基于核磁共振氫譜技術(shù)建立白酒乙醇濃度檢測方法

劉恩滿，李雪玉，宗緒巖，李麗，王壽峰*

1(釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗室(四川輕化工大學(xué))，四川 宜賓，644000)2(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院， 四川 宜賓，644000)3(四川輕化工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，四川 自貢，643000)

白酒在我國具有悠久的歷史，在現(xiàn)代國民經(jīng)濟(jì)體系占比較大，特別是在區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起著舉足輕重的作用。白酒作為快速消費(fèi)品，在滿足人民群眾生活需求、提高大眾生活質(zhì)量方面發(fā)揮了積極的作用[1]。為了保護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益，提高產(chǎn)品質(zhì)量水平，國家相關(guān)部門根據(jù)產(chǎn)品質(zhì)量法、食品安全法加強(qiáng)了酒類產(chǎn)品的抽檢力度，酒精度是其中的重要指標(biāo)。建立酒精度的準(zhǔn)確、快速定量方法對于食品工業(yè)，如酒類釀造，低酒精飲料、無酒精飲料生產(chǎn)，以及非食品工業(yè)如化妝品、藥品制造業(yè)都具有重要意義。

目前測量酒精度的主要方法是GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 酒中乙醇濃度的測定》，白酒中酒精度的測定方法是密度瓶法和酒精計法，啤酒和葡萄酒適用氣相色譜法[2-4]，其中部分測試方法操作過程繁瑣，耗時耗力，容易造成較大的實(shí)驗誤差。隨著現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的發(fā)展，酒精度快速測定儀、比色法[5]、近紅外光譜法[6-10]等酒精度的測定方法趨于成熟。相比于上述測定方法，核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)波譜分析具有高重現(xiàn)性、無損傷性和無偏向性等優(yōu)點(diǎn)[11]，成為快速定性定量分析的一種重要方法。近年來，隨著核磁分辨率的提高，核磁共振在藥品食品行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。例如，可用于啤酒[12-15]和葡萄酒[16-17]的成分分析、真假鑒別及溯源性分析等。早在2004年，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心張偉等[18]利用核磁氫譜法對葡萄酒中的乙醇進(jìn)行定量，測量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。2011年，楊星等[19]探討了模擬白酒體系中溫度對羥基質(zhì)子峰位移的關(guān)系。對于國外蒸餾酒，在2016年ISAAC-LAM[20]采用45 MHz低場臺式核磁共振波譜儀對幾種酒精飲料中的乙醇含量進(jìn)行測定，結(jié)果較好。2020年吉鑫等[21]利用核磁對白酒中有機(jī)酸和醛進(jìn)行了定量分析，核磁共振氫譜結(jié)合偏最小二乘回歸算法，得到的R2為0.93～0.99，取得了滿意的結(jié)果。借鑒相關(guān)研究成果，本研究擬建立一種利用核磁對白酒的酒精度快速定量的方法，為企業(yè)和相關(guān)部門提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗所用白酒樣品均為市售，采購于大型超市及專賣店，共15個樣品。無水乙醇(分析純，≥99.7%)，Greagent公司；乙酸標(biāo)準(zhǔn)品(ACSreagent，≥99.7%)，Sigma-Aldrich公司；氘代氯仿[D, 99.8%，含0.03%(體積分?jǐn)?shù)) 四甲基硅烷(tetramethylsilane,TMS)]，Cambridge Isotope Laboratories公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Bruker Avance III HD 600 MHz核磁共振波譜儀，Bruker公司；S210-S pH計、ME204分析天平，Mettler-Toledo/梅特勒-托利多公司；移液槍，Eppendorf公司；WIGGENS Vortex3000渦旋振蕩器，德國WIGGENS公司；酒精計，冀州耀華器械儀表廠。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 核磁共振波譜法

實(shí)驗所采用的核磁共振波譜儀共振頻率為600.13 MHz；配備5 mm BBO探頭；采用脈沖序列為zg30；譜寬為20.027 6 ppm；采樣點(diǎn)數(shù)為64 K；掃描次數(shù)為64；接受增益為2.25；弛豫時間為4 s；空掃次數(shù)為4；采用同軸核磁管測試，外管取500 μL樣品，內(nèi)管加入100 μL CDCl3(含0.03% TMS)鎖場和定標(biāo)；檢測溫度為298 K；樣品檢測前等待5 min用于穩(wěn)定溫度，每個樣品重復(fù)測定3次，保證數(shù)據(jù)可靠性。

