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    代謝工程改造大腸桿菌合成L-組氨酸

    2021-07-05 14:38:46李夢瑩呂雪芹劉延峰李江華堵國成吳劍榮劉龍
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2021年12期
    關(guān)鍵詞:核糖組氨酸磷酸

    李夢瑩,呂雪芹,劉延峰,李江華,堵國成,吳劍榮,劉龍*

    1(江南大學 未來食品科學中心,江蘇 無錫,214122)2(糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)

    L-組氨酸,又名α-氨基-β-咪唑基丙酸,是分子中含有咪唑核的堿性氨基酸[1]。在營養(yǎng)學的范疇里,組氨酸被認為是嬰幼兒必需的氨基酸[2]。L-組氨酸具有多種生理功能,對生長、組織修復以及治療潰瘍和胃酸過多等均具有重要的作用,還可以作為添加劑用于治療過敏、風濕性關(guān)節(jié)炎以及貧血等疾病,因此,其被廣泛應用于醫(yī)藥食品等行業(yè)[3]。

    生產(chǎn)組氨酸的方法主要有蛋白水解法、化學合成法和微生物發(fā)酵法。其中水解蛋白質(zhì)是組氨酸生產(chǎn)最為傳統(tǒng)的方法[4],但是,這種方法主要取決于富含天然蛋白質(zhì)的資源(如血粉或大豆)的可用性,很難滿足人們對組氨酸日益增長的需求[5];而通過化學合成法生產(chǎn)組氨酸容易產(chǎn)生外消旋混合物,通常被認為是“非天然”化合物,難以獲得食品藥品監(jiān)督管理局的批準,也較難被消費者接受[5];微生物發(fā)酵法是目前生產(chǎn)L-組氨酸的主流方法,因此L-組氨酸高產(chǎn)菌的選育成為當前的研究熱點。常用于生產(chǎn)L-組氨酸的微生物主要包括大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum,C.glutamicum)和粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens,S.marcescens)。不少研究者采用誘變結(jié)合組氨酸類似物篩選法選育L-組氨酸高產(chǎn)菌株。比如,KINO等[6]以具有1,2,4-三咪唑丙氨酸抗性的突變E.coliATCC21318為出發(fā)菌株,經(jīng)誘變處理后獲得1株組氨酸產(chǎn)量為14.2 g/L的菌株;以C.glutamicum為出發(fā)菌株,許益清等[7]通過定向進化選育出1株L-組氨酸為1~1.6 g/L的突變株;侯穎等[8]通過硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)、亞硝基胍(nitroso guanidine,NTG)和紫外(ultra violet,UV)逐級誘變,獲得1株高產(chǎn)L-組氨酸的S.marcescens突變菌株,L-組氨酸產(chǎn)量由最初的2.0 g/L提高到7.6 g/L?;瘜W誘變等非理性設(shè)計雖然能篩選出高產(chǎn)菌株,但該方法具有很大的盲目性和隨機性,往往很難獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株[7]。

    理性改造手段由于具有目的性強、勞動強度低、效果顯著、菌株穩(wěn)定性好等優(yōu)勢,目前已經(jīng)被廣泛應用[3]。本研究首先對E.coliBL21(DE3)中L-組氨酸操縱子進行改造,解除L-組氨酸對于操縱子前導肽的調(diào)控;然后將來源于S.marcescensZJZ626[8]的ATP轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶編碼基因hisG和核糖磷酸二磷酸激酶編碼基因Prs利用CRISPR/Cas9技術(shù)整合至基因組,獲得重組菌株B25,解除L-組氨酸對hisG的調(diào)控并增強前體物質(zhì)5-磷酸核糖-1-焦磷酸 (5-phosphoribosy-l-pyrophosphate,PRPP)的合成;最終菌株B25中L-組氨酸的產(chǎn)量由最初的8.5 mg/L增加至5 574.63 mg/L。

