雙模態(tài)改良型酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法用于黃曲霉毒素B1的檢測(cè)研究

張光胤，蔡愛(ài)麗，鄧放明，趙倩*，石星波

1(食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙，410128)2(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410128)

由真菌毒素引起的食品安全已成為人們高度關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。其中以黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)污染最為嚴(yán)重，其毒性、致癌性、致突變性、致畸性在所有真菌毒素中最強(qiáng)[1-4]，并容易污染谷物，乳制品，水果和飼料[5]。許多國(guó)家都規(guī)定了AFB1的限量標(biāo)準(zhǔn)，例如，歐盟對(duì)AFB1的要求低至2 μg/kg[6]。我國(guó)對(duì)食品中AFB1也采取了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，例如，花生、玉米及其制品中的AFB1≤20 μg/kg；糧食、豆類(lèi)、發(fā)酵食品及調(diào)味品中的AFB1≤5 μg/kg；乳制品及嬰兒配方食品中AFB1≤10 μg/kg[7]。目前食品中AFB1的主要檢測(cè)方法包括液相色譜-質(zhì)譜法[8-9]、高效液相色譜法[10]、免疫色譜法[11-12]、時(shí)間分辨免疫熒光分析技術(shù)[13-14]。雖然這些分析法具有較好的準(zhǔn)確度和良好的重復(fù)性，但仍存在著耗時(shí)、靈敏度低、需要復(fù)雜昂貴的檢測(cè)儀器和專(zhuān)業(yè)操作人員的缺陷，在基層和現(xiàn)場(chǎng)無(wú)法被廣泛應(yīng)用。因此，建立一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的檢測(cè)方法顯得尤為重要。

酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)作為應(yīng)用最廣的方法之一[15]，在食品質(zhì)量控制領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注[16-17]。但是，由于ELISA依賴(lài)抗體捕獲目標(biāo)物，成本較高，且只能達(dá)到中等靈敏度(μg/mL～ng/mL)，無(wú)法滿(mǎn)足痕量目標(biāo)物的檢測(cè)[18]。至今為止，研發(fā)人員已利用納米材料具有較大的比表面積、易于化學(xué)修飾、高負(fù)載能力的優(yōu)點(diǎn)[19-20]，通過(guò)納米材料作為載體來(lái)富集酶提高了ELISA的靈敏度[21-23]。盡管使用納米材料改良ELISA已擁有可觀的前景，但仍無(wú)法滿(mǎn)足便攜和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。

核酸適配體(aptamer，Apt)是由TUERK等[24]創(chuàng)建的指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)從DNA數(shù)據(jù)庫(kù)里篩選出來(lái)可特異性識(shí)別靶標(biāo)物質(zhì)的核酸序列。相對(duì)于抗體而言，Apt的特異性更強(qiáng)、穩(wěn)定性更高且更易于合成和修飾，特別適合作為小分子的生物識(shí)別元件[25-26]。研究表明，Apt技術(shù)可提高檢測(cè)的敏感度和特異性[27]，并且Apt和抗體的組合也顯示出了良好的特異性[28-29]。

我們?cè)O(shè)計(jì)了一種雙模態(tài)改良型ELISA，用于AFB1的高靈敏便攜式檢測(cè)。使用親和素化的磁納米顆粒(magnetic nanoparticles，MNPs)作為載體，富集辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)，同時(shí)偶聯(lián)生物素化的AFB1Apt制備檢測(cè)探針(MNPs@Apt@HRP)。通過(guò)Apt與抗體組合共同識(shí)別目標(biāo)物，以HRP催化H2O2氧化無(wú)色底物TMB成為藍(lán)色的ox-TMB，經(jīng)過(guò)808 nm激光照射后ox-TMB還可發(fā)生很強(qiáng)的光熱效應(yīng)使溶液溫度升高。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

AFB1標(biāo)品(分析純),美正生物科技有限公司。TMB(分析純)、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS),北京索萊寶科技有限公司。H2O2(30%)、檸檬酸(分析純)、醋酸鈉(分析純)、乙二胺四乙酸二鈉(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。AFB1Apt序列(5′-3′)為：GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CC[27]，由上海生工生物工程有限公司合成。

