結(jié)核分枝桿菌脂阿拉伯甘露聚糖的提純及活性初步鑒定

戴振華，郭蘭芹，馮曉燕，張立，郄霜,4，楊錫琴，修冰水，陳堃，彭瑞云，張賀秋

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 a.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；b.放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所；北京 100850；

2.華北石油總醫(yī)院，河北 任丘 062552；3.天津海河醫(yī)院，天津 300350；4.河北聯(lián)合大學(xué)，河北 唐山 063000

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是一種古老的疾病，自上世紀(jì)90年代，本已得到控制的肺結(jié)核又在世界范圍內(nèi)廣泛流行，每年超過(guò)200萬(wàn)人死于TB[1]。2009年,世界衛(wèi)生組織發(fā)布報(bào)告，2008年中國(guó)TB發(fā)病人數(shù)為100萬(wàn)～160萬(wàn)，僅次于印度，居世界第2位。這表明TB的預(yù)防和控制在我國(guó)尤為重要。

脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan，LAM）是分枝桿菌細(xì)胞壁的重要組成部分，包含9個(gè)單克隆抗體結(jié)合表位，屬結(jié)核分枝桿菌特異性抗原，具有較強(qiáng)的免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能，可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體[2]，因而是結(jié)核病血清學(xué)診斷中應(yīng)用較廣的抗原。

我們參照有關(guān)文獻(xiàn)[3]，初步建立了從結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）中提取和純化LAM的方法，并采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)結(jié)核患者血清中的抗LAM抗體，取得了較為滿(mǎn)意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 血清標(biāo)本

64例肺結(jié)核病患者來(lái)自天津海河醫(yī)院，全部為連續(xù)納入的臨床新近診斷的活動(dòng)性肺結(jié)核患者，未合并感染HIV，未接受抗結(jié)核治療或治療時(shí)間不超過(guò)2周。67份健康對(duì)照血清樣本來(lái)自健康獻(xiàn)血員，無(wú)臨床癥狀，未感染其他疾病。

1.2 材料

MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37RV由本室保存；改良羅氏培養(yǎng)基購(gòu)自貝索公司；羊抗兔IgG-HRP購(gòu)自中杉金橋公司；兔抗LAM購(gòu)自Mossman Associates Inc公司；L-阿拉伯糖購(gòu)自Sigma公司；硝酸纖維素膜為Pall公司產(chǎn)品；甲醇、氯仿、苯酚、95%乙醇、硫酸均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品；離心機(jī)為Sigma公司產(chǎn)品；細(xì)胞粉碎機(jī)為寧波新芝超聲設(shè)備有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)為UNICO公司產(chǎn)品；凝膠成像儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 LAM抗原的提純

將MTB H37RV接種在羅氏雞蛋培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)3～4周，收取菌落，100℃滅活2 h，用蒸餾水和PBS（pH7.4）各洗滌1次，再用氯仿∶甲醇（2∶1）混合液脫脂3次，去除菌體中的培養(yǎng)基成分，用PBS（pH7.4）懸浮，冰浴超聲破碎（超聲30 s，停30 s，共10 min），8000 r/min離心取上清，加入40%的苯酚萃?。?0℃ 1 h），4℃、8000 r/min離心取上清，用蒸餾水透析2 d，用2倍體積的95%乙醇沉淀，LAM存在于上清液中，分裝，凍干。

1.4 LAM的鑒定

將提純的LAM進(jìn)行SDS-PAGE，分別用考馬斯亮藍(lán)染色和Western印跡鑒定；將LAM轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h；以兔抗LAM為一抗，4℃孵育過(guò)夜；用TBST洗膜3次，每次5 min；用羊抗兔IgG-HRP室溫孵育1 h；用TBST洗膜3次，每次5 min；用TBS洗膜1次，5 min；加化學(xué)發(fā)光液，于成像儀中照像。