    1 材料與方法

    1.1 宿主和質(zhì)粒

    本實驗所有質(zhì)粒的構(gòu)建均在E.coliDH5α中進行,出發(fā)菌株為E.coliMG1655和E.coliBL21(DE3)。菌株E.coliDH5α、E.coliMG1655、E.coliBL21(DE3)、S.marcescensZJZ626、C.glutamicumATCC130132,質(zhì)粒pET28a(+)均為本實驗室保存,質(zhì)粒pBSG11[9]為周哲敏教授贈送,菌株詳情見表1,質(zhì)粒詳情見附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX20201221 005),引物詳情見附表2。

    表1 本文所用菌株Table 1 Strains used in this study

    1.2 載體構(gòu)建和菌株獲取

    1.2.1 載體構(gòu)建和菌株獲取

    使用附表2中的引物,以E.coliBL21(DE3)、C.glutamicumATCC130132、S.marcescensZJZ626的基因組和pBSG11、pET28a質(zhì)粒為模板,經(jīng)PCR擴增分別獲取hisG、hisG(C.glutamicum)、hisG(S.marcescens)序列和相應的線性化質(zhì)粒,進一步通過Gibson組裝獲取重組質(zhì)粒pBSG11-hisG和pET28a-hisG、pBSG11-hisG(C.glutamicum)和pET28a-hisG(C.glutamicum)、pBSG11-hisG(S.marcescens)和pET28a-hisG(S.marcescens)。采用類似的方法,獲取重組質(zhì)粒pBSG11-hisG(C.glutamicum)G233H/T235Q、pBSG11-hisG(C.glutamicum)G233H/T235Q/N215I、pBSG11-hisG(C.glutamicum)S143F/Δ209-281、pET28a-hisG(C.glutamicum)G233H/T235Q、pET28a-hisG(C.glutamicum)G233H/T23Q/N215I、pET28a-hisG(C.glutamicum)S143F/Δ209-281、pBSG11-hisG(S.marcescens)E271K、pET28-hisG(S.marcescens)E271K、pBSG11-hisGA10T、pBSG11-hisGC149Y、pBSG11-hisGA10T-C149Y-E271K、pET28a-hisGE271K、pET28a-hisGA10T、pET28a-hisGC149Y、pET28a-hisGA10T-C149Y-E271K、pBSG11-Prs、pBSG11-Prs(S.marcescens)。

    1.2.2 基因組整合表達的菌株構(gòu)建

    以基因組motA位點整合hisG(S.marcescens)為例,首先以質(zhì)粒pBSG11-hisG(S.marcescens)為模板擴增hisG(S.marcescens)基因,將Tac啟動子通過上游引物引入到目的基因前,以E.coliBL21(DE3)為模板擴增上下游同源臂。采用融合PCR的方法[10]進行上下游同源臂及目的基因的融合,從而構(gòu)建整合框。

    選擇整合位點motA,通過使用在線網(wǎng)站CHOPCHOP(https://chopchop.cbu.uib.no/)對sgRNA進行打分及排名,從而獲得合適的sgRNA序列[11]。將位點motA的sgRNA設(shè)計為:5′-GCCGCAACAATACCAAACGC-3′,以實驗室保存的pTarget質(zhì)粒為模板,以pT-motA-F/R為引物進行反向PCR擴增,42 ℃熱激90 s后,轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞中,單菌落測序正確后,獲得質(zhì)粒pTarget-motA。

    將質(zhì)粒pTarget-motA及整合框同時按照文獻報道方法[12]轉(zhuǎn)化至含有pCas質(zhì)粒的B1中,對測序正確的菌株進行質(zhì)粒pTarget-mota及pCas9的消除,獲得重組菌株B16。采用上述類似的方法,獲取重組菌株M1、M2、B1、B2、B17、B18、B24、B25。

    1.3 搖瓶發(fā)酵方法

    挑取單菌落接種于2 mL 液體LB培養(yǎng)基(酵母粉 5 g/L,胰蛋白胨 10 g/L,NaCl 10 g/L)中,37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。按4%(體積分數(shù))將種子液接種于含有15 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖 40 g/L,酵母粉 2 g/L,(NH4)2SO416 g/L,K2HPO4·3H2O 0.6 g/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/L,MnSO4·5H2O 0.005 g/L,CaCO330 g/L)的250 mL搖瓶中,30 ℃、220 r/min培養(yǎng)72 h。