Heraeus Pico 17離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；TCS-10金屬恒溫振蕩器，杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司產(chǎn)品；Spark多功能酶標(biāo)儀，瑞士帝肯公司產(chǎn)品；LSR808H-7 W-FC808激光器，吉藤電子科技有限公司產(chǎn)品；ELISA試劑盒，美正生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 MNPs@Apt@HRP檢測(cè)探針的制備

將MNPs(12 μL，0.1 mg beads/mL)，AFB1Apt(12 μL，100 μmol/L)和HRP(12 μL，0.1 g/L)混合后，使用PBS稀釋至1.2 mL，25 ℃ 孵育40 min，10 000 r/min離心8 min，并用超純水洗滌3次除去多余HRP與AFB1適配體，洗滌后加入1.2 mL的PBS重懸，得到MNPs@Apt@HRP檢測(cè)探針，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 探針的制備優(yōu)化及驗(yàn)證研究

取0.1 μL MNPs(10 mg beads/mL)與12 μL HRP(0.1 g/L)，加入PBS緩沖液稀釋至1 mL。25 ℃條件下分別孵育10、20、30、40、50 min后，10 000 r/min離心8 min，分別取上清液10 μL，加入等體積的TMB和H2O2，避光反應(yīng)30 min，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)A652nm。

分別取10 μL HRP和50 μL H2O2;10 μL HRP和50 μL TMB;50 μL TMB和50 μL H2O2;10 μL HRP，50 μL TMB和50 μL H2O2作為對(duì)照組。然后分別取100 μL MNPs，50 μL TMB和50 μL H2O2;100 μL MNPs@Apt@HRP，50 μL TMB和50 μL H2O2作為實(shí)驗(yàn)組(使用的HRP質(zhì)量濃度為0.1 g/L)。避光反應(yīng)30 min。觀察溶液的顏色變化，檢測(cè)A652nm(每組3個(gè)平行)。然后使用808 nm激光照射4 min。立即將便攜式溫度計(jì)插入溶液中，檢測(cè)溶液溫度變化。插入溫度計(jì)探頭約5～8 s后獲得的最高穩(wěn)定值為光熱測(cè)量信號(hào)。

1.4 探針調(diào)控比色信號(hào)研究

分別取100 μL質(zhì)量濃度為5×10-3、2×10-3、1×10-3、6×10-4、3×10-4、1×10-4、6×10-5、3×10-5g/L的MNPs@Apt@HRP加入到50 μL TMB和50 μL H2O2溶液中，避光反應(yīng)30 min。觀察溶液的顏色變化，并檢測(cè)A652nm。

1.5 基于比色與熱雙模態(tài)改良型ELISA檢測(cè)方法的建立

1.5.1 AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用MNPs@Apt@HRP檢測(cè)探針與抗體的組合識(shí)別96孔聚苯乙烯微板上的一系列濃度的AFB1。具體步驟如下：

(1)AFB1抗體包被：向微孔板中加入100 μL 10 g/L AFB1抗體，4 ℃過(guò)夜；

(2)封閉：棄去液體，甩干，并用0.01 mol/L PBS緩沖液洗滌3次，加入200 μL牛血清白蛋白(BSA，0.001 g/L)進(jìn)行封閉，37 ℃下避光孵育1 h；

(3)加入AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶：棄去液體，甩干，用0.01 mol/L PBS緩沖液洗滌3次，分別加入質(zhì)量濃度為1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9、1×10-10、1×10-11、1×10-12g/L的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，25 ℃ 下避光孵育30 min(每個(gè)濃度3組平行)；

(4)加入MNPs@Apt@HRP探針：棄去液體，甩干，用0.01 mol/L PBS緩沖液洗滌3次，向孔中加入200 μL MNPs@Apt@HRP探針溶液，25 ℃下避光孵育30 min。

(5)加入底物：棄去液體，甩干，用0.01 mol/L PBS緩沖液洗滌3次，加入100 μL PBS緩沖液，50 μL TMB和50 μL H2O2，然后避光于25 ℃孵育30 min。

拍照記錄每個(gè)孔中溶液顏色的變化，檢測(cè)溶液的A652nm并進(jìn)行光熱免疫測(cè)定，記錄得到的雙模態(tài)信號(hào)分別繪制AFB1檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 比色與熱雙模態(tài)改良型ELISA的特異性研究