1.5 LAM的含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法檢測(cè)糖含量。以雙蒸水為空白對(duì)照，以L(fǎng)-阿拉伯糖為糖標(biāo)準(zhǔn)，分別配制1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)糖溶液；取雙蒸水200 mL、樣品200 mL、糖標(biāo)準(zhǔn)液200 mL，各加入濃硫酸1 mL、9%苯酚200 μL，搖勻后置暗處30 min；測(cè)定D485nm值，空白調(diào)零后，以糖濃度為橫坐標(biāo)、D485nm值為縱坐標(biāo)，制作濃度范圍0.1～1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，直線(xiàn)回歸計(jì)算樣品中的糖含量。

1.6 ELISA法檢測(cè)血清中的抗LAM抗體

用純化的LAM包被酶聯(lián)測(cè)定板，包被液（0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋?zhuān)靠?.125 mg抗原包被96孔酶聯(lián)板，4℃過(guò)夜，洗板2次，每次1 min；用1%牛血清白蛋白（BSA）磷酸鹽緩沖液（pH7.4）室溫封閉4 h，拍干；新鮮血清樣本用稀釋液按1∶10稀釋后加入96孔酶聯(lián)板，37℃孵育30 min，洗板5次，每次1 min；分別加入抗人IgG酶結(jié)合物，37℃孵育20 min，洗板5次，每次1 min；將顯色液A和B按照1∶1的比例混合后加入各孔，37℃孵育10 min，加入終止液終止顯色，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)樣本的D450nm值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 4對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LAM鑒定結(jié)果

樣品經(jīng)SDS-PAGE，凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色，未見(jiàn)明顯條帶，說(shuō)明提純得到的樣品基本不含蛋白質(zhì)；經(jīng)Western印跡分析（圖1），LAM遷移范圍相對(duì)分子質(zhì)量為25×103～40×103，主要集中在35×103處。

2.2 LAM含量測(cè)定結(jié)果

1.13 g濕重菌體經(jīng)超聲離心后去除沉淀0.86 g，得到粗制細(xì)胞壁0.27 g，提純得到LAM共4 mL，經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)定，樣品中的糖含量為3 mg/mL。最終提取得到12 mg LAM，LAM總收率約10.6 mg/g濕菌體。

2.3 血清標(biāo)本ELISA檢測(cè)結(jié)果

以純化的LAM為抗原，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)64例結(jié)核病患者、67例健康體檢者的血清，結(jié)果見(jiàn)表1。LAM抗體在結(jié)核組明顯高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.668，P＜0.001）。以D450nm值≥健康體檢組的 D450nm均值+2s（cut-off值=0.2045）為陽(yáng)性，檢測(cè)的敏感性為67.19%（43/64，95%CI：54.31%～78.41%），特異性為95.52%（64/67，95%CI：87.47%～99.07%）（圖2）。圖3為抗LAM抗體檢測(cè)的ROC曲線(xiàn)（曲線(xiàn)下面積=0.9228，面積越接近1說(shuō)明檢測(cè)的性能越好）。

3 討論

細(xì)菌細(xì)胞表面的成分通常被視為尋找新的疫苗和診斷的重要靶標(biāo)。LAM是構(gòu)成結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的重要糖脂，占細(xì)菌總重量可能高達(dá)15 mg/g，其特征最早在1980年確定[4]。LAM由甘露聚糖主鏈組成，連接含有糖精側(cè)鏈的寡阿拉伯糖，前者連接到磷脂酰肌醇的脂質(zhì)錨定基團(tuán)[5]。已報(bào)道LAM在感染的宿主中對(duì)免疫系統(tǒng)影響廣泛，從結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌中分離得到的LAM可引起T細(xì)胞增殖的抑制[6]，干擾γ-干擾素介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的活化，清除毒性氧自由基，抑制蛋白激酶活性[7]，合成mRNA編碼的白細(xì)胞介素-2、-5，及刺激人T-細(xì)胞中的粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞形成集落刺激因子[8]，促進(jìn)單核細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子[9]，活化和調(diào)解補(bǔ)體[10]。這些發(fā)現(xiàn)表明，LAM很可能在結(jié)核病及其他分枝桿菌感染疾病的發(fā)病機(jī)理中起很大作用。