    1.4 粗酶液制備方法

    挑取單菌落接種于含有100 mg/L氨芐霉素的2 mL 液體LB培養(yǎng)基中,37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。按4%(體積分數(shù))將種子液接種于含有25 mL TB培養(yǎng)基(酵母粉 24 g/L,胰蛋白胨 12 g/L,K2HPO412.54 g/L,KH2PO42.31 g/L)的250 mL搖瓶中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8,添加終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG),16 ℃過夜誘導培養(yǎng)。將上述誘導結(jié)束后的菌液于4 ℃、7 000 r/min條件下離心10 min,棄上清液收集菌體,用250 mmol/L Tris-HCl(pH 8.1)洗滌2次,稀釋菌體至OD600為8.0,冰水浴超聲破碎后(功率300 W,工作4 s,間歇6 s,10 min),4 ℃、12 000 r/min離心30 min,收集上清液。

    1.5 酶活力的測定

    hisG酶活力的測定是基于反應產(chǎn)物磷酸核糖三磷酸腺苷(phosphoribosyl adenosine triphosphate,PR-ATP)和隨后產(chǎn)生的磷酸核糖腺苷(phosphoribosyl adenosine monophosphate,PR-AMP)在290 nm處有較高的紫外吸收[13-15]。反應混合物(95 μL):79 μL反應溶液[Tris 6.07 g/L、KCl 5.59 g/L、MgCl20.48 g/L,另外可根據(jù)研究需求加入50~200 mmol/LL-組氨酸、2~16 mmol/L一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)、1~5 mmol/L阿卡地新(AICAR),pH調(diào)至8.5]、1 μL 0.2 U/mL焦磷酸酶(pyrophosphatase,PPase),5 μL 0.2 U/mL ATP,10 μL 0.5 μg/μL粗酶液。將上述反應混合物置于96孔板中,30 ℃溫浴5 min,加入5 μL 10 mmol/L PRPP,用5 μL的水替代PRPP用作空白對照。利用酶標儀測量該體系在290 nm、30 min內(nèi)每30 s間隔的吸光度[16-17]。每分鐘增加1吸收峰對應100 μL體系中形成0.091 9 μmol PR-ATP[16]。

    1.6 檢測方法

    發(fā)酵液稀釋至合適濃度的范圍后,使用分光光度計測定其OD600值;采用SBA-40E系列生物傳感分析儀測定發(fā)酵液中葡萄糖濃度;采用HPLC對發(fā)酵液中L-組氨酸濃度進行定量分析,以鄰苯二甲醛進行發(fā)酵液柱前衍生,色譜柱為Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),紫外檢測器的檢測波長為338 nm,柱溫40 ℃,進樣量1 μL。具體的梯度洗脫程序如表2所示。

    表2 本文梯度洗脫程序Table 2 Gradient eluting procedure used in this study

    2 結(jié)果與分析

    2.1 hisLGDCBHAFI操縱子前導區(qū)改造對L-組氨酸合成和細胞生長的影響

    E.coli中合成L-組氨酸的途徑酶編碼基因組成1個 操縱子,基因順序為hisLGDCBHAFI。該操縱子受L-組氨酸調(diào)控:當L-組氨酸濃度高時,核糖體快速跳過操縱子中hisL編碼的前導肽,在hisL和hisG之間形成終止子,從而阻止轉(zhuǎn)錄的進行;當L-組氨酸濃度低時,核糖體與hisL基因結(jié)合,進行前導肽的合成[3](圖1-a)。為了解除L-組氨酸對操縱子的調(diào)控,用人工的開放閱讀框(hisL′-λattB′-trpE)[18-19]分別替換E.coliBL21 (DE3)、E.coliMG1655中的L-組氨酸操縱子的前導區(qū)(圖1-b),得到菌株B1、M1。已知PurR是E.coli中響應嘌呤和嘧啶代謝的調(diào)節(jié)子,通過影響代謝前體PRPP和代謝中間物AICAR的合成量調(diào)控組氨酸代謝[18,20],因而,為了解除PurR對L-組氨酸代謝的影響,敲除菌株B1、M1中的PurR基因[10,21],依次得到菌株B2、M2。