分別選取7種結(jié)構(gòu)類(lèi)似于AFB1的化合物，包括棒曲霉素(patulin)、黃曲霉毒素B2(aflatoxin B2，AFB2)、T-2毒素(trichothecenes，TS)、伏馬毒素B1(fumonisin B1，F(xiàn)B1)、玉米赤酶烯酮(zearalenone，ZEN)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)及混合樣品，測(cè)試該方法的特異性。AFB1的質(zhì)量濃度為10-7g/L；干擾毒素的質(zhì)量濃度為10-6g/L。在相同條件下，檢測(cè)溶液的雙模態(tài)信號(hào)變化。

1.6 幾種常見(jiàn)食品中AFB1的檢測(cè)

1.6.1 比色與熱雙模態(tài)改良型ELISA

1.6.1.1 樣品的前處理

(1)牛奶：取1 mL樣品，加入3 mL超純水，混合均勻；加熱至沸騰10 min；立刻以10 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

(2)花生：將樣品粉碎，取5.0 g置入100 mL錐形瓶中，加入40%甲醇25 mL混合均勻；振蕩10 min(200 r/min)；以4 000 r/min離心5 min；取上清液1 mL，再加入4 mL去離子水；搖勻，備用。

(3)醬油：取5.0 g樣品，加入10 mL乙腈溶液，振蕩10 min(200 r/min)后，4 000 r/min離心5 min；取0.5 mL上清液，加入4.5 mL超純水；搖勻，備用。

(4)醋：取1 mL樣品，加入4 mL甲醇，振蕩均勻后，4 000 r/min離心5 min；取1 mL上層液體，加入9 mL超純水，將混合液的pH調(diào)節(jié)至7～8；搖勻，備用。

1.6.1.2 牛奶樣品中加標(biāo)回收率檢測(cè)

取1 mL牛奶前處理的上清液，加入一定量的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，使上清液中AFB1的終質(zhì)量濃度分別為1×10-7、1×10-8、1×10-9g/L(做3組平行)。根據(jù)上文中所述實(shí)驗(yàn)過(guò)程，完成牛奶樣品中AFB1的檢測(cè)，并計(jì)算回收率。

1.6.1.3 樣品中AFB1含量的檢測(cè)

將本文建立的比色與熱雙模態(tài)改良型ELISA用于檢測(cè)花生、牛奶、醬油和醋4種樣品中AFB1的含量，并與商業(yè)化試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，驗(yàn)證該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性及可靠性。

1.6.2 商業(yè)化ELISA試劑盒

為了驗(yàn)證新建方法的準(zhǔn)確性，采用商業(yè)化ELISA試劑盒進(jìn)行 AFB1檢測(cè)，具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明。

2 結(jié)果與分析

2.1 比色與熱雙模態(tài)改良型ELISA檢測(cè)AFB1的原理

圖1展示了比色與熱雙模態(tài)改良型ELISA檢測(cè)AFB1的原理。在聚苯乙烯微孔板上包被AFB1抗體，MNPs@Apt@HRP為檢測(cè)探針。當(dāng)AFB1存在時(shí)，通過(guò)Apt和抗體的組合識(shí)別并捕獲AFB1，形成“三明治”結(jié)構(gòu)。以TMB和H2O2作為顯色底物，待檢物濃度的改變會(huì)導(dǎo)致探針濃度的不同，從而影響底物TMB顏色的改變，實(shí)現(xiàn)對(duì)AFB1的可視化檢測(cè)。再通過(guò)808 nm激光照射之后，ox-TMB產(chǎn)生的光熱效應(yīng)導(dǎo)致溶液溫度升高，以便攜式溫度計(jì)實(shí)現(xiàn)對(duì)AFB1的熱信號(hào)便攜檢測(cè)。AFB1濃度越大，偶聯(lián)的探針越多，ox-TMB顯色越明顯；溫度升高越多。相反，如果沒(méi)有目標(biāo)分子或者很少，檢測(cè)探針被沖洗掉后，無(wú)比色及溫度信號(hào)產(chǎn)生。通過(guò)ox-TMB的A652nm與經(jīng)過(guò)808 nm激光4 W/cm2功率密度照射2 min后的溫度變化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)AFB1的雙模態(tài)信號(hào)檢測(cè)。

