電針“內(nèi)關(guān)”、“足三里”對腦梗死大鼠梗死體積及尼氏小體的影響*

王斌華，吳新貴，劉學謙，潘 劍

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧 530021）

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）是我國最常見的一種腦血管疾病，且其發(fā)病率、致殘率、致死率較高，據(jù)中國國家腦卒中篩查數(shù)據(jù)顯示，我國40～74 歲人群首次急性腦梗死標化發(fā)病率由2002年的189/10萬上升到2013年的379/10萬，平均年增長8.3%[1]，嚴重危害人們的勞動能力和生活質(zhì)量[2]。腦梗死可歸納于中醫(yī)“卒中”或“中風”范疇。中國很早就有使用針灸療法來治療卒中的記載，最早可見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，如《靈樞·熱病》：“偏枯，身偏不用而痛……巨針取之，益其不足，損其有余，乃可復也”。其后的《針灸甲乙經(jīng)》及《針灸大成》也有針灸治療卒中的描述，《針灸甲乙經(jīng)》：“偏枯，四肢不用，善驚，大巨主之”；《針灸大成卷五·八脈圖》：“中風偏枯，疼痛無時：絕骨、太淵、曲池、肩髃、三里、昆侖”等。電針療法是現(xiàn)代技術(shù)與傳統(tǒng)醫(yī)學相結(jié)合的產(chǎn)物，操作時將針刺入穴位獲得針感后，在毫針針柄上接通電針儀上的電線，利用針刺和脈沖電刺激相結(jié)合以防治疾病的方法。此療法的優(yōu)點就是能代替人工操作，節(jié)省人力，又能控制刺激量。接通電流后逐漸調(diào)整電流大小，調(diào)節(jié)到患者能耐受的程度。電針有止痛、鎮(zhèn)靜、促進氣血循環(huán)、調(diào)整肌張力等作用，電針療法已被廣泛的應用于臨床中。大量的臨床研究和基礎(chǔ)研究[3-4]都證實電針療法是針對腦梗死安全、有效、可行的治療方法。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[5-6]，電針能夠改善腦梗死大鼠肢體運動功能、促進腦梗死大鼠腦梗死區(qū)及梗死對側(cè)大腦生長相關(guān)蛋白GAP-43（growth associated protein-43）的表達，減輕腦梗死雙側(cè)神經(jīng)細胞的損傷。

尼氏小體是僅存在于神經(jīng)元細胞胞體中及樹突內(nèi)的一種顆粒，它的數(shù)量及形態(tài)與神經(jīng)元受損傷程度成正比，因此常被用來作為評價神經(jīng)元功能正常與否的指標。課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)，電針可以促進局灶性腦梗死大鼠梗死對側(cè)的尼氏小體增加，進而使局灶性腦梗死大鼠運動功能得到恢復[7]。大腦中動脈梗塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠梗死側(cè)大腦皮層的梗死體積及尼氏小體數(shù)量的增減變化與腦梗死后運動功能的恢復有何聯(lián)系，以及電針干預對這種聯(lián)系的影響如何，未見相關(guān)研究。本實驗選取“內(nèi)關(guān)”、“足三里”兩穴進行電針干預，觀察MCAO大鼠梗死側(cè)大腦皮層的神經(jīng)細胞尼氏小體的增減變化、腦梗死體積及其與腦梗死后運動功能的恢復之間的關(guān)系，為臨床運用電針治療腦梗死提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

使用健康的成年雄性SPF級SD（Sprague-Dawley，SD）大鼠54只，體重240～300 g，大鼠年齡在7～8周之間（合格證號：SCXK桂2020-0003），由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。每籠飼養(yǎng)6 只大鼠，飼養(yǎng)1周，期間自由進食飲水，采用顆粒型普通大鼠飼料喂養(yǎng)，術(shù)前禁食不禁水12 h。將54 只SD 大鼠隨機分為假手術(shù)組（n=18）和手術(shù)組（n=36），手術(shù)組制備MCAO 模型，模型制備成功后，將符合標準的大鼠隨機分為模型組和電針組，每組18只。