    ATP轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶(E.coli中由hisG基因編碼)的催化是L-組氨酸合成通路中的第一步反應,也是L-組氨酸合成的限速步驟[16]。有研究發(fā)現(xiàn),將E.coli中ATP轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶的第271位谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔梢栽谝欢ǔ潭壬辖獬齃-組氨酸的反饋抑制[18]。因而,將該突變基因插入pBSG11質(zhì)粒中,獲取重組質(zhì)粒pBSG11-hisGE271K,并將其分別轉(zhuǎn)化至菌株E.coliBL21(DE3)、E.coliMG1655、B1、M1、B2、M2 中,得到菌株B3、M3、B4、M4、B5、M5。搖瓶發(fā)酵72 h后,結(jié)果如圖1-c所示,菌株B4的L-組氨酸產(chǎn)量最高,為872.50 mg/L,是對照菌株B3產(chǎn)量的3.68倍;同時,B4菌株的OD600是B3的0.48倍。上述實驗結(jié)果說明,操縱子前導區(qū)的改造對L-組氨酸的合成有較明顯的促進效果,因此,接下來的研究中選擇菌株B1為主要研究對象。

    a-E.coli L-組氨酸合成路徑;b-替換L-組氨酸操縱子前導肽示意圖;c-不同菌株的L-組氨酸產(chǎn)量和OD600分析圖1 E.coli的L-組氨酸合成途徑及hisLGDCBHAFI操縱子前導區(qū)改造對L-組氨酸合成及細胞生長的影響Fig.1 Synthesis pathway of L-histidine in E.coli and effects of hisLGDCBHAFI operon′s leading area modification on L-histidine synthesis and cell growth

    2.2 ATP轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶hisG改造對L-組氨酸合成的影響

    2.2.1 在B1中表達C.glutamicum來源hisG基因驗證其對L-組氨酸合成的影響

    已有研究報道C.glutamicumATCC13032來源的hisG基因可以通過定點突變在一定程度上解除L-組氨酸的反饋抑制,進而提高C.glutamicum中L-組氨酸的產(chǎn)量[16,21]。因此將C.glutamicumATCC13032來源的天然hisG基因(C1)及其突變基因hisGG233H/T235Q(C2)、hisGG233H/T235Q /N215I(C3)、hisGS143F/Δ209-281(C4)插入pBSG11質(zhì)粒中,獲取重組質(zhì)粒并將其分別轉(zhuǎn)化至菌株B1,得到菌株B7、B8、B9、B10。同時,使用載體pBSG11過表達E.coli天然hisG基因(EG),獲得重組質(zhì)粒pBSG11-hisG,將其轉(zhuǎn)化至菌株B1中,獲得對照菌株B6。72 h搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示,菌株B8的L-組氨酸產(chǎn)量為1 070.79 mg/L,OD600為5.82(圖2-a)。

    Ecoli天然hisG基因編碼的ATP轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶,受到L-組氨酸的反饋抑制[22],AMP[23]、AICAR[24]的競爭性抑制。為了驗證上述5種hisG基因所編碼的ATP轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶在不同濃度抑制劑下的酶活,分別將EG、C1、C2、C3、C4插入表達載體pET28a,獲得重組質(zhì)粒pET28a-hisG、pET28a-hisG(C.glutamicum)G233H/T235Q、pET28a-hisG(C.glutamicum)G233H/T235Q/N215I、pET28a-hisG(C.glutamicum)S143F/Δ209-281,轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中,按照1.5中方法收集胞內(nèi)上清液并利用SDS-PAGE檢測蛋白的表達情況。如圖2-b所示,5種hisG蛋白均成功表達,其中EG、C1、C2、C3表達量均高于C4。在反應體系中組氨酸濃度達到200 mmol/L時,C2、C3、C4仍能保持>60%的相對酶活力(圖2-c)。在AICAR濃度為0~3 mmol/L時,僅C2酶活力高于對照EG及C1;AICAR濃度達到5 mmol/L時,C1,C2、C3、C4的相對酶活為EG的1.15~1.45倍(圖2-d)。上述5種酶,在反應體系中含有2 mmol/L AMP時,酶活力均下降至20%以下(圖2-e)。