圖1 基于比色與熱雙模態(tài)改良型ELISA用于AFB1 檢測(cè)的原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of high-sensitivity detection of AFB1 based on colorimetric and thermal bimodal improved ELISA

2.2 探針制備的優(yōu)化

HRP催化TMB氧化生成ox-TMB是信號(hào)產(chǎn)生的關(guān)鍵因素，為了探索最佳的實(shí)驗(yàn)條件，我們研究了MNPs與HRP結(jié)合時(shí)間(10、20、30、40、50 min)對(duì)探針的影響。MNPs與HRP結(jié)合完畢后離心分離游離的HRP，取離心后的上清液進(jìn)行顯色反應(yīng)。通過(guò)比較A652nm可以獲得MNPs與HRP的最佳結(jié)合時(shí)間。如圖2所示，結(jié)合時(shí)間達(dá)到40 min時(shí)，曲線趨勢(shì)趨于穩(wěn)定，ox-TMB的顏色不再產(chǎn)生明顯變化，此時(shí)MNPs與HRP的結(jié)合效率較高。因此，選擇40 min作為MNPs與HRP的結(jié)合時(shí)間。

圖2 不同時(shí)間MNPs與HRP結(jié)合離心后上清液中HRP 催化生成ox-TMB的吸光度值Fig.2 The absorbance value of HRP catalyzed to produce ox-TMB in the supernatant after centrifugation of MNPs and HRP at different times 注：插圖為不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的比色照片

2.3 HRP修飾情況與實(shí)驗(yàn)可行性的驗(yàn)證

HRP成功修飾在MNPs的表面，并且MNPs不影響顯色反應(yīng)是該方法建立的前提。本文探究了不同情況下TMB和H2O2顯色反應(yīng)，以此考察HRP在MNPs上的修飾情況與MNPs對(duì)顯色反應(yīng)的影響(圖3)。

如圖3-a所示，只有HRP，TMB和H2O2都存在的情況下，溶液會(huì)從無(wú)色變?yōu)樗{(lán)色，MNPs@Apt@HRP，TMB與H2O2都存在的情況下，也發(fā)生了顏色變化，表明MNPs@Apt@HRP成功催化TMB氧化生成ox-TMB，而單獨(dú)的MNPs無(wú)法催化TMB產(chǎn)生明顯的顏色變化。由此可證明，HRP已在MNPs的表面成功修飾。

a-驗(yàn)證HRP修飾情況的可見(jiàn)光光譜；b-不同反應(yīng)溶液的溫度變化； c-時(shí)間對(duì)溫度變化的影響圖3 實(shí)驗(yàn)可行性的驗(yàn)證Fig.3 Verification of experimental feasibility

同樣，使用4 W/cm2的808 nm激光輻照2 min，測(cè)試光熱效應(yīng)，輻照后立即使用便攜式溫度計(jì)測(cè)量溶液的溫度。如圖3-b所示，觀察到MNPs@Apt@HRP，TMB與H2O2都存在的體系中溫度升高了13.9 ℃，在TMB、MNPs+TMB、HRP、HRP+H2O2、TMB+H2O2的體系中輻照后未發(fā)現(xiàn)明顯的溫度升高。說(shuō)明808 nm激光不會(huì)催化TMB氧化生成ox-TMB，而且熱信號(hào)的產(chǎn)生是因?yàn)閛x-TMB受到輻照后將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)闊嵝盘?hào)。這些結(jié)果證明了MNPs@Apt@HRP探針介導(dǎo)的比色與熱雙模態(tài)改良型ELISA具備可行性。

為了確認(rèn)輻照時(shí)間，使用808 nm激光持續(xù)照射3 min。使用便攜式溫度計(jì)連續(xù)監(jiān)控溫度變化。如圖3-c所示，照射時(shí)間在0～150 s時(shí)，溫度隨時(shí)間的增加而增大，當(dāng)時(shí)間達(dá)到150 s時(shí)，溫度趨于穩(wěn)定，當(dāng)時(shí)間>150 s時(shí)，溫度不再發(fā)生明顯改變。因此，在隨后的免疫分析研究中，以150 s作為照射時(shí)間。