1.3.2 譜圖數(shù)據(jù)處理

對核磁共振譜圖采用MestReNova核磁共振數(shù)據(jù)分析軟件處理，對核磁譜圖進(jìn)行相位矯正，基線矯正，以及化學(xué)位移零點(diǎn)矯正，對乙醇的甲基峰和亞甲基峰以及水峰進(jìn)行積分，以基線平滑處開始積分，固定積分寬度，導(dǎo)出積分?jǐn)?shù)據(jù)。建立工作曲線時，將標(biāo)準(zhǔn)成品酒積分?jǐn)?shù)據(jù)、乙醇和水的化學(xué)位移值分別導(dǎo)入Origin 2019b軟件，作圖，得出擬合曲線及曲線方程；對于未知樣品，將積分面積比、乙醇和水的化學(xué)位移值導(dǎo)入上述曲線方程，計算出酒精度(%vol)。

1.3.3 酒精計法及乙醇溶液配制

酒精計法使用GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 酒中乙醇濃度的測定》，按照要求最終數(shù)據(jù)換算成20 ℃時酒精度；文中不同乙醇溶液(%vol)均按照20 ℃時乙醇和水的密度配制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同測試溫度條件對乙醇峰偏移影響

為探尋不同測試溫度對核磁譜圖峰位置偏移影響，在297.5～300.5 K的溫度條件下對乙醇溶液(52%vol)進(jìn)行核磁共振氫譜測試，結(jié)果如圖1所示。在不同溫度條件下，水羥基峰的位置隨著溫度而變化，當(dāng)樣品測試溫度增加，水羥基峰的化學(xué)位移向核磁高場移動，較小的溫度波動(0.5 K)也能引起水羥基峰位移明顯變化，與文獻(xiàn)一致[22]。在測試中，設(shè)定測試溫度為298 K，測試前平衡5 min。

圖1 不同溫度的核磁氫譜(52%vol)Fig.1 1H NMR spectra of ethanol at different temperature(52%vol)

2.2 不同乙醇濃度對核磁譜圖的影響

不同廠家、品牌、香型白酒酒精度不盡相同，為探尋不同的酒精度對核磁譜圖的影響，對10%～70%乙醇體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液共7個樣品進(jìn)行測試，結(jié)果如圖2所示。乙醇的甲基與亞甲基峰面積隨著乙醇含量增加而增大。乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，分子間氫鍵增強(qiáng)，乙醇甲基峰，亞甲基峰和水羥基峰化學(xué)位移增大，向核磁低場移動，這為以峰位置的不同計算酒精度提供依據(jù)。

圖2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的核磁共振氫譜Fig.2 1H NMR spectra of different concentration of ethanol

2.3 不同濃度乙酸對乙醇峰偏移影響

白酒中含有約1%～2%的微量組分，包含醇、醛、酸、酯等，醇羥基和酸的游離氫都會與水峰形成氫鍵，對積分產(chǎn)生影響。一般白酒中的乙酸質(zhì)量濃度為0.4～1.8 g/L，配制了0.1～2.0 g/L不同乙酸質(zhì)量濃度的6種乙醇溶液(52%vol)進(jìn)行核磁共振波譜儀測定，結(jié)果如圖3所示，對6個樣品進(jìn)行pH值測定，并根據(jù)核磁共振譜對水羥基峰以及乙醇亞甲基峰積分，通過面積比得出的乙醇計算濃度，結(jié)果如表1所示。

由圖3可知，1H NMR譜圖中乙醇甲基峰，亞甲基峰以及水羥基峰在相同測試條件下化學(xué)位移基本未發(fā)生改變。在不同乙酸質(zhì)量濃度條件下，不會影響酒樣譜圖中的峰化學(xué)位移值，即不同乙酸質(zhì)量濃度不會導(dǎo)致酒樣的化學(xué)位移偏移。

圖3 不同乙酸濃度的核磁共振氫譜Fig.3 1H NMR spectra of ethanol with different acetic acid

由表1可知，乙酸質(zhì)量濃度不同，酒樣pH值不同，乙醇峰化學(xué)位移值受酒樣酸性影響較小。隨著乙酸質(zhì)量濃度的增加，酸的質(zhì)子和水羥基峰重合在一起，對水羥基峰的積分產(chǎn)生影響，對其進(jìn)行積分得到計算酒精度與真實(shí)值有負(fù)偏差，都在1%vol以內(nèi)。

