二苯乙烯苷對APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠JNK和PP2B的調(diào)控作用研究

吳文雪 蘇彥兆 劉超宇 譚俊杰 李振中 黃健 朱曉瑩 廖艷花 黃忠仕

摘 要 目的：研究二苯乙烯苷（TSG）對APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因癡呆（3×Tg-AD）小鼠c-Jun氨基末端激酶（JNK）、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（PP2B）的調(diào)控作用，探索該藥抗阿爾茨海默?。ˋD）的可能機(jī)制。方法：將45只雄性3×Tg-AD小鼠隨機(jī)分為模型組、陽性對照組（石杉堿甲，0.15 mg/kg）和TSG低、中、高劑量組（0.033、0.1、0.3 g/kg），每組9只;另取9只正常雄性C57BL/6J小鼠作為正常對照組。各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，每天給藥1次，連續(xù)給藥 60 d;正常對照組和模型組小鼠灌胃等量生理鹽水。給藥結(jié)束后，通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測定各組小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，采用尼氏染色法觀察小鼠大腦皮層和海馬部位尼氏小體變化情況，并分別采用實(shí)時熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法和Western blotting法檢測小鼠腦組織中JNK、PP2B的mRNA及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：與正常對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期顯著延長（P<0.01），原平臺象限停留時間顯著縮短（P<0.01），穿越平臺次數(shù)顯著減少（P<0.01）;腦皮層和海馬部位尼氏小體數(shù)量顯著減少、著色淺;腦組織中JNK mRNA及其蛋白的相對表達(dá)量顯著升高（P<0.01），PP2B mRNA及其蛋白的相對表達(dá)量顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，陽性對照組和TSG各劑量組小鼠逃避潛伏期顯著縮短（P<0.01），原平臺象限停留時間顯著延長（P<0.01）;穿越平臺次數(shù)顯著增加（P<0.01）;腦皮質(zhì)和海馬部位尼氏小體數(shù)量顯著增加、著色深;腦組織中JNK蛋白的相對表達(dá)量顯著降低（P<0.05或P<0.01），PP2B mRNA及其蛋白的相對表達(dá)量顯著升高（P<0.01），且TSG高劑量組小鼠腦組織中JNK mRNA的相對表達(dá)量顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：TSG對3×Tg-AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及神經(jīng)元損傷有一定改善作用，其機(jī)制可能與下調(diào)蛋白激酶JNK的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)、上調(diào)蛋白磷酸酶PP2B的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 阿爾茨海默病;二苯乙烯苷;APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠; c-Jun氨基末端激酶;鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the regulatory effects of stilbene glucoside （TSG） on c-Jun N-terminal kinase （JNK） and protein phosphortase 2B （PP2B） in APP/PS1/Tau transgenic dementia （3×Tg-AD） mice， and to explore its potential mechanism of anti-Alzheimers disease （AD）. METHODS： Totally 45 male 3×Tg-AD mice were randomly divided into model group， positive control group （huperzine A， 0.15 mg/kg）， TSG low-dose， medium-dose and high-dose groups （0.033， 0.1， 0.3 g/kg）， with 9 mice in each group. Another 9 normal male C57BL/6J mice were included into normal control group. Administration groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 60 d. Normal control group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically. After medication， Morris water maze experiment was used to test the spatial learning and memory ability of mice in each group; Nissl staining was used to observe the changes of Nissl bodies in cerebral cortex and hippocampus; mRNA and protein expressions of JNK and PP2B were detected by qRT-PCR and Western blotting assay. RESULTS： Compared with normal control group， the escape latency was significantly prolonged （P<0.01）， the retention time of the original platform quadrant was significantly shortened （P<0.01）， and the times of crossing the platform was significantly reduced in model group （P<0.01）; the number of Nissl bodies in cerebral cortex and hippocampus was significantly reduced， the staining was slight; the relative expressions of JNK mRNA and protein were significantly increased （P<0.01）， and the relative expressions of PP2B mRNA and protein were significantly decreased （P<0.01）. Compared with model group， the escape latency was significantly shortened in positive control group and TSG groups （P<0.01）; the retention time of the original platform quadrant was significantly prolonged （P<0.01）; the times of crossing the platform was significantly increased （P<0.01）; the number of Nissl bodies in cerebral cortex and hippocampus was increased significantly， the staining was heavy; the relative expression of JNK protein was significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）， the relative expressions of PP2B mRNA and protein were significantly increased （P<0.01）， while the relative expression of JNK mRNA was significantly decreased in TSG high-dose group （P<0.05）. CONCLUSIONS：TSG can improve the learning and memory ability and neuronal damage of 3×Tg-AD mice. The mechanism may be related to down-regulating the transcription and expression of protein kinase JNK， up-regulating the transcription and expression of protein phosphatase PP2B.