2.4 MNPs@Apt@HRP對(duì)ox-TMB生成量的影響

微孔板中捕獲MNPs@Apt@HRP的量是否對(duì)生成的ox-TMB濃度有影響是比色與熱雙模態(tài)改良型ELISA完成對(duì)不同濃度AFB1檢測(cè)的關(guān)鍵。本文研究了不同濃度的MNPs@Apt@HRP對(duì)ox-TMB生成量的影響，結(jié)果如圖4所示。在3.91×10-6～5×10-3g/L，隨著探針濃度增加，觀察到混合液從無(wú)色到藍(lán)色的趨勢(shì)，并且探針質(zhì)量濃度為5×10-3g/L時(shí)A652nm的增加最為明顯。表明隨著檢測(cè)探針濃度的增加，可產(chǎn)生更高濃度的ox-TMB，微孔板中捕獲的探針的量與ox-TMB比色信號(hào)的產(chǎn)生成正相關(guān)。

圖4 不同濃度的MNPs@Apt@HRP與TMB和H2O2 相互作用的可見(jiàn)光光譜Fig.4 Visible spectra of the interaction of different concentrations of MNPs@ATP@HRP with TMB and H2O2 注：插圖為不同濃度MNPs@Apt@HRP對(duì)應(yīng)的混合液照片

2.5 比色與熱雙模態(tài)改良型ELISA用于AFB1的檢測(cè)

在最佳條件下，研究了比色與熱雙模態(tài)改良型ELISA用于AFB1檢測(cè)的靈敏度。如圖5-a所示，當(dāng)AFB1的質(zhì)量濃度為1×10-5～1×10-11g/L時(shí)A652nm與AFB1濃度的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=0.047 1 lgc+0.757，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.990 4(圖5-b)。圖5中插圖可用于定性或半定量分析。當(dāng)AFB1的質(zhì)量濃度達(dá)到1×10-12g/L時(shí)，A652nm幾乎不再發(fā)生明顯改變，檢測(cè)靈敏度達(dá)到2.47×10-12g/L。

a-可見(jiàn)光光譜；b-標(biāo)準(zhǔn)曲線圖5 不同濃度的AFB1可見(jiàn)光光譜和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 The visible spectra of AFB1 with different concentrations and standard curve 注：插圖為不同濃度AFB1對(duì)混合液的顏色影響的照片

使用熱信號(hào)對(duì)AFB1進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)AFB1質(zhì)量濃度為1×10-8～1×10-12g/L時(shí)，溫度升高與AFB1濃度的對(duì)數(shù)呈線性相關(guān)，回歸方程為ΔT=1.57 lgc+28.72，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.991 6，檢測(cè)靈敏度為3.79×10-13g/L。因此，通過(guò)使用便攜式溫度計(jì)可實(shí)現(xiàn)對(duì)AFB1的高靈敏定量檢測(cè)。

圖6 熱信號(hào)檢測(cè)AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of thermal signal detection AFB1

2.6 比色與熱雙模態(tài)改良型ELISA用于AFB1檢測(cè)的特異性

使用比色與熱雙模態(tài)改良型ELISA分別測(cè)定了質(zhì)量濃度為1×10-6g/L的干擾毒素(TS、OTA、AFB2、patulin、ZEN、FB1、DON)來(lái)進(jìn)行免疫檢測(cè)特異性研究。結(jié)果如圖7所示，在檢測(cè)7種干擾毒素時(shí)，既沒(méi)有觀察到干擾毒素產(chǎn)生明顯的吸光度變化，并且無(wú)明顯的溫度信號(hào)產(chǎn)生。而在檢測(cè)低質(zhì)量濃度AFB1(1×10-7g/L)時(shí)可觀察到A652nm出現(xiàn)明顯吸收峰，溫度信號(hào)也有明顯的升高。此外，測(cè)定混合液時(shí)，觀察到比色與溫度信號(hào)與單獨(dú)檢測(cè)AFB1時(shí)幾乎沒(méi)有變化。這些結(jié)果證明了即使存在高濃度干擾物質(zhì)，比色與熱雙模態(tài)改良型ELISA仍具有較高的特異性。

