒性作用可以導(dǎo)致Ames試驗(yàn)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，由于受試物殺死了大部分細(xì)菌，使殘存的細(xì)菌得以利用培養(yǎng)基中微量的組氨酸和生物素生長(zhǎng)成肉眼可見(jiàn)的菌落，但這并非回變菌落，而是由供試品毒性導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果。本試驗(yàn)?zāi)芸煽康嘏袛嘟?jīng)受試物處理的菌株是否為突變菌株，從而確定受試物是否具有致突變作用。

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