KEYWORDS ? Alzheimers disease; Stilbene glucoside; APP/PS1/Tau transgenic dementia mice; c-Jun N-terminal kinase; Protein phosphortase 2B

阿爾茨海默?。ˋD）亦稱老年性癡呆，是老年人群常見的一種退行性神經(jīng)疾病。隨著中國老年人口數(shù)量的日益增多，AD帶給老年群體的各種精神問題不容忽視。劉肇瑞等[1]開展的中國≥55歲人群歸因于癡呆的精神殘疾描述性流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，殘疾人群歸因于AD的精神殘疾率較高，尤其是合并多重殘疾者歸因于AD的精神殘疾率更高[1]。在中國，僅60歲以上老年人的AD患病率已達(dá)5%，而80歲以上老年人的AD患病率高達(dá)20%[2]。然而，目前可用于AD治療的藥物僅能緩解癥狀，且副作用明顯，無法達(dá)到根治的目的[3]。因此，研發(fā)具有高效低毒的治療AD的藥物已成為醫(yī)藥科研工作者關(guān)注的焦點(diǎn)。

二苯乙烯苷（化學(xué)名為2，3，5，4′-四羥基-二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，簡稱TSG）是何首烏提取物中的主要藥理活性成分。本課題組前期研究表明，TSG能通過減少β-淀粉樣蛋白（Aβ）的沉積和老年斑形成，改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[4]，同黃蕊等[5]的研究結(jié)果一致，這提示TSG在AD的防治方面有重要的研究價值，但尚需更多個模型從多角度加以證實(shí)?，F(xiàn)有研究表明，AD與過度磷酸化的Tau蛋白的關(guān)系緊密[6-8]。Tau蛋白的異常磷酸化可導(dǎo)致AD患者的認(rèn)知障礙?？梢?，抑制和調(diào)控Tau蛋白的磷酸化可能是預(yù)防和治療AD的關(guān)鍵。另有研究表明，c-Jun氨基末端激酶（JNK）、鈣調(diào)節(jié)神經(jīng)磷酸酶（PP2B）參與了Tau蛋白的異常磷酸化[9-10]，因此JNK、PP2B的表達(dá)變化可能與AD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。鑒于此，本課題組選擇高表達(dá)Tau基因突變的APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因癡呆（3×Tg-AD）小鼠為研究對象，研究TSG對其JNK、PP2B表達(dá)的影響，探索該藥抗AD的可能機(jī)制，進(jìn)而為其臨床應(yīng)用提供一定的理論支持。

1 材料

1.1 儀器

DigBehv-MG型Morris水迷宮（上海吉量軟件科技有限公司）;14050237999型半自動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、Arcadia（H+C）型包埋機(jī)[徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司];LightCycler96型熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）系統(tǒng)[羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司];ME204E型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];Tanon- 5200 multi型全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析儀（廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司）;SpactraMax i3x型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）;Neofuge15R型高速冷凍離心機(jī)（上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）;BX53型正置熒光顯微鏡（日本Olmypus公司）。

1.2 藥品與試劑

TSG提取物（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號：CHB180810，純度：≥70%）;石杉堿甲片（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號：191211202，規(guī)格：50 μg/片）;高效RIPA組織/細(xì)胞快速裂解液（批號：20190922）、尼氏染色液（批號：20200320JH）均購自北京索萊寶科技有限公司;100×蛋白酶抑制劑（美國Med Chem Express公司，批號：HY-K0010）;兔抗小鼠PP2B多克隆抗體（批號：00050052）、鼠抗小鼠JNK多克隆抗體（批號：10010983）、兔抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（批號：00083125）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗均購自美國Proteintech Group公司;鼠抗小鼠β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（美國Invitrogen公司，批號：UD277186）;總RNA提取試劑盒（美國Axygen公司，批號：00920KD1）;10%聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠快速制備試劑盒（批號：02431400）、Omini-ECLTM超靈敏感化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（批號：02391063）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（批號：013B1050）、5×蛋白快速封閉液（批號：0141189）均購自上海雅酶生物科技有限公司;其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