1.2 主要實驗試劑及儀器

2%TTC 染色液（中國武漢賽維爾科技有限公司）；醫(yī)用華佗牌毫針0.3 mm×13 mm、電子針灸治療儀（中國江蘇蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；尼氏染色液（中國武漢賽維爾科技有限公司）；4%多聚甲醛緩沖液（中國廣西北一生物科技有限公司）；手術(shù)器械（中國上海醫(yī)療器械有限公司）；線栓（中國廣州佳靈生物技術(shù)有限公司）；3.0縫合線及縫合針（中國廣西北一生物科技有限公司）。

1.3 MCAO模型造模方法

采用Zea 等[8]改良線栓法制備大鼠右側(cè)MCAO模型。術(shù)前12 h 禁食不禁水，以10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）對大鼠進行腹腔麻醉，待大鼠完全麻醉后，仰臥固定，行頸外側(cè)切口，鈍性分離肌肉及筋膜，暴露右側(cè)頸總動脈（CCA）、右側(cè)頸外動脈（ECA）和右側(cè)頸內(nèi)動脈（ICA），用3.0的縫合線扎緊CCA 和ECA，在ICA 近CCA 的分叉處備線，在距CCA 分叉3～5 mm 處用眼科剪剪一小口，然后將線栓緩緩經(jīng)CCA 插入ICA，當線端插入ICA 約1.7～2.1 cm（線栓上有一黑點，黑點到分叉即可）時，收緊備線，剪去線栓多余末端，常規(guī)用碘伏消毒，縫合頸部皮膚，待大鼠完全清醒后放回籠中，自由進食飲水。MCAO大鼠模型制備成功與否的判定參考Bederson 等[9]4分5級法，即待大鼠麻醉清醒后，在24 h 內(nèi)有：（1）大鼠左側(cè)的上下肢肢體受痛刺激后，肢體不能正常收縮；（2）大鼠不能走直線，并且身體向左傾倒或者向左側(cè)轉(zhuǎn)圓圈；（3）提住大鼠尾巴末端時，左上肢屈曲，不能向前伸直；普遍認為只要大鼠具備以上兩條癥狀表現(xiàn)時，則表明成功制備了MCAO大鼠模型。

1.4 電針治療方法

造模成功24 h后開始對大鼠進行電針治療，取穴：參照華興邦等[10]編制的《大鼠穴位圖譜的研制》定位“內(nèi)關(guān)”、“足三里”兩穴位，具體為取俯臥位固定大鼠，定位大鼠雙側(cè)上肢的“內(nèi)關(guān)”穴（前肢內(nèi)側(cè)，離腕關(guān)節(jié)約3 mm 左右的尺橈骨縫間），雙側(cè)下肢“足三里”穴（膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處）。以28 號0.5 寸無菌針灸針（13 mm×25 mm）快速直刺入穴位皮膚表層后放手，“內(nèi)關(guān)”穴約刺入3 mm，而“足三里”穴刺入深度約為5 mm。腦梗死電針治療組雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”穴及“足三里”穴分別接入電子針灸治療儀（蘇州醫(yī)療用品有限公司），波形采用疏密波，電流1 mA，刺激頻率為2/15 Hz，以大鼠肌肉輕微抖動，不嘶叫為度。療程：每日治療1 次，每次留針20 min，分別治療3 d、7 d、14 d后取材。假手術(shù)組與模型組不給予任何干預措施。

1.5 觀察指標

1.5.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評分 由同一名熟練掌握改良版大鼠神經(jīng)功能缺損評分的技術(shù)員分別對造模成功3 d、7 d、14 d 的大鼠進行評分，主要評分包括提尾實驗（0～3 分），感覺實驗（0～2 分）、行走實驗（0～3分）、平衡木實驗（0～6分）及反射和異常活動實驗（0～4分），共18分，正常SD大鼠為0分，神經(jīng)功能缺損評分在1～6 分為輕度損傷，7～12 分為中度損傷，13～18 分為重度損傷，評分越低，代表神經(jīng)功能缺損程度越輕[11]。

