一種基于聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物富集糖肽的新策略

鄧珊珊，曹琦琛，馬成，白海紅，任曉君，應(yīng)萬濤，蔡耘

1.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230032；2.蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點實驗室，北京蛋白質(zhì)組研究中心，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 102206；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032

蛋白質(zhì)糖基化是最常見的翻譯后修飾之一[1]。它不僅在蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、溶解性、折疊和功能方面起著關(guān)鍵作用，還在細胞內(nèi)參與蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運、定位和分子識別[2-3]。此外，異常糖基化也被證明和癌癥等疾病相關(guān)[4-5]，許多糖蛋白可以作為臨床生物標志物和治療靶點[6]。因此，糖蛋白和糖肽的分離、發(fā)現(xiàn)和鑒定變得越來越重要，它可以幫助我們更好地理解許多生物過程，并找到一些新的潛在的診斷標志物和治療靶點。以生物質(zhì)譜技術(shù)為主的規(guī)模化糖肽定性與定量分析，已成為當前蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究的一個重要內(nèi)容。由于糖肽僅占所有酶解后肽段的小部分（2%～5%）[7]，其質(zhì)譜響應(yīng)很容易被高豐度非糖肽抑制。另外，由于糖鏈的微觀不均一性，一個糖基化位點上的糖鏈類型可能多達幾十種，進一步降低了糖肽的相對量而使得它們很難被檢測到。因此，針對糖肽的特異性富集就顯得至關(guān)重要。目前，最常用的糖肽富集手段是凝集素親和[8-9]。不同的凝集素可以特異性地識別不同的糖型，如伴刀豆凝集素ConA對于高甘露糖型和雜合型N-糖都顯示出了很好的親和性。除凝集素親和富集外，其他手段如分子排阻[10]、親水色譜[11-12]、酰肼富集[13-14]也都廣泛應(yīng)用于糖肽的富集。但是，各種富集手段都存在一定的缺點。例如，凝集素不能針對所有糖型富集；親水富集會帶來假陽性和假陰性的鑒定結(jié)果；肼化學(xué)富集法操作繁瑣，特異性不強。這些都使得糖蛋白組學(xué)研究的進展相對落后于磷酸化、泛素化等翻譯后修飾。

樹枝狀聚合物由于具有高度支化的三維球狀立體結(jié)構(gòu)和眾多的末端基團，顯示出與相應(yīng)線型分子截然不同的性質(zhì)[15]，如低黏度、良好的溶解性和大量可修飾的末端官能團等，使其具有廣泛的應(yīng)用前景，而且合成相對簡單、成本低，因此成為近年來聚合物科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點[16-17]。聚酰胺-胺［poly（amido?amine），PAMAM］型樹枝狀聚合物是其中較典型的、也是當前研究和應(yīng)用較多的一類[18]。由于樹枝狀聚合物具有大量端基、分子間無纏結(jié)、低黏度和優(yōu)異的流動性質(zhì)，并且其表面官能團隨相對分子質(zhì)量和分子尺寸遞增，近年來已有很多將樹枝狀聚合物應(yīng)用到蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的例子[19-21]。在此，我們首次嘗試把PAMAM固定于溴化氰活化的瓊脂糖凝膠表面，并將之用于糖肽的選擇性分離。