    2.2.2 在B1中表達S.marcescens來源hisG基因驗證其對L-組氨酸合成的影響

    實驗室存有1株經(jīng)過誘變篩選后具有組氨酸結(jié)構(gòu)類似物(3-氨基-1,2,4-三氮唑、6-巰基嘌呤、組氨酸甲酯、2-硫尿嘧啶、D-組氨酸)抗性的S.marcescensZJZ625[8],使用附表2中引物克隆其hisG基因(S1)并進行測序(附表3),同時對基因S1的271位氨基酸通過PCR進行定點突變,得到hisG(S.marcescens)E271K(S2)。在菌株B1中,使用pBSG11載體過表達上述基因S1、S2,得到菌株B11、B12。72 h搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示(圖3-a),菌株B11的L-組氨酸產(chǎn)量達到1 480.42 mg/L,為對照菌株B6的10.86倍,OD600下降至5.57。271位氨基酸的突變雖然未對OD600產(chǎn)生明顯影響,但導致了產(chǎn)量的下降(894.80 mg/L)。

    a-過表達C.glutamicum來源hisG菌株的L-組氨酸產(chǎn)量及OD600;b-C.glutamicum來源突變hisG的SDS-PAGE圖 [1-對照,2-pET28a-hisG,3-pET28a-hisG(C.glutamicum),4-pET28a-hisG(C.glutamicum)G233H-T235Q,5-pET28a-hisG(C.glutamicum)G233H-T235Q-215I, 6-pET28a-hisG(C.glutamicum)S143F/Δ209-281]; c-hisG(C.glutamicum)在不同組氨酸濃度下的相對酶活力;d-hisG(C.glutamicum) 在不同AICAR濃度下的相對酶活力;e-hisG(C.glutamicum)在不同AMP濃度下的相對酶活力圖2 表達C.glutamicum來源hisG對L-組氨酸合成的影響Fig.2 Effect of expression of hisG from C.glutamicum on L-histidine synthesis

    分別將S1、S2基因片段插入pET28a載體,獲得重組載體pET28a-hisG(S.marcescens)、pET28a-hisG(S.marcescens)E271K,將其轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3),低溫誘導蛋白表達后,分析胞內(nèi)上清液(圖3-b)。在反應體系中含有200 mmol/LL-組氨酸時,S1仍能保持64.57%的相對酶活力(圖3-c);AICAR濃度在0~5 mmol/L,EG、S1、S2的酶活無明顯差異(圖3-d);在AMP濃度為2 mmol/L時,S1仍能保持79.77%的相對酶活力(圖3-e)。

    2.2.3 改造E.coli的野生型hisG基因并驗證其對L-組氨酸合成的影響

    菌株S.marcescensZJZ625誘變前的基因序列未知,為了探究導致L-組氨酸產(chǎn)量提高的有效突變位點,將E.coliBL21(DE3)、S.marcescensSMDB11、S.marcescensZJZ625的hisG基因的氨基酸序列進行比對(圖4-a),選擇S.marcescensZJZ625的hisG基因中與E.coliBL21(DE3)、S.marcescensSMDB11均不同的氨基酸位點,即為第10位與第149位氨基酸作為目標位點,同時由于已有研究報道271位氨基酸也為有效位點[18],將E.coli天然hisG的第10、149、271位氨基酸分別進行突變以及3個位點同時突變,得到突變基因hisGA10T(E1)、hisGC149Y(E2)、hisGE271K(E3)、hisGA10T/C149Y/E271K(E4),將其分別插入PBSG11載體,轉(zhuǎn)化至菌株B1,獲得菌株B13、B14、B4、B15。搖瓶發(fā)酵72 h后,如圖4-b所示,菌株B15的L-組氨酸產(chǎn)量最高(1 148.923 mg/L),OD600為6.91。在E.coliBL21(DE3)中,使用pET28a載體表達E1、E2、E3、E4基因,低溫誘導E1、E2、E3、E4蛋白表達后,分析胞內(nèi)上清液(圖4-c)。4種突變基因均在一定程度上解除了L-組氨酸的反饋抑制,在反應體系中含有200 mmol/LL-組氨酸時,仍能保持60%以上的酶活力(圖4-d),但E4在4 mmol/L AICAR濃度下就失去酶活性 (圖4-e),同時E4在反應體系中含有12 mmol/L AMP時仍能保持30%以上的酶活力(圖4-f)。

