用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)糞便樣本中的沙門(mén)菌

劉威，李環(huán)，鄒大陽(yáng)，楊展，趙向娜，李雪蓮，崔茜，王思淼，黃思妺，閆夏貝，魏曉，王雪松，尹志濤，黃留玉，袁靜

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 疾病預(yù)防控制所，北京 100071

據(jù)統(tǒng)計(jì)，在世界各國(guó)多種類(lèi)細(xì)菌性食物中毒中，沙門(mén)菌引起的食物中毒常列榜首[1-3]。過(guò)去的一個(gè)世紀(jì)，中國(guó)作為一個(gè)主要的食品生產(chǎn)商和消費(fèi)者，人均消費(fèi)的食物大幅增加。根據(jù)食源性疾病暴發(fā)的報(bào)告，1992～2005年，在細(xì)菌性食源性疾病暴發(fā)中沙門(mén)菌病是第二大原因，每年約10%～20%的暴發(fā)是由沙門(mén)菌引起的[4]。食源性沙門(mén)菌常導(dǎo)致腹瀉，更好地控制沙門(mén)菌感染需要敏感和快速的檢測(cè)方法。雖然傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)沙門(mén)菌的方法仍被廣泛使用，但所需檢測(cè)時(shí)間超過(guò)3 d[5-6]。以PCR為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)沙門(mén)菌的分子技術(shù)已經(jīng)建立[7]。但PCR鑒定有幾個(gè)固有的缺點(diǎn)，如對(duì)試驗(yàn)條件要求較高，需要昂貴的儀器設(shè)備和專(zhuān)業(yè)人員，且操作相對(duì)復(fù)雜，更為重要的是檢測(cè)成本高，只有專(zhuān)業(yè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室才能進(jìn)行，基層單位難以開(kāi)展。因此，開(kāi)發(fā)一種操作簡(jiǎn)便、特異性高、靈敏度好、檢測(cè)快速、成本低廉、適于基層推廣的檢測(cè)方法，對(duì)沙門(mén)菌的監(jiān)控將起到積極作用。最近發(fā)展的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isother?mal amplification，LAMP）是一種新的分子生物學(xué)方法，它在等溫條件下實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增[8-9]。LAMP技術(shù)的反應(yīng)原理是，根據(jù)序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)的一對(duì)外引物、一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物特異性識(shí)別靶序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在60～65℃范圍60 min內(nèi)大量合成目標(biāo)DNA，同時(shí)伴隨副產(chǎn)物——白色的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生。由于LAMP擴(kuò)增過(guò)程依賴(lài)識(shí)別靶序列6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，所以反應(yīng)特異性很強(qiáng)，且核酸擴(kuò)增過(guò)程在等溫條件下進(jìn)行，普通水浴鍋或有穩(wěn)定熱源的設(shè)備即可滿足反應(yīng)要求，檢測(cè)成本大大降低。目前，LAMP技術(shù)在臨床診斷[10]、細(xì)菌或病毒的定性和定量檢測(cè)[1,11-15]、性別鑒定[16]和其他方面得到廣泛應(yīng)用。已有研究結(jié)果表明,invA基因是沙門(mén)菌獨(dú)有的基因，也是PCR檢測(cè)沙門(mén)菌的一個(gè)目標(biāo)基因[17]。因此，我們選擇invA基因作為L(zhǎng)AMP法檢測(cè)沙門(mén)菌的目標(biāo)基因，擬以LAMP法為基礎(chǔ)對(duì)糞便樣本中的沙門(mén)菌進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用菌種見(jiàn)表1，各菌株在腦心浸液肉湯（BHI）中于37℃培養(yǎng)；Bst大片段DNA聚合酶（New England Biolabs公司）；總DNA提取純化試劑盒（Promega公司）；dNTP（Pharmacia公司）；Chelex-100、甜菜堿（Sigma公司）；硫酸鎂、氯化鉀、氫氧化鈉、EDTA、硫酸銨（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；Tris-HCl（上海生科生物科技有限公司）；Triton X-100（北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司）；NP-40（FLU?KA公司）；羥基萘酚藍(lán)（HNB）（Regal Biotechnology公司）；2×Tap MIX（天根生化科技（北京）有限公司）；瓊脂糖（AMRESCO公司）；引物由北京奧科鼎盛生物有限公司合成。