表1 抗LAM抗體血清檢測(cè)結(jié)果（n）

圖1 LAM的Western印跡1：預(yù)染marker；2：提純的LAM

圖2 抗LAM抗體血清檢測(cè)結(jié)果的散點(diǎn)圖

圖3 抗LAM抗體血清檢測(cè)形成的ROC曲線(xiàn)

在細(xì)胞表面，LAM作為一種免疫調(diào)節(jié)劑可以很容易地與宿主受體進(jìn)行相互作用[11]。LAM具有高免疫原性，在分枝桿菌感染過(guò)程中產(chǎn)生抗LAM抗體[2]，在血清中很容易檢測(cè)到抗LAM抗體[12]，檢測(cè)抗LAM抗體已用于診斷活動(dòng)性肺結(jié)核[12-13]。在循環(huán)抗原-抗體免疫復(fù)合物中會(huì)發(fā)現(xiàn)LAM抗原和抗LAM抗體聚集[13]。國(guó)內(nèi)在此方面的研究較少，而且沒(méi)有相關(guān)試劑盒，而進(jìn)口試劑相對(duì)較貴，限制了我國(guó)以L(fǎng)AM為靶標(biāo)的針對(duì)結(jié)核病的檢測(cè)。我們旨在尋找一種簡(jiǎn)單的LAM純化方法，將純化得到的LAM用于結(jié)核病的血清學(xué)檢測(cè)，使LAM抗體檢測(cè)試劑能?chē)?guó)產(chǎn)化，并為今后以L(fǎng)AM為基礎(chǔ)的研究提供材料來(lái)源，制備相應(yīng)抗體，對(duì)診斷和檢測(cè)MTB的感染，篩選抗結(jié)核藥物及預(yù)測(cè)抗結(jié)核治療的預(yù)后具有一定的價(jià)值。

關(guān)于LAM的純化，有離子交換、凝膠過(guò)濾色譜法的組合[4]，疏水性相互作用色譜法[14]及Sephacryl S-100凝膠柱層析法[15]，但都比較繁瑣。我們?cè)赪u[3]方法的基礎(chǔ)上略做改動(dòng)，添加了脫脂去除培養(yǎng)基成分，再通過(guò)苯酚萃取、乙醇沉淀，得到LAM，取得較理想的濃度和純度。此法總的處理時(shí)間只需要3 d，操作簡(jiǎn)單，得率高。LAM是由多種成分組成的異質(zhì)體，不同異質(zhì)體由不同的糖基化和酸基化程度決定，用此法得到的LAM能覆蓋不同大小的LAM。

利用純化得到的LAM，通過(guò)ELISA方法初步檢測(cè)64例結(jié)核病患者、67例健康體檢者血清，檢測(cè)敏感性為67.19%，特異性為95.52%。Sada[16]等研究表明，在痰涂片培養(yǎng)陽(yáng)性的活動(dòng)性肺結(jié)核患者中檢測(cè)的敏感性為88%，在痰抗酸染色陰性的活動(dòng)性肺結(jié)核患者中檢測(cè)的敏感性為67%，在合并HIV感染的肺結(jié)核患者中檢測(cè)的敏感性為57%，特異性均為100%。敏感性和特異性的差異可能與抗原濃度、包被濃度、血清稀釋度、酶標(biāo)抗體的效價(jià)，以及顯色系統(tǒng)都有一定的關(guān)系；本次檢測(cè)的樣品數(shù)量較少、樣品未分組也是差異形成的原因，仍需要擴(kuò)大樣本量來(lái)進(jìn)一步確定此LAM的應(yīng)用價(jià)值。

抗原檢測(cè)可以克服抗體檢測(cè)不能鑒別是MTB的急性感染還是以往對(duì)MTB的暴露，能解決TB早期診斷的缺陷。大量研究表明[17-18]，在結(jié)核病患者體液，如痰、血液、胸腔積液和腦脊液，特別是尿液中，都能檢測(cè)到LAM抗原，檢測(cè)的敏感性為20%～91%，特異性為83.3%～100%。國(guó)內(nèi)尚無(wú)檢測(cè)LAM抗原的商業(yè)化試劑盒，因此還需要我們進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)LAM抗體制備和LAM抗原檢測(cè)的研究探索。

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