1.5.2 TTC 染色技術(shù)檢測腦梗死體積 TTC 染色能夠既直觀又客觀的顯示大鼠腦梗死后腦組織的梗死體積，是用來評價腦缺血損傷程度的常用指標。正常腦組織會被染成鮮紅色，而梗死灶區(qū)域腦組織被染成蒼白色。各組在腦梗手術(shù)后3 d、7 d、14 d分別隨機抽取大鼠3只，以10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射完全麻醉大鼠后迅速開顱取腦，取出的大腦在-4 ℃的冰箱凍存20 min后，放置在冰面上用刀片垂直切除小腦、嗅球，然后從額極始沿冠狀面垂直將大腦分別切成約2 mm 厚的腦片，切完共6片，以備TTC染色。

1.5.3 尼氏染色觀察腦組織形態(tài) 尼氏小體是僅存在于神經(jīng)元胞體內(nèi)的嗜堿性顆粒群，它和神經(jīng)元的功能極為密切，當各種誘發(fā)因素導致神經(jīng)元受損害變性時，尼氏小體顆?？沙霈F(xiàn)數(shù)量及位置的變化，呈明顯的溶解或消失。損害消失時，尼氏小體可恢復正常，這說明尼氏小體與神經(jīng)損害密切相關(guān)，因此尼氏小體結(jié)構(gòu)的變化可作為神經(jīng)元受損的標志。各組在術(shù)后3 d、7 d、14 d時分別隨機抽取大鼠3 只，以10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射完全麻醉大鼠后，將針從心尖插入至升主動脈，灌注約100 mL 生理鹽水，使大鼠全身血液排盡，改用冷的4%多聚甲醛約100 mL灌注固定腦組織。快速斷頭取腦，將取出的腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，進行脫水、透明、浸蠟、包埋，冠狀連續(xù)切片，隨后行尼氏染色，最后在光學顯微鏡下觀察梗死側(cè)大腦皮層運動區(qū)的病理形態(tài)變化。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 版軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。計量資料用均數(shù)±標準差（）描述，當滿足正態(tài)分布和方差齊性時，兩組比較用獨立樣本t檢驗，多組比較用單因素方差分析；若資料不符合正態(tài)分布且方差不齊時，則采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料采用百分比或率來描述，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評分

術(shù)后3 d，電針組、模型組的神經(jīng)缺損評分最高，在7 d、14 d 時，模型組和電針組的神經(jīng)功能缺損評分均呈下降的趨勢。與假手術(shù)組比較，模型組和電針組在不同時間點的神經(jīng)功能缺損評分均有顯著的提高（均P＜0.05）；與模型組相比，電針組3 d，7 d神經(jīng)功能缺損評分無明顯差異（P＞0.05），電針組14 d 的神經(jīng)功能缺損評分則有明顯的降低（P＜0.05），見表1。

表1 不同時間點各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

表1 不同時間點各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

與假手術(shù)組同一時間點比較，*P＜0.05；與模型組同一時間點相比，△P＜0.05。

2.2 大鼠腦梗死體積

電針組大鼠腦組織經(jīng)TTC染色后，大腦皮層非梗死區(qū)域腦組織染色呈鮮紅色，梗死區(qū)域腦組織染色呈蒼白色，且梗死灶多分布于皮層感覺運動區(qū)；在3 d 時，電針組與模型組腦梗死體積變化差異不顯著（P＞0.05），而電針組7 d 和14 d 的腦梗死體積相較于模型組則有明顯的減?。≒＜0.05），見圖1、圖2。