本研究所使用的實(shí)驗(yàn)動物有APP/PS1/Tau 3×Tg-AD和與其有相近遺傳背景的C57BL/6J兩種小鼠品系，均為SPF級、雄性。3×Tg-AD小鼠購自美國Jackson Laboratory公司（健康證書編號：1911A18008），體質(zhì)量為（25.02±0.20） g，共45只，6周齡;C57BL/6J小鼠購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0011]，體質(zhì)量為（25.20±0.16） g，共9只，6周齡。購入后，所有小鼠均飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院SPF級動物實(shí)驗(yàn)中心，直到長至8月齡后開始用于實(shí)驗(yàn)。SPF級實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境室溫為20～25 ℃、相對濕度為55%～75%。本研究通過右江民族醫(yī)學(xué)院倫理委員會的審批，實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》要求。

2 方法

2.1 分組與給藥

取8月齡3×Tg-AD雄性小鼠45只，按隨機(jī)數(shù)字表分為模型組、陽性對照組（石杉堿甲，0.15 mg/kg）和TSG 低、中、高劑量組（0.033、0.1、0.3 g/kg），每組9只。另外，取 8月齡 C57BL/6J雄性小鼠9只，作為正常對照組。正常對照組和模型組小鼠灌胃等量生理鹽水，各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，灌胃容積為10 mL/kg，每天給藥1次，連續(xù)給藥60 d。給藥組小鼠的給藥劑量參考本課題組前期已發(fā)表的文獻(xiàn)[4]設(shè)置。

2.2 小鼠空間記憶能力檢測

給藥結(jié)束后第2天，各組小鼠進(jìn)行Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)，總計5天，每天訓(xùn)練4次，每次間隔30 s。首先將平臺放于水池第三象限的中間位置，每天4次訓(xùn)練的入水順序依次為面向第一、第三、第二、第四象限池壁的中點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)開始前先將小鼠置于站臺上適應(yīng)30 s，然后面朝池壁按照第一、第三、第二、第四象限的順序依次放入水池中。實(shí)驗(yàn)設(shè)置為小鼠登上平臺5 s后終止記錄，記錄小鼠在60 s內(nèi)找到平臺的時間（即逃避潛伏期）。如果小鼠在60 s后未登上平臺，則時間記為60 s，并人為引導(dǎo)小鼠至平臺上停留30 s。

定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的第2天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，共計1天。先撤掉水池中平臺，將小鼠從原平臺象限的反向象限面向池壁中點(diǎn)放入水中，通過DigBehv 2.3動物行為分析系統(tǒng)記錄小鼠在60 s內(nèi)的游泳軌跡，并計算其在原平臺象限的停留時間和穿越原平臺次數(shù)。

2.3 小鼠腦皮層、海馬部位神經(jīng)元尼氏小體檢測

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選3只小鼠，頸椎脫臼處死，冰上操作取出完整大腦，經(jīng)脫水等常規(guī)處理后包埋成蠟塊，切片（厚度為4 μm）。選取合適腦組織切片進(jìn)行尼氏染色、中性樹膠封片，然后在顯微鏡下觀察腦皮層、海馬部位的尼氏小體染色情況。

2.4 小鼠腦組織中JNK、PP2B ?mRNA表達(dá)情況檢測

采用實(shí)時熒光定量-PCR（qRT-PCR）法進(jìn)行檢測。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選3只小鼠，頸椎脫臼處死，冰上操作取出完整大腦，保存于液氮中。取腦組織適量，用液氮研磨后，參照AxyPrep總RNA小量制備試劑盒中說明書方法提取總RNA，然后立即用微量核酸蛋白分析儀檢測總RNA純度及濃度（測得A260 nm/A280 nm在1.8～2.1之間，表明 RNA 的純度較高）。將提取的總RNA按相應(yīng)試劑盒說明書步驟進(jìn)行去DNA和逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（共20 ?μL）：上、下游引物各1 ?L、cDNA模板2 ?L、FastStart Universal SYBR Green Master（ROX） 10 ?L、無酶水6 ?L。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性10 s，60 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各目的基因mRNA的相對表達(dá)量（式中Ct是指每個反應(yīng)管內(nèi)熒光信號強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值時經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)）。引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