1 材料和方法

1.1 材料

5～6周的雄性C57小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心；第6代PAMAM型樹枝狀聚合物（PAMAM-G6，10%）、第4代PAMAM型樹枝狀聚合物（PAMAM-G4，10%）購自山東威海晨源新材料有限公司；溴化氰瓊脂糖凝膠（CNBr-activated Sepha?rose 4B）、牛血清白蛋白（BSA）、馬心肌蛋白（MYO）、牛胎球蛋白（fetuin）、N-糖酰胺酶 F（PNGase F）、α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA，95%）、三氟乙酸（TFA，99%）、氰基硼氫化鈉（NaCNBH3）、高碘酸鈉（NaIO4）、尿素、十二烷基硫酸鈉（SDS）及己二酸二酰肼瓊脂糖（adipic acid dihydrazide-Agarose）均購自Sigma公司；甲酸（FA）購自Acros公司；色譜級乙腈（ACN）、甲醇（CH3OH）購自J.T.Baker公司；1，4-二硫蘇糖醇（DTT，98%）、碘乙酰胺（IAA，98%）、測序級胰蛋白酶（15 276 U/mg）購自Promega公司；Amicon Ultra-0.5、30 kD超濾管購自Millipore公司；膜離心吸附柱購自Thermo公司；Sep-Pak C18固相萃取小柱購自Waters公司；所有實驗用水由Milli-Q純水系統(tǒng)提供；其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜（MALDITOF-TOF/MS，AB Sciex公司）；Agilent 1100毛細管高效液相色譜-電噴霧-線性離子阱-傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（nanoLC-ESI-LTQ-FT，Thermo Finnigan公司）；Milli-Q純水系統(tǒng)（Millipore公司）；PB-10型pH計、BP211d分析天平（Sartorius公司）；DH-Ⅱ旋轉(zhuǎn)混合器、HS-3垂直混合儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；QL-901型渦旋混合儀（其林貝爾儀器制造有限公司）；NanoDrop 2000c超微量紫外分光光度計（Thermo Fisher Scientific公司）；3K30型高速離心機（Sigma公司）；電熱恒溫水浴箱（北京醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 合成固定化的樹枝狀聚合物材料

取400 μL 1 mmol/L HCl活化60 mg溴化氫瓊脂糖凝膠15 min，轉(zhuǎn)至膜離心吸附柱內(nèi)，用1 mmol/L HCl、結(jié) 合 溶 液（0.5 mol/L NaCl和 0.1 mol/L CH3COONa，pH8.3）各洗滌3次（每次200 μL），均分成2份，分別加入50 μL PAMAM-G6凍干粉和50 μL PAMAM-G4凍干粉，加入結(jié)合溶液400 μL，室溫結(jié)合過夜，然后用200 μL結(jié)合溶液離心清洗5次，加入 0.1 mol/L 封閉溶液（0.1 mol/L Tris-HCl，pH8.0）常 溫 封 閉 2 h，用 清 洗 溶 液 1（0.1 mol/L CH3COONa 和 0.5 mol/L NaCl，pH4.0）、清洗溶液 2（0.1 mol/L Tris-HCl和0.5 mol/L NaCl，pH8.0）各洗4次（每次 200 μL），加入 80%ACN/0.1%TFA 至PAMAM終濃度為2 μg/μL，儲存于4℃冰箱。

1.3 蛋白酶切

1.3.1 標準蛋白BSA和牛胎球蛋白酶切 將標準蛋白樣品溶解于 50 μL 50 mmol/L NH4HCO3，加入0.5 μL 1 mol/L DTT，蛋白終濃度為 10 mmol/L，95℃變性10 min；加入2.5 μL 1 mol/L IAA，室溫暗處放置45 min烷基化，蛋白終濃度為50 mmol/L；加入 1 μL 1 mol/L DTT，封 閉 剩 余 的 IAA；加 入NH4HCO3至蛋白終濃度為2 μg/μL；按蛋白∶酶為1∶50的比例加入胰蛋白酶，37℃水浴酶切過夜；樣品存放于4℃冰箱待用。