圖1 TTC染色大鼠電針不同時間點腦梗死體積

圖2 不同時間點各組大鼠腦梗體積百分比

2.3 大鼠腦組織形態(tài)學改變

模型組、電針組不同時間點大鼠大腦皮層腦組織經(jīng)尼氏染色后，模型組與電針組的神經(jīng)細胞在術(shù)后3 d均嚴重腫脹變形，核周的尼氏小體數(shù)量減少，大量神經(jīng)元細胞破碎，胞核分離，模型組與電針組腦組織形態(tài)學改變相似；術(shù)后7 d，模型組和電針組的神經(jīng)細胞仍有破碎，細胞腫脹變形，但兩組均出現(xiàn)少量尼氏小體，且電針組尼氏小體數(shù)量較模型組多。術(shù)后14 d，模型組與電針組尼氏小體數(shù)量增多，神經(jīng)元細胞輕度腫脹，胞核完整，且與模型組相比，電針組神經(jīng)細胞形態(tài)較完整，尼氏小體細胞排列較密集，呈片狀分布，見圖3。

圖3 不同時間點各組大鼠梗死側(cè)腦組織尼氏染色（×400）

3 討論

缺血性腦卒中系由各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應障礙，導致腦組織缺血缺氧性病變壞死，進而產(chǎn)生臨床上對應的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)。本實驗采取線栓法制備MCAO模型大鼠，最終使線栓阻斷大腦中動脈的起始端，進而阻斷大腦中動脈的血流供應，造成局灶性腦缺血模型，模擬人體大腦中動脈阻塞型腦缺血過程。研究發(fā)現(xiàn)，大腦缺血缺氧之后會激活缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）表達，兩種蛋白被激活后可分別誘導下游的蛋白反應，最終激活細胞的自噬功能，從而清除受損的細胞來維持正常細胞的功能，自噬和凋亡同時發(fā)生，加速細胞死亡，減小缺血半暗帶的面積，進而使腦缺血后大腦皮層的梗死體積增大[12]。

本研究中，電針組7 d、14 d 的腦梗體積與模型組相比有明顯的減少，且電針組在7 d、14 d 時尼氏小體數(shù)量較模型組有明顯增加，損傷程度較模型組輕，尼氏小體形態(tài)也較為完整，排列較模型組密集。同時電針組神經(jīng)缺損評分在7 d、14 d與模型組相比，下降幅度較大。此時在微觀層面中，電針組尼氏小體增加數(shù)量也是多于模型組，形態(tài)較完整，排列較緊密，提示電針可以增加腦梗死缺血側(cè)大腦皮層的尼氏小體數(shù)量，保持其細胞形態(tài)的完整，進而對腦梗后大鼠運動功能恢復有促進作用。內(nèi)關(guān)為心包經(jīng)絡穴，心主神明，心包為心的護衛(wèi)，代君行令，取內(nèi)關(guān)穴可通竅醒神；心主血脈，取內(nèi)關(guān)穴可通血脈行氣血。足三里為陽明經(jīng)穴、胃的下合穴，陽明經(jīng)為多氣多血之經(jīng)，陽明經(jīng)氣血通暢，正氣得以扶助，才能使機體功能逐漸恢復[13]。兩穴相配，可起到活血化瘀，舒腦通絡的作用，減輕腦梗死帶來的損害，促進腦梗死后肢體功能恢復。

本次實驗研究發(fā)現(xiàn)，電針“內(nèi)關(guān)”、“足三里”可以減小MCAO大鼠梗死側(cè)大腦皮層的梗死體積，縮短尼氏小體恢復時間，促進梗死側(cè)大腦皮層尼氏小體數(shù)量的增加，初步證實隨著梗死側(cè)大腦皮層尼氏小體的增加，MCAO 大鼠的運動功能會逐步恢復。然而，由于本課題研究方法和指標局限，樣本量不足，干預周期短，且急性腦梗死機制復雜，影響神經(jīng)可塑性的因素較繁雜，不能全面的闡述電針治療急性腦梗死的發(fā)生機制與作用。將來在人員、時間、資金較為充足的條件下，可進一步探討如：設計樣本量更大，不同電針刺激頻率、不同穴位組合的比較；不同的檢測指標之間的相互關(guān)系如何；觀測的時間位點延長，比如延長至4 周甚或1 個月或更長等等，都可以進行深入研究探討，以期為臨床電針治療腦梗死提供更加合理的方案和理論支持。