    a-過表達S.marcescens來源hisG菌株的L-組氨酸產(chǎn)量及OD600;b-S.marcescens來源突變hisG的SDS-PAGE圖 [1-對照,2-pET28a-hisG,3-pET28a-hisG(S.marcescens),4-pET28a-hisG(S.marcescens)E271K]; c-hisG(S.marcescens)在不同組氨酸濃度下的相對酶活力;d-hisG(S.marcescens)在不同AICAR濃度下的相對酶活力;e-hisG(S.marcescens) 在不同AMP濃度下的相對酶活力圖3 表達S.marcescens來源hisG對L-組氨酸合成的影響Fig.3 Effect of expression of hisG from S.marcescens on L-histidine synthesis

    2.3 基因組整合hisG基因?qū)-組氨酸合成和細胞生長的影響

    基于上述菌株B11的L-組氨酸產(chǎn)量最高,并在200 mmol/LL-組氨酸、5 mmol/L AICAR、2 mmol/L AMP濃度下均能保持較高酶活力。通過Crisper-Cas9技術(shù)在菌株B1的mota[25]、chew[25]、poxb[26]位點依次進行了hisG(S.marcescens)基因的整合,獲得了菌株B16、B17、B18。如圖5所示,菌株B17產(chǎn)量為861.78 mg/L,為菌株B16的1.31倍;但菌株B18產(chǎn)量提高不明顯,OD600值也未發(fā)生明顯變化。因此,推測前體物質(zhì)供應不足限制了L-組氨酸的生產(chǎn)。

    圖5 基因組整合S.marcescens來源hisG對 L-組氨酸合成及細胞生長的影響Fig.5 Effects of genomic integration of hisG from S.marcescens on L-histidine synthesis and cell growth

    2.4 前體供應關(guān)鍵基因Prs對L-組氨酸合成的影響

    核酮糖-5-磷酸(ribulose-5-phosphate,R5P)經(jīng)過磷酸核糖焦磷酸合成酶(phosphoribosyl pyrophosphate synthetase,Prs)的催化生成L-組氨酸合成的前體物質(zhì)PRPP[21]。為了增強前體物質(zhì)PRPP的供應,在菌株B16、B17、B18中使用pBSG11載體過表達Prs基因,獲得菌株B19、B20、B21。搖瓶發(fā)酵72 h后,菌株B21產(chǎn)量達到2 119.28 mg/L,OD600達到9.83(圖6-a)。

    為了驗證過表達S.marcescensZJZ625來源的Prs基因(附表4)對L-組氨酸合成的影響,構(gòu)建重組質(zhì)粒PBSG11-Prs(S.marcescens),轉(zhuǎn)化至產(chǎn)量較高的菌株B20和B21,得到菌株B22、B23。72 h 搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示,過表達Prs(S.marcescens)比過表達E.coli的野生型Prs提高L-組氨酸產(chǎn)量效果更好,其中菌株B23的L-組氨酸產(chǎn)量提高至2 778.26 mg/L(圖6-b)。