1.3.2 鼠腦組織蛋白提取及酶切 C57小鼠于實驗前16 h禁食，自由飲水；斷頸處死后迅速取出鼠腦，浸入冰冷的PBS緩沖液中，洗凈殘血，去除結(jié)締組織，稱重；將腦組織剪碎，加入5倍體積的裂解液（8 mol/L 尿素，4%SDS，0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L DTT，pH7.6），并在研缽內(nèi)勻漿10次，達到充分碎裂細胞的目的；將樣品加入15 mL離心管中，在4℃條件下混勻，15 min后進行超聲波提取及離心；超聲波儀設(shè)置為脈沖工作模式，即工作1 s、間隔1 s，總時間為30 s，循環(huán)8次；4℃下混懸30 min，使蛋白充分溶解，最后在10℃下以40 000 r/min離心1 h，取上清液（含有胞漿蛋白和部分亞細胞結(jié)構(gòu)中的膜蛋白）用NanoDrop 2000c測量蛋白濃度后備用。

參照過濾-輔助的樣品制備（FASP）[22]方法酶切鼠腦蛋白：取50 μL鼠腦蛋白提取液，加入50 μL 100 mmol/L DTT［用 4%SDS、100 mmol/L Tris/HCl（pH7.6）溶解］，95℃變性5 min，轉(zhuǎn)移至30 kD超濾管中，加入200 μL尿素，4℃、14 000 r/min離心15 min，重復(fù)1次；加入100 μL 50 mmol/L IAA溶液，550 r/min振蕩1 min，室溫下暗處烷基化20 min，14 000 r/min離心15 min；加入200 μL尿素，同樣轉(zhuǎn)速離心15 min，置換多余的IAA；加入100 μL 50 mmol/L NH4HCO3，14 000 r/min離心10 min，重復(fù)2次，棄去濾液；最后加NH4HCO3至蛋白終濃度為2 μg/μL，按蛋白∶酶為1∶50的比例加入胰蛋白酶，37℃烘箱過夜酶切，酶切結(jié)束后，14 000 r/min離心10 min；繼續(xù)加入 100 μL NH4HCO3，14 000 r/min離心10 min；合并濾液，存于4℃冰箱待用。

1.4 糖肽富集

1.4.1 肽段脫鹽 用Sep-Pak C18固相萃取小柱對富集前的肽段脫鹽。先用1 mL ACN活化小柱，再用1 mL 0.1%TFA溶液平衡小柱，然后將酶切樣品溶液（用TFA調(diào)整pH值為3）加載于脫鹽柱上，并用1 mL 0.1%TFA 溶液 沖洗 1 次 ，最后 用 600 μL 80%ACN/0.1%TFA溶液洗脫肽段，取5 μL洗脫溶液置熱干機中熱干，等體積水溶后用NanoDrop 2000c定量。

1.4.2 糖肽富集 加入終濃度為10 mmol/L NaIO4至脫鹽后的肽段溶液，4℃避光氧化l h，使其將糖單元上的鄰二羥基氧化為醛基；向氧化后的溶液中加入0.1%TFA降低ACN濃度，脫鹽后溶于400 μL 80%ACN/0.1%TFA；加入一定量的固定化的材料后，于垂直混合儀上混合過夜，取出，稀釋至ACN濃度低于10%，轉(zhuǎn)入30 kD超濾管，14 000 r/min離心30 min，用合適的清洗溶劑去除非特異性吸附，直至濾液質(zhì)譜信號低于50。

1.4.3 糖鏈切除 按照酶/蛋白為1 U/10 μg的比例將PNGase F加入富集得到的糖肽中，常溫酶切3 h，將N-糖基化肽段從聚合物上釋放，離心收集，進行質(zhì)譜分析鑒定。

1.5 質(zhì)譜采集方法

1.5.1 MALDI-TOF-TOF/MS分析 樣品與基質(zhì)溶液（CHCA溶于50%ACN/0.1%TFA，5 g/L）以1∶1的體積比混合均勻，取0.8 μL點靶，用馬心肌紅蛋白的胰蛋白酶酶切肽段作為標準物對儀器進行外標校正，相對標準偏差＜10 ppm，進行質(zhì)譜分析。采用正離子反射檢測模式進行一級質(zhì)譜分析。一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集采用MS-1kv反射模式，加速電壓20 kV，掃描范圍m/z為1000～4000，激光能量4500，每張譜圖由1750個亞譜累加獲得。