2.5 小鼠腦組織中JNK、PP2B蛋白表達(dá)情況檢測

采用 Western blotting 法進(jìn)行檢測。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取剩余3只小鼠，按“2.4”項下方法取材并保存。取腦組織適量，用液氮研磨，按照每200 mg腦組織加蛋白裂解液（RIPA高效快速裂解液、蛋白酶抑制劑按體積比100 ∶ 1混合）2 mL的比例進(jìn)行勻漿，于冰上充分裂解30 min后，在4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，收集上清液，采用BCA 法測定蛋白濃度后，用5×蛋白上樣緩沖液稀釋，最后于95～100 ℃變性6 min。每孔取80 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉（SDS）-PAGE凝膠電泳，然后在180 mA、室溫條件下轉(zhuǎn)移60 min至NC膜上;將膜置于QuickBlockTMWestern封閉液中，搖床上振搖10 min封閉;用TBST清洗10 min×3次，分別加入JNK一抗（稀釋比例為 1 ∶ 6 000）、PP2B、β-actin和GAPDH一抗（稀釋比例均為1 ∶ 5 000），于4 ℃孵育過夜;用TBST 清洗10 min×3次，加入相應(yīng)的二抗（稀釋比例均為1 ∶ 5 000），于4 ℃下避光振搖1 h;用TBST清洗10 min×3次，以超靈敏感化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光顯色，采用Imagej v1.8.0軟件測定條帶灰度值。其中JNK以GAPDH為內(nèi)參，PP2B以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白條帶與相應(yīng)內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示。多組間比較使用單因素方差分析;方差齊性時組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊性時組間兩兩比較采用Tamhanes T2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 TSG對3×Tg-AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

3.1.1 水迷宮定位航行訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)結(jié)果 隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力都在逐漸提高。在訓(xùn)練的第3～5天，與正常對照組比較，模型組小鼠的逃避潛伏期顯著延長（P<0.01）;與模型組比較，陽性對照組和TSG各劑量組小鼠的逃避潛伏期均顯著縮短（P<0.05或P<0.01），并且TSG高劑量組小鼠在訓(xùn)練第3天的逃避潛伏期顯著短于陽性對照組（P<0.05）。各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)游泳軌跡見圖1，逃避潛伏期趨勢見圖2。

3.1.2 水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與正常對照組比較，模型組小鼠原平臺象限停留時間顯著縮短（P<0.01），穿越平臺次數(shù)顯著減少（P<0.01）;與模型組比較，陽性對照組和TSG各劑量組小鼠原平臺象限停留時間均顯著延長（P<0.01），穿越平臺次數(shù)均顯著增多（P<0.01）;與陽性對照組比較，TSG中、高劑量組小鼠的原平臺象限停留時間顯著延長（P<0.01），穿越平臺次數(shù)顯著增多（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

3.2 TSG對3×Tg-AD小鼠腦皮層和海馬部位尼氏小體的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠腦皮層和海馬CA1區(qū)尼氏小體著色變淺，數(shù)量顯著減少，神經(jīng)元細(xì)胞排列凌亂。與模型組比較，陽性對照組和TSG各劑量組小鼠腦皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏小體著色加深且數(shù)量明顯增多，神經(jīng)元細(xì)胞更為規(guī)則有序。各組小鼠腦組織皮層和海馬部位尼氏染色顯微圖分別見圖3、圖4。

3.3 TSG對3×Tg-AD小鼠腦組織中JNK、PP2B mRNA表達(dá)的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠腦組織中JNK mRNA的相對表達(dá)量顯著升高（P<0.01），PP2B mRNA的相對表達(dá)量顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，TSG高劑量組小鼠腦組織中JNK mRNA的相對表達(dá)量顯著降低（P<0.05），陽性對照組和TSG各劑量組小鼠腦組織中PP2B mRNA的相對表達(dá)量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與陽性對照組比較，TSG高劑量組小鼠腦組織中JNK mRNA的相對表達(dá)量顯著降低（P<0.05），PP2B mRNA的相對表達(dá)量顯著升高（P<0.01）。各組小鼠腦組織中JNK、PP2B mRNA的相對表達(dá)量測定結(jié)果見表3。

3.4 TSG對3×Tg-AD小鼠腦組織中JNK、PP2B蛋白表達(dá)的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠腦組織中JNK蛋白的相對表達(dá)量顯著升高（P<0.01），PP2B蛋白的相對表達(dá)量顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，陽性對照組和TSG各劑量組小鼠腦組織中JNK蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），PP2B蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高（P<0.01）;與陽性對照組比較，TSG中、高劑量組小鼠腦組織中JNK蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低（P<0.01），PP2B蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高（P<0.01）。各組小鼠腦組織中JNK、PP2B蛋白表達(dá)的電泳圖見圖5，蛋白相對表達(dá)量測定結(jié)果見表4。

4 討論

AD是一種好發(fā)于老年人群且不可逆轉(zhuǎn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其治療手段非常有限。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TSG通過抑制Aβ前體蛋白和早老素1基因的表達(dá)對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠具有良好的改善作用[4]，提示TSG在AD的防治方面有重要的研究價值。