    將Prs(S.marcescens)在菌株B18的ylbG[27]、recA[27]位點依次進行基因組整合,得到菌株B24、B25。菌株B25搖瓶發(fā)酵72 h后,產(chǎn)量達到3 898.06 mg/L,是菌株B23的1.40倍(圖6-c)。若繼續(xù)延長發(fā)酵時間至96 h,菌株B24(OD600=6.45)、菌株B25(OD600=4.81)的L-組氨酸產(chǎn)量分別提高至5 040.69、5 574.63 mg/L,菌株B25 96 h消耗葡萄糖總量為72 h消耗葡萄糖量的1.24倍(圖6-d)。

    a-E. coli BL21 (DE3)、S. marcescens ZJZ626和S. marcescens SMD11的hisG氨基酸序列對比圖;b-過表達E. coli 來源hisG菌株的L-組氨酸產(chǎn)量及OD600;c-E. coli來源突變hisG的SDS-PAGE圖(1-對照,2-pET28a-hisG, 3-pET28a-hisGA10T,4-pET28a-hisGC149Y,5-pET28a-hisGE271K,6-pET28a-hisGA10T/C149Y/E271K); d-hisG在不同組氨酸濃度下的相對酶活力;e-hisG在不同AICAR濃度下的相對酶活力;f-hisG在不同AMP濃度下的相對酶活力圖4 改造E.coli來源hisG對L-組氨酸合成的影響Fig.4 Effect of expression of hisG from E.coli on L-histidine synthesis

    3 結(jié)論

    L-組氨酸合成路徑較長,通過誘變單一地選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株并不會完全打通菌體內(nèi)合成L-組氨酸的代謝途徑。本研究利用代謝工程思路對E.coliL-組氨酸合成的代謝途徑進行了改造,構(gòu)建無質(zhì)粒高產(chǎn)大腸桿菌。首先通過CRISPR/Cas9技術(shù)對組氨酸操縱子前導肽進行替換,解除了L-組氨酸對操縱子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。組氨酸合成途徑中的第一個酶(hisG)會受到L-組氨酸的反饋抑制以及AMP、AICAR的競爭性抑制,因此我們分析了表達C.glutamicum、S.marcescens、E.coli來源的不同hisG對L-組氨酸產(chǎn)量及細胞生長的影響,同時分析了hisG基因所編碼的ATP轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶在不同濃度L-組氨酸、AMP、AICAR時的酶活力,最終選擇了對提高L-組氨酸產(chǎn)量效果最好,同時對3種抑制物均有較高耐受濃度的hisG(S.marcescens)進行基因組整合,整合3個拷貝hisG(S.marcescens)的菌株B18L-組氨酸產(chǎn)量提高至905.32 mg/L。在實驗過程中發(fā)現(xiàn),菌株B18相對于基因組整合2個拷貝hisG(S.marcescens)的菌株B17產(chǎn)量提升并不明顯,推測前體物質(zhì)供應不足限制了L-組氨酸的生成。所以嘗試過表達控制前體PRPP合成的基因Prs,產(chǎn)量提高至2 119.28 mg/L。接著又比較了S.marcescens來源的Prs對L-組氨酸產(chǎn)

    a-在不同菌株中表達PBSG11-Prs質(zhì)粒對L-組氨酸生產(chǎn)及細胞生長的影響;b-表達不同來源Prs對L-組氨酸生產(chǎn)及細胞生長的影響; c-不同拷貝數(shù)的Prs(S.marcescens)對L-組氨酸生產(chǎn)及細胞生長的影響;d-不同發(fā)酵時間對L-組氨酸生產(chǎn)、耗糖量及細胞生長的影響圖6 提高PRPP的合成對L-組氨酸產(chǎn)量及OD600的影響Fig.6 Effect of increasing PRPP synthesis on L-histidine titer and OD600

    量的影響,發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)量為過表達E.coli天然Prs菌株的1.31倍,將Prs(S.marcescens)進行2個拷貝的基因組整合后,獲得重組菌株B25,搖瓶發(fā)酵72 hL-組氨酸產(chǎn)量提高至3 898.06 mg/L,96 hL-組氨酸產(chǎn)量達到5 574.63 mg/L。該研究為實現(xiàn)更經(jīng)濟的L-組氨酸工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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