1.5.2 HPLC-ESI-LTQ-FT MS 分析 高效液相色譜采用Agilent 1100毛細管液相色譜儀，自動進樣器上樣。通過該色譜系統(tǒng)將樣品組分進行色譜分離后，由ESI離子源進入質(zhì)譜進行分析。液相色譜流動 相 A 為 2%ACN、0.1%FA，流 動 相 B 為 80%ACN、0.1%FA。洗脫梯度：0～90 min，6%～40%B；90～105 min，40%～100%B；105～120 min，100%B；用100%A平衡30 min后進行下一次分離。上樣量25 μL，流動相流速300 nL/min。質(zhì)譜選用正離子模式采集數(shù)據(jù)，掃描范圍設(shè)置為375.0～1500.0（m/z），采集時間為110 min。選取一級質(zhì)譜中10個信號最強的離子進行二級分析，其碰撞能量為35 V，采用動態(tài)排除功能（dynamic exclusion），排除時間30 s。

1.6 數(shù)據(jù)庫檢索與分析

MALDI-TOF-TOF/MS儀器控制軟件為4800 Explorer software。ESI-LTQ-FT MS質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)檢索均使用pFind軟件；數(shù)據(jù)庫為UniProtKB mouse（2013-04-01更新），胰蛋白酶為蛋白質(zhì)水解酶，且最多允許2個漏切位點；半胱氨酸烷基化設(shè)置為固定修飾；將甲硫氨酸氧化設(shè)置為可變修飾；母離子質(zhì)量偏差（mass tolerance）為20 ppm；碎片離子設(shè)置為0.8 Da。搜索的數(shù)據(jù)結(jié)果用PEAKS軟件合并計算，軟件參數(shù)設(shè)置：假陽性率（FDR）≤1%，Deltacn=0.1。糖基化位點通過2個規(guī)則確定：①天冬氨酸殘基有0.9840 Da質(zhì)量位移；②天冬氨酸殘基必須在N-XS/T/C的結(jié)構(gòu)域中。

2 結(jié)果和討論

2.1 糖肽富集策略的建立及材料表征

本研究目的在于利用PAMAM大量末端氨基來開發(fā)一種糖肽富集新材料。首先利用親和加成反應(yīng)，將大量N端的樹枝狀聚合物固定到溴化氰活化的瓊脂糖凝膠上，單糖結(jié)構(gòu)中的順式鄰位羥基可以被高碘酸氧化產(chǎn)生醛基，醛基可以與氨基形成希夫堿，高密度的氨基有利于提高反應(yīng)效率，從而實現(xiàn)糖肽的高效富集。用膜離心吸附柱阻截結(jié)合糖肽的聚合物，經(jīng)PNGase F處理從固相載體上釋放糖肽，并采用質(zhì)譜對糖肽進行序列鑒定和位點確認。由于希夫堿的生成反應(yīng)是可逆反應(yīng)，為使反應(yīng)向正方向進行，提高反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，通常加入一定的還原劑，或通過優(yōu)化反應(yīng)條件，如反應(yīng)時間、溫度、pH值和溶劑系統(tǒng)及反應(yīng)試劑的比例來實現(xiàn)。實驗中，我們首先對該聚合物富集條件進行優(yōu)化，并利用優(yōu)化后的方法，開展復(fù)雜體系中糖肽的特異性富集和鑒定試驗。

2.2 材料表征結(jié)果

瓊脂糖凝膠經(jīng)第4代和第6代樹枝狀聚合物修飾前、后的凝膠掃描電鏡結(jié)果如圖1，用放大200倍的掃描電鏡能看出凝膠顆粒表面光潔度已有不同，放大1000倍后發(fā)現(xiàn)修飾后的顆粒粒徑增大了0.1 mm，顆粒表面也凹凸不平，證明材料被成功地固定到固相載體上。進一步以不同放大倍數(shù)的透射電鏡驗證，顆粒修飾前呈均一陰影，而修飾后有很多不均勻的黑點，材料表面凹凸不平，說明不同代數(shù)的樹枝狀聚合物材料都被成功地固定化。