表1 不同乙酸濃度下的乙醇計算濃度Table 1 Calculated ethanol concentration of different acetic acid concentration

2.4 測試曲線的建立

中國白酒歷史文化悠久，由于地理環(huán)境不同，釀造條件及生產(chǎn)工藝等因素的差異，形成了風(fēng)格迥異，各有特色的白酒種類。不同的成品酒中含有的風(fēng)味成分不同，酒中酸和雜醇會影響水的積分，進(jìn)而影響酒精度的計算。因此選擇了市售不同酒精度的名優(yōu)酒樣建立標(biāo)準(zhǔn)測試曲線，共6種(表2)。對選擇的成品酒樣進(jìn)行核磁共振測定，計算乙醇亞甲基峰和水羥基峰的比值，建立基于亞甲基峰與水羥基峰的積分比標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。并且將成品酒樣中水羥基峰和乙醇的甲基峰及亞甲基峰化學(xué)位移位置進(jìn)行標(biāo)定，并建立標(biāo)準(zhǔn)測試曲線，如圖5所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)成品酒樣數(shù)據(jù)Table 2 The data of standard samples

由圖4可知，成品酒中亞甲基與水羥基峰面積的積分比擬合效果較好(R2=0.994 7)，可以用來對未知酒樣酒精度進(jìn)行預(yù)測。由圖5可知，不同酒精度的成品酒樣中水羥基峰和乙醇甲基亞甲基峰位置呈一定線性變化，線性良好。其中對成品酒中乙醇甲基峰的峰位置擬合效果最佳(R2=0.991 8)?？梢酝ㄟ^對酒樣中甲基亞甲基及水羥基峰峰位置進(jìn)行酒精度的預(yù)測。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)成品酒積分比擬合圖Fig.4 Fitting result of the integral ratio with standard samples

圖5 標(biāo)準(zhǔn)成品酒核磁峰位置擬合圖Fig.5 Fitting diagram based on NMR peaks in standard samples

2.5 方法驗證

對9種市售的成品酒樣進(jìn)行核磁共振氫譜測定，將所測數(shù)據(jù)導(dǎo)入擬合方程，甲基峰位移擬合方程為Y=1.130 2+0.004 8X，亞甲基與水羥基峰積分比擬合方程為Y=132.065 0X-0.694 1，擬合得到的酒精度如表3所示，同時，使用國標(biāo)酒精計法測試了酒精度作為對照。

由表3可知，實(shí)際擬合的酒精度與成品酒樣標(biāo)注的酒精度有著一定的差別，主要是由于測量方法的不同，將酒中的部分微量成分算入酒精度中，導(dǎo)致與標(biāo)注酒精度有一定偏差。通過一系列成品酒樣對2種不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行驗證，得到擬合酒精度。發(fā)現(xiàn)通過乙醇的亞甲基峰與水羥基峰面積積分比擬合效果更佳，相對偏差最大為1.48%，測得酒精度與標(biāo)注酒精度偏差均在1%vol以內(nèi)。核磁共振氫譜法測得白酒酒精度與國標(biāo)酒精計法測得數(shù)據(jù)相差不大，均較為準(zhǔn)確，但核磁檢測取樣量少，只需0.5 mL，檢測前樣品不需要重新蒸餾，耗時短，操作簡便，適合批量分析。

表3 白酒樣品擬合乙醇濃度Table 3 Fitting ethanol concentration of Baijiu samples

3 結(jié)論

本研究采用1H NMR作為檢測手段，對成品白酒中的酒精度進(jìn)行檢測，建立了白酒中酒精度的分析方法。其中，根據(jù)乙醇甲基峰位置擬合所得相關(guān)系數(shù)為R2=0.991 8；根據(jù)乙醇亞甲基峰與水羥基峰積分比擬合所得相關(guān)系數(shù)為R2=0.994 7。通過驗證樣品檢測，酒精度與標(biāo)注酒精度相對偏差均<0.02，酒精度偏差均小于1%vol，已達(dá)到食品國家安全標(biāo)準(zhǔn)要求。該檢測方法簡單快捷，可為白酒生產(chǎn)企業(yè)及相關(guān)檢測部門提供參考，有一定的應(yīng)用前景。