PCR擴(kuò)增儀，凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；分光光度計(jì)（NanoDrop ND-1000）；實(shí)時(shí)濁度儀LA-320c（日本榮研化學(xué)株式會(huì)社）；等溫金屬浴（杭州博日科技有限公司）。

1.2 細(xì)菌菌株和準(zhǔn)備的模板

將細(xì)菌分別接種于5 mL對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中，按照細(xì)菌最適宜生長(zhǎng)溫度培養(yǎng)過(guò)夜。用Chelex法提取細(xì)菌總DNA：取500 μL細(xì)菌懸液，10 000 r/min離心2 min，棄上清，加入500 μL雙蒸水，再加入等體積的 Chelex法 DNA提取液（25 mmol/L NaOH，10 mmol/L Tris-HCl，1%Triton X-100，1%NP-40，0.1 mmol/L EDTA，2%Chelex-100），于沸水中沸煮10 min，轉(zhuǎn)入4℃放置5 min，14 000 r/min離心2 min，上清液在LAMP和PCR反應(yīng)中[18]用作模板。

1.3 引物設(shè)計(jì)

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得已知的invA基因序列（NC_003197.1），用Primer Explorer v4軟件（http://primerexplorer.jp/LAMP）進(jìn)一步分析序列，設(shè)計(jì)外環(huán)正向引物（F3）、外環(huán)反向引物（B3）、內(nèi)環(huán)正向引物（FIP）、內(nèi)環(huán)反向引物（BIP），額外的2個(gè)環(huán)引物（LF和LB）是為了加速放大反應(yīng)（表2）。FIP和BIP設(shè)計(jì)時(shí)添加了4個(gè)胸腺嘧啶（TTTT）。與PCR比較其敏感性和特異性，PCR引物為SM127B3和SM127F3。

表1 特異性LAMP實(shí)驗(yàn)所用菌種

表2 擴(kuò)增invA基因的LAMP引物及序列

1.4 LAMP反應(yīng)

配制25 μL LAMP反應(yīng)體系，包含20 mmol/L Tris-HCl（pH8.8）、10mmol/L KCl、10mmol/L（NH4）2SO4、0.1%Tween-20、0.8 mol/L 甜 菜 堿 、8 mmol/L MgSO4、1.4 mmol/L dNTP 和 8 U Bst DNA聚合酶。需要40 pmol引物FIP和BIP、20 pmol引物L(fēng)F和LB、5 pmol引物F3和B3。最后，添加適當(dāng)數(shù)量的DNA模板到反應(yīng)管中。反應(yīng)須在63℃恒溫浴中進(jìn)行50 min，80℃滅活5 min。

1.5 LAMP結(jié)果檢測(cè)

LAMP過(guò)程發(fā)生如下化學(xué)反應(yīng)：

其中，Mg2P2O7即焦磷酸鎂為白色沉淀。依據(jù)此原理，日本榮研化學(xué)株式會(huì)社開(kāi)發(fā)出實(shí)時(shí)濁度儀LA-320c，每隔6 s測(cè)定反應(yīng)管的濁度并繪制曲線，判斷反應(yīng)的陰陽(yáng)性。

HNB是一種金屬離子指示劑，依賴(lài)反應(yīng)液中鎂離子的變化而呈現(xiàn)不同的顏色，陰性時(shí)為紫色，陽(yáng)性時(shí)為天藍(lán)色。使用時(shí)將HNB配制成2.4 mmol/L的反應(yīng)液[17]，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR檢測(cè)

圖1 LAMP反應(yīng)檢測(cè)8株已知非沙門(mén)菌的特異性

25 μL PCR反應(yīng)體系包含12.5 μL PCR主混合試劑（天根公司）、1 μmol/L SM127F3和SM127B3引物和相同數(shù)量的DNA模板。反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性5 min，然后以95℃變性30 s、55.5℃退火30 s、72℃延伸30 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL，在1%含EB的瓊脂糖凝膠中電泳（120 V，35 min），用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 特異性的LAMP試驗(yàn)

選出8株已知非沙門(mén)菌和16株沙門(mén)菌分別進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。當(dāng)反應(yīng)體系中存在沙門(mén)菌的特定基因時(shí)發(fā)生LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生大量焦磷酸鎂白色沉淀，反應(yīng)液的濁度上升，在圖中表現(xiàn)為曲線上升，可以看出只有沙門(mén)菌曲線上升，所有非沙門(mén)菌菌株LAMP反應(yīng)顯示陰性。表明這套引物具有良好的特異性。反應(yīng)前加入1.25 μL 2.4 mmol/L的HNB，只有沙門(mén)菌反應(yīng)管的顏色變成了天藍(lán)色，示為陽(yáng)性，其他菌株均為紫色，示為陰性，也說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物具有良好的特異性。見(jiàn)圖1、2。