2.3 富集條件的優(yōu)化

2.3.1 還原劑的考察 PNGase F酶切是最普遍的N-糖鏈釋放方法，幾乎可以水解糖肽和糖蛋白中所有的N-糖鏈，它可以切割分離與糖肽/糖蛋白天冬酰胺殘基直接相連的N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc），使天冬酰胺（Asn）轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼幔ˋsp），產(chǎn)生0.9847的質(zhì)量變化。對于氨基和醛基的反應(yīng)，一方面反應(yīng)完全程度隨反應(yīng)溫度升高而不斷提高，另一方面當溫度大于50℃則易導(dǎo)致PAMAM環(huán)化成己內(nèi)酰胺，造成結(jié)構(gòu)缺陷[23]。因此，所有反應(yīng)要在低溫（25℃～50℃）下進行?？紤]到PNGase F的活性，所有實驗在室溫下進行。富集條件的考察均由PAMAM-G6對標準蛋白牛胎球蛋白的富集結(jié)果確定。

由于醛基與氨基之間為可逆反應(yīng)，溫度并不是影響此反應(yīng)完全程度的關(guān)鍵，該反應(yīng)的核心問題是使反應(yīng)不斷向正向進行，提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。牛胎球蛋白是一個研究較多的糖蛋白，它的胰酶酶切肽段包括3個N-連接和至少3個O-連接糖基化肽段[24]。圖2A為30 μg牛胎球蛋白溶于100 μL NH4HCO3經(jīng)PNGase F酶切得到的質(zhì)譜圖，只能檢測到1個糖肽信號（m/z 1741.7），加入 90 μg PAMAM-G6 富集后，糖肽信號峰1741.7有了明顯提高（圖2B），但仍然不能檢測到另外2條糖肽信號，而在偶合反應(yīng)中加入還原劑NaCNBH3后可以檢測到3條糖肽峰（圖2C），分別是 m/z 1741.7、m/z 3018.4 和 m/z 3673.7，所以還原劑可以促進反應(yīng)不斷向正向進行。

圖1 溴化氰活化的瓊脂糖凝膠修飾前后掃描電鏡結(jié)果A：修飾前；B：經(jīng)PAMAM-G4修飾后；C：經(jīng)PAMAM-G6修飾后

圖2 牛胎球蛋白酶切肽段在糖肽富集前后的質(zhì)譜圖A：未富集；B：未加還原劑富集；C：加入還原劑富集；N#表示N-連接糖肽序列中的天冬氨酸殘基

2.3.2 反應(yīng)體系酸度的考察 根據(jù)文獻報道，醛基和氨基在二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）和ACN中反應(yīng)專一，雜質(zhì)峰少，因甲醇和四氫呋喃（THF）毒性較大，所以我們選擇ACN作為反應(yīng)溶劑。對于氨基試劑，在堿性催化劑下的反應(yīng)轉(zhuǎn)化率很低，在酸性催化劑存在下反應(yīng)轉(zhuǎn)化率較高，實驗選取30 μg牛胎球蛋白肽段加入90 μg凝膠材料，考察在不同酸度條件下的富集情況，結(jié)果見表1。牛胎球蛋白酶切后產(chǎn)生3條糖肽，當結(jié)合溶液pH值不斷降低（從3.08到2.18）時，酸度提高，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率增加，從只能檢測到1條糖肽到3條糖肽均能被檢出；當溶液pH值繼續(xù)降低（從2.18到0.45）時，質(zhì)譜檢測結(jié)果中非特異性吸附的肽段明顯增加，這些干擾造成低豐度糖肽被抑制，只能檢測到高豐度的糖肽 1741.7。結(jié)果表明，以 80%ACN/0.1%TFA（pH2.18）作為結(jié)合溶液時，可以特異地富集3條糖肽，最終選擇此反應(yīng)體系。