a-比色信號(hào)；b-熱信號(hào)圖7 檢測(cè)AFB1的特異性分析Fig.7 Specificity analysis of AFB1

2.7 方法實(shí)用性結(jié)果研究

為了驗(yàn)證比色與熱雙模態(tài)改良型ELISA在實(shí)際樣品中的適用性，我們采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)牛奶樣品中的AFB1含量進(jìn)行了檢測(cè)。我們?cè)谏虡I(yè)化ELISA試劑盒未檢測(cè)到AFB1的牛奶樣品中加入不同濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，使樣品中的AFB1終質(zhì)量濃度分別為1×10-7、1×10-8、1×10-9g/L。檢測(cè)結(jié)果如表1所示，基于比色與熱信號(hào)的測(cè)結(jié)果與加入的理論值相比，二者基本保持一致。基于雙模態(tài)信號(hào)的檢測(cè)回收率分別為99.07%～100.82%；100.74%～102.12%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)分別為1.03%～2.55%；1.13%～2.84%。結(jié)果證明了該方法在實(shí)際樣品檢測(cè)中具有良好的實(shí)用性和準(zhǔn)確性。

表1 比色與熱雙模態(tài)改良型ELISA測(cè)定牛奶中 AFB1的回收率Table 1 Colorimetric and thermal bimodal improved ELISA to determine the recovery rate of AFB1 in milk

按照2.8中所述商業(yè)ELISA試劑盒中的使用方法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、0.03、0.12、0.48、2 μg/L)。檢測(cè)結(jié)果如圖8 所示，隨著AFB1濃度的增大，A652nm逐漸降低。當(dāng)AFB1質(zhì)量濃度為0.03～2.00 μg/L，AFB1濃度與A652nm呈明顯線性關(guān)系，線性方程為A=-0.108 6 lgc+0.144 4，其中R2=0.994 9，檢測(cè)靈敏度為1.7×10-3g/L。本文中的雙模態(tài)改良型ELISA比色性檢測(cè)AFB1的靈敏度為2.47×10-12g/L，熱信號(hào)對(duì)AFB1的檢測(cè)靈敏度達(dá)到3.79×10-13g/L，分別比商業(yè)化試劑盒提高了3個(gè)和4個(gè)數(shù)量級(jí)。

a-可見(jiàn)光光譜；b-標(biāo)準(zhǔn)曲線圖8 ELISA試劑盒的可見(jiàn)光光譜和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 The visible spectra and standard curve of ELISA Kit

之后，我們用購(gòu)買(mǎi)的ELISA試劑盒和設(shè)計(jì)的比色與熱雙模態(tài)改良型ELISA方法分別對(duì)花生、牛奶、醬油、醋4種樣品中的AFB1進(jìn)行了檢測(cè)。如表2所示，試劑盒檢測(cè)出牛奶中AFB1的濃度與2種信號(hào)檢測(cè)出的結(jié)果基本保持一致，因此設(shè)計(jì)的改良型ELISA方法與ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果具有一致性。試劑盒在花生、醬油、醋中未檢出AFB1。而比色信號(hào)與熱信號(hào)檢測(cè)到的花生，醬油和醋中AFB1的濃度基本一致，可見(jiàn)該方法實(shí)用性良好。盡管已檢測(cè)到一定量的AFB1，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)家要求的≤5 μg/L，仍在安全范圍內(nèi)。

表2 比色與熱雙模態(tài)改良型ELISA檢測(cè)樣品中的 AFB1含量 單位：g/L

3 結(jié)論

本文采用MNPs作為載體來(lái)富集HRP和AFB1Apt制備檢測(cè)探針，Apt與抗體組合作為識(shí)別元件，以TMB的顯色反應(yīng)與ox-TMB的光熱效應(yīng)為信號(hào)輸出，構(gòu)建了比色與熱雙模態(tài)的改良型ELISA，實(shí)現(xiàn)了AFB1的可視化比色及便攜式溫度信號(hào)的高靈敏及高特異性檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度分別達(dá)到了2.47×10-12、3.79×10-13g/L。與商業(yè)化ELISA試劑盒相比, 靈敏度分別提高了3個(gè)和4個(gè)數(shù)量級(jí)。最后，將該方法成功應(yīng)用于牛奶，花生，醋和醬油中AFB1的檢測(cè)。適配體與抗體的組合捕獲目標(biāo)物相比試劑盒的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合更穩(wěn)定、易修飾，且相較使用兩個(gè)抗體形成三明治結(jié)構(gòu)的ELISA成本更低。因此，該方法能夠滿(mǎn)足痕量檢測(cè)AFB1的需求，在食品檢測(cè)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。