圖2 16株沙門(mén)菌的特異性檢測(cè)

2.2 靈敏度的LAMP試驗(yàn)

為了確定設(shè)計(jì)的引物用于檢測(cè)沙門(mén)菌的敏感性，用基因組DNA提取試劑盒提取腸炎沙門(mén)菌的基因組DNA，1/10梯度稀釋后用于LAMP、PCR，結(jié)果見(jiàn)圖3。濁度儀檢測(cè)和HNB檢測(cè)均得到相同結(jié)果，LAMP檢測(cè)的最低限度約6.97 pg/μL，PCR檢測(cè)限度約69.7 pg/μL。

2.3 糞便樣品的LAMP檢測(cè)方法評(píng)估

進(jìn)一步用LAMP法分析評(píng)估檢測(cè)糞便樣本的敏感性。將腸炎沙門(mén)菌DNA梯度稀釋后與糞便樣品混勻，進(jìn)行LAMP，結(jié)果見(jiàn)圖4。濁度儀檢測(cè)和HNB檢測(cè)均得到相同結(jié)果，都與純樣品有相同的靈敏度。因此，我們可以得出結(jié)論，2種檢測(cè)方法有相同的靈敏度。用相同的模板，采用PCR鑒定沒(méi)有達(dá)到我們的目標(biāo)，目標(biāo)片段并不清楚（圖4C），這是因?yàn)榧S便中的雜質(zhì)影響所致。

3 討論

圖3 LAMP法和PCR法的靈敏度比較

用LAMP法可以在恒溫條件下于1 h內(nèi)通過(guò)擴(kuò)增細(xì)菌的一個(gè)目標(biāo)基因來(lái)檢測(cè)細(xì)菌，大大節(jié)約了時(shí)間和勞動(dòng)力成本，已有許多采用LAMP檢測(cè)病原菌的文獻(xiàn)報(bào)道，包括大腸桿菌O157∶H7、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌[19-21]。在本研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)沙門(mén)菌特異基因invA的LAMP引物，并用該引物靈敏、快速地檢測(cè)到沙門(mén)菌。用Chelex法提取基因組DNA，整個(gè)處理時(shí)間不超過(guò)20 min，反應(yīng)過(guò)程快捷，只須將反應(yīng)混合液在60℃～65℃恒溫條件下保持60 min即可完成?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)大多數(shù)研究者在檢測(cè)LAMP反應(yīng)結(jié)果時(shí)往往選擇對(duì)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行電泳或在反應(yīng)完成后添加SYBR GreenⅠ熒光染料，這2種方法都使反應(yīng)產(chǎn)物暴露于空氣中，污染了環(huán)境，極其容易造成假陽(yáng)性，而且電泳法檢測(cè)并不能實(shí)時(shí)反映LAMP反應(yīng)過(guò)程。我們采用實(shí)時(shí)濁度儀和HNB檢測(cè)，反應(yīng)完成后不開(kāi)蓋，很好地杜絕了污染，有效防止了假陽(yáng)性。

綜上，我們應(yīng)用LAMP法對(duì)沙門(mén)菌進(jìn)行了快速檢測(cè)，特異性強(qiáng)，靈敏度高。LAMP法雖然擴(kuò)增原理復(fù)雜，但操作簡(jiǎn)便、用時(shí)少、靈敏度高、特異性強(qiáng)，再加上其等溫反應(yīng)條件，因此適用于檢驗(yàn)檢疫部門(mén)和衛(wèi)生醫(yī)療單位對(duì)沙門(mén)菌的檢測(cè)，并有望成為簡(jiǎn)易的常規(guī)檢測(cè)手段應(yīng)用于基層單位。

圖4 LAMP法和PCR法檢測(cè)糞便樣本中腸炎沙門(mén)菌的靈敏度比較A：LAMP法濁度儀檢測(cè)結(jié)果；B：LAMP法HNB顯色結(jié)果；C：PCR法檢測(cè)結(jié)果；M：D2000 DNA marker；1～8：腸炎沙門(mén)菌基因組DNA濃度 依 次 為 69.7、6.97、0.697 ng/μL 和 69.7、6.97、0.697、0.0697、0.00697 pg/μL

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