2.3.3 清洗條件的考察 低代的樹枝狀聚合物分子具有擴展的或“開放式”結(jié)構(gòu)，隨著代數(shù)增加，末端基團變得很擁擠，導(dǎo)致了樹枝狀聚合物采取致密的球狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部具有廣闊的空腔，材料在與糖肽結(jié)合過程中除了共價結(jié)合糖肽分子以外，也可能會非共價包裹一些非糖肽分子，必須采用合適的洗脫溶劑才能有效去除非特異性吸附的非糖肽。我們考察了不同清洗溶劑的清洗情況，依次用500 μL的1.5 mol/L NaCl、8 mol/L 尿 素 、60%CH3OH、50 mmol/L NH4HCO3各洗脫1次，收集每次洗脫得到的溶液，脫鹽處理后進行質(zhì)譜分析，在給定質(zhì)譜能量下質(zhì)譜檢測信號低于50，我們認為非特異性結(jié)合的肽段被去除干凈。

表1 牛胎球蛋白胰蛋白酶酶切肽段在不同pH值結(jié)合溶液中富集獲得糖肽的結(jié)果

2.3.4 反 應(yīng) 試 劑 比 例 的 考 察 取 不 同 量 的PAMAM-G6對等量的牛胎球蛋白肽段（30 μg）進行富集（質(zhì)量比分別為0.5∶1、2.5∶1、5∶1、7.5∶1、10∶1），MALDI-TOF-TOF/MS 分析表明糖肽m/z 1741.7峰的強度隨PAMAM-G6的用量發(fā)生變化（圖4），PAMAM-G6富集蛋白的最優(yōu)比為5∶1，此時基峰強度不再增加，富集效果也達到最好。

2.4 樣品復(fù)雜性對富集效果的影響

在優(yōu)化好相關(guān)富集條件后，我們探索PAMAMG6針對糖肽富集的選擇性，以保證聚合物材料能夠從一個較復(fù)雜的體系中選擇性地分離富集糖肽。將糖蛋白牛胎球蛋白和非糖蛋白BSA的胰蛋白酶酶解產(chǎn)物按一定比例（1∶50，質(zhì)量比）混合后進行富集，富集前、后的質(zhì)譜圖如圖5?？梢钥吹剑肞AMAM-G6進行富集前只能檢測到大量強度很高的非糖肽峰，經(jīng)過聚合物材料富集之后，糖肽峰被保留，非糖肽峰減弱，說明材料具備很好的糖肽選擇性。

2.5 鼠腦裂解液糖肽富集

圖3 不同清洗溶劑質(zhì)譜圖A：1.5 mol/L NaCl；B：8 mol/L尿素；C：60%CH3OH；D：50 mmol/L NH4HCO3

圖4 不同PAMAM-G6用量條件下的糖肽回收情況

通過以上標準糖蛋白考察實驗，我們初步建立了優(yōu)化的PAMAM-G6富集糖肽的新方法：選擇反應(yīng)體系為80%ACN/0.1%TFA，并在結(jié)合過程中加入還原劑，材料過量5倍，以 1.5 mol/L NaCl、8 mol/L尿素、60%CH3OH、50 mmol/L NH4HCO3為清洗溶液。我們將這一優(yōu)化的富集條件應(yīng)用于200 μg鼠腦全蛋白裂解液液中糖肽的富集，同時采用PAMAM-G4和PAMAM-G6按同樣的操作流程富集，作為對比，取市售酰肼化瓊脂糖凝膠50 μL用于同量鼠腦全蛋白裂解液中糖肽的富集。利用PEAKS軟件搜索質(zhì)譜raw文件，手動篩選出打分高于15的肽段，得到的結(jié)果按照1.6中的規(guī)則處理。