3×Tg-AD小鼠同其他單轉(zhuǎn)（雙轉(zhuǎn)）基因AD模型類別相比能更好地模擬AD神經(jīng)元纖維纏結(jié)（過度磷酸化的Tau蛋白聚集）病理結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)[11]，因此本課題組選擇3×Tg-AD小鼠為研究對象開展實(shí)驗(yàn)。另外，同為中藥來源的石杉堿甲早在1994年就被中國批準(zhǔn)用于臨床治療AD，其能顯著改善AD患者的認(rèn)知能力，對腦神經(jīng)元有明確的保護(hù)作用[12]，因此本研究選擇石杉堿甲作為陽性對照藥。

在生理狀態(tài)下，Tau蛋白的重要功能是協(xié)助微管蛋白組裝形成微管和維持微管的穩(wěn)定;而在AD狀態(tài)下，Tau蛋白可以通過異常構(gòu)象增加自我聚集的傾向，從而導(dǎo)致健康細(xì)胞模板錯誤折疊，最終形成惰性不溶神經(jīng)原纖維，阻礙神經(jīng)元的傳輸系統(tǒng)[9，13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3×Tg-AD小鼠表現(xiàn)出明顯的空間認(rèn)知障礙，而給予TSG低、中、高劑量處理2個月后，模型小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶障礙明顯改善，且呈一定劑量依賴性趨勢。為驗(yàn)證TSG是否具有修復(fù)受損神經(jīng)元的功能，本課題組進(jìn)行了尼氏染色實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量TSG 給藥60 d后，能使AD模型小鼠腦皮層和海馬部位尼氏小體數(shù)量增多、著色加深。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TSG具有改善AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、修復(fù)其受損神經(jīng)元的作用。

JNK是參與Tau蛋白過度磷酸化的一個重要激酶[14-15]。JNK信號通路的激活可增加海馬神經(jīng)炎癥、Tau蛋白過度磷酸化、神經(jīng)毒性和神經(jīng)元退化死亡，進(jìn)一步導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[6，15]。減少JNK信號通路的活化被認(rèn)為是解決病理性Tau蛋白導(dǎo)致AD的一個重要靶標(biāo)[14]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠腦組織中JNK mRNA及其蛋白的相對表達(dá)量均較正常對照組顯著升高，這提示AD模型小鼠的發(fā)病可能與JNK蛋白表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。給藥后，不同劑量TSG組小鼠腦組織中JNK mRNA及其蛋白的相對表達(dá)量均較模型組不同程度地降低，特別以高劑量TSG的作用最為明顯。這提示TSG對AD模型小鼠的改善作用可能是通過抑制JNK mRNA的轉(zhuǎn)錄及其蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

PP2B是唯一受鈣和鈣調(diào)素調(diào)節(jié)的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶，廣泛分布于機(jī)體各個組織。在細(xì)胞信號傳遞的過程中，PP2B通過對靶蛋白脫磷酸化而實(shí)現(xiàn)其對生理活動的調(diào)節(jié)，故被認(rèn)定為是保護(hù)AD的一個重要磷酸酶[7]。PP2B通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞中活化T細(xì)胞核因子（NFAT）和核因子κB（NF-κB）的活化以及抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生而減輕促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而抑制Tau蛋白過度磷酸化而緩解AD的病癥[7，16]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠腦組織中PP2B mRNA及其蛋白的相對表達(dá)量較正常對照組均顯著降低，這提示AD模型小鼠的發(fā)病可能與PP2B蛋白表達(dá)的增強(qiáng)有關(guān)。給藥后，TSG各劑量組小鼠腦組織中PP2B mRNA及其蛋白的相對表達(dá)量均較模型組不同程度地升高，這提示TSG對AD模型小鼠的改善作用可能是通過增加PP2B mRNA的轉(zhuǎn)錄及其蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

綜上，TSG可能是通過下調(diào)3×Tg-AD小鼠蛋白激酶JNK的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)和上調(diào)磷酸酶PP2B的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，修復(fù)小鼠腦受損皮層和海馬神經(jīng)元，進(jìn)而改善其認(rèn)知功能障礙。然而，本研究還存有一定不足之處，如每組的研究小鼠數(shù)量有限、只選用了單一時間點(diǎn)進(jìn)行考察等。在后續(xù)研究中，本課題組將進(jìn)一步對此進(jìn)行完善。

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（收稿日期：2020-07-17 修回日期：2020-08-22）

（編輯：林 靜）