結(jié)果表明，鼠腦全蛋白裂解液在富集前糖肽占全部肽段比例不到1%，經(jīng)過商業(yè)化酰肼材料富集后鑒定到的糖肽比例增加到14%，說明商業(yè)化酰肼材料可以提高糖肽的富集效率。經(jīng)PAMAM-G4富集后，從鼠腦198條肽段中鑒定出56條非冗余糖肽，占總肽段數(shù)目的28%；經(jīng)PAMAM-G6富集后，從鼠腦632條肽段中鑒定出204條非冗余糖肽，占總肽段數(shù)目的32%。很明顯，不同代數(shù)聚合物對糖肽的選擇性均高于商業(yè)化酰肼材料。從圖6可知，等量的鼠腦全蛋白裂解液經(jīng)PAMAM-G4富集后鑒定到56條非冗余糖肽，經(jīng)PAMAM-G6富集后鑒定到204條非冗余糖肽，PAMAM-G4鑒定到的糖肽數(shù)目低于PAMAM-G6。我們推測這主要是因PAMAM獨特的結(jié)構(gòu)特征所致，1個分子PAMAM-G6含末端氨基256個，而1個分子PAMAM-G4含末端氨基64個，前者的末端官能基團數(shù)目是后者的6倍，這種差異導(dǎo)致后者的糖肽結(jié)合數(shù)目大于前者，富集效率也得到了提高。

圖5 牛胎球蛋白和BSA肽段混合物經(jīng)PAMAM-G6富集前（A）、后（B）的質(zhì)譜圖N#：N-連接糖肽序列中的天冬氨酸殘基

2.6 結(jié)論

圖6 鼠腦糖肽鑒定結(jié)果的相關(guān)性

目前，有關(guān)樹枝狀聚合物的研究不僅集中在揭示其獨特的性質(zhì)和性能方面，而且逐步轉(zhuǎn)移到功能化和應(yīng)用上，其應(yīng)用研究是一個新興的、很有吸引力的領(lǐng)域。在本研究中，我們首次將不同代數(shù)的樹枝狀聚合物材料PAMAM固定化于溴化氰活化的瓊脂糖凝膠表面，并將之用于糖肽富集，采用優(yōu)化的方法，在鼠腦中富集并鑒定到218條非冗余糖肽，無論是富集糖肽的特異性還是鑒定到的糖肽總數(shù)，均較商業(yè)化材料顯示出更好的效果。我們推測，基于樹枝狀聚合物的新材料的開發(fā)，包括將其固化于納米磁珠材料、選擇更新代數(shù)的聚合物和不同的表面反應(yīng)基團等，將有望更好地實現(xiàn)對糖肽的針對性富集。

[1] H?gglund P,Bunkenborg J,Elortza F,et al.A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignmentoftheirglycosylation sitesusingHILIC enrich?ment and partial deglycosylation[J].Proteome Res,2004,3(3):566.

[2] Kazuaki O,Marth J D.Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease[J].Cell,2006,126(5):855-867.

[3] Hann S R.Role of post-translational modifications in regulat?ing c-Myc proteolysis,transcriptional activity and biological function[J].Semin Cancer Biol,2006,16:288-302.

[4] Slawson C,Hart G W.O-GlcNAc signalling:implications for cancer cell biology[J].Nat Rev Cancer,2011,11,673-684.

[5] Leroy J G.Congenital disorders of N-glycosylation including diseases ssociated with O-as well as N-glycosylation defects[J].Pediatr Res,2006,60(6):643-656.

[6] Freeze H H,Aebi M.Altered glycan structures:the molecu?larbasis ofcongenitaldisorders ofglycosylation[J].Curr Opin Struct Biol,2005,15(5):490-498.

[7] Alvarez-Manilla G,Atwood J 3rd,Guo Y,et al.Tools for gly?coproteomic analysis:size exclusion chromatography facilitates identification of tryptic glycopeptides with N-linked glycosyl?ation sites[J].J Proteome Res,2006,5(3):701-708.

[8] Hiroyuki K,Haruna S,Yoshio Y.Lectin affinity capture,iso?tope coded tagging and mass[J].Nat Biotechnol,2003,21(6):667-672.

[9] Dai Z,Zhou J,Qiu S J,et al.Lectin-based glycoproteomics to explore and analyze hepatocellular carcinoma-related glyco?protein markers[J].Electrophoresis,2009,30(17):2957-2966.

[10]Qin H,Zhao L,Li R,et al.Size-selective enrichment of N-linked glycans using highly ordered mesoporous carbon materi?al and detection by MALDI-TOF MS[J].Anal Chem,2011,83(20):7721-7728.

[11]Pompach P,Chandler K B,Lan R,et al.Semi-automated identification ofN-Glycopeptidesby hydrophilic interaction chromatography,nano-reverse-phase LC-MS/MS,and glycan database search[J].J Proteome Res,2012,11(3):1728-1740.

[12]Selman M H,Hemayatkar M,Deelder A M,et al.Cotton HIL?IC SPE microtips for microscale purification and enrichment of glycans and glycopeptides[J].Anal Chem,2011,83(7):2492-2499.

[13]Malerod H,Graham R L,Sweredoski M J,et al.Comprehen?sive profiling of N-linked glycosylation sites in HeLa cells us?ing hydrazide enrichment[J].J Proteome Res,2013,12(1):248-259.

[14]Zhang Hui,Li Xiao-jun,Martin D B.Identification and quan?tification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry,stable isotope labeling and mass spectrometry[J].Nat Biotech?nol,2003,21(6):660-666.

[15]Zhong Tianping,Ai Pengfei,Zhou Jian,et al.Structures and propertiesofPAMAM dendrimer:a multi-scalesimulation study[J].Fluid Phase Equilibria,2011,302:43-47.

[16]Medina S H,El-Sayed M E H.Dendrimers as carriers for de?livery ofchemotherapeutic agents[J].Chem Rev,2009,109:3141-3157.

[17]Bullen H A,Hemmer R,Haskamp A.Evaluation of biotinylat?ed PAMAM dendrimer toxicity in models of the blood brain barrier:a biophysical and cellular approach[J].J Biomaterials Nanobiotechnol,2011,2:485-493.

[18]Domanski D M,Klajnert B,Bryszewska M.Incorporation of fluorescent probes into PAMAM dendrimers[J].Bioelectrochem?istry,2004,63(1):193-197.

[19]Iliuk A B,Martin V A,Alicie B M,et al.In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on met?al ion-functionalized soluble nanopolymers[J].Mol Cell Pro?teomics,2010,9:2162-2172.

[20]Kleifeld O,Doucet A,auf dem Keller U,et al.Isotopic label?ing of terminal amines in complex samples identifies protein N-termini and protease cleavage products[J].Nat Biotechnol,2010,3(28):281-288.

[21]Beaudette P,Nicholas A A,Huesgen P F,et al.Development of soluble ester-linked aldehyde polymers for proteomics[J].Anal Chem,2011,83:6500-6510.

[22]Wisniewski J R,Zougman A,Nagaraj N,et al.Universal sam?ple preparation method for proteome analysis[J].Nat Methods,2009,6:359-362.

[23]譚惠民,羅運軍.樹枝形聚合物[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2002:8.

[24]Dziegielewska K M,Brown W M,Casey S J,et al.The com?plete cDNA and amino acid sequence of bovine fetuin.Its ho?mologywith alpha 2HS glycoprotein and relation to other members of the cystatin superfamily[J].J Biol Chem,1990,265(8):4354-4357.