響應(yīng)面法優(yōu)化二氫楊梅素口服納米粒的制備工藝研究*

陸建媚，黃理清，麥琬婷，覃裕翠，蘇曉丹，張傳政，鐘華帥，曾勇珠，黃秋潔，葉 勇,3△

（1.廣西醫(yī)科大學藥學院，南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，南寧 530001；3.廣西生物活性分子研究與評價重點實驗室，南寧 530321）

口服納米制劑是現(xiàn)代生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點之一[1]。與傳統(tǒng)的藥物釋放方法相比，納米載體可以保護藥物不受環(huán)境污染[2]。研究發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素（DMY）在抗腫瘤方面效果明顯而且具備潛力開發(fā)為肝癌輔助用藥[3]?？诜{米載藥系統(tǒng)給藥可以保護藥物不受胃腸道生理環(huán)境所破壞，同時納米粒（NPs）還能夠快速穿透消化道的黏液層，促進腸上皮細胞的內(nèi)吞，有利于克服口服吸收的多重屏障[4]。因此，為提高DMY 抗肝癌活性、提高其在胃腸道中的穩(wěn)定性和進一步提高生物利用度，研究DMY口服緩釋的納米給藥制劑。

近年來殼聚糖（CS）[5-8]和果膠（PEC）[9-10]作為一種天然安全的載體材料在口服NPs的研究中越來越受到關(guān)注。在本研究中，以DMY為模型藥物，通過CS 質(zhì)子化的-NH3+與PEC 質(zhì)子化的-COO-，用三聚磷酸鈉（STPP）為離子交換劑，發(fā)生離子交聯(lián)，形成聚電解質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可以抵抗胃液及小腸中蛋白酶的水解作用，負載載體的DMY 到達腸道后釋放且黏附于結(jié)腸黏膜表面。使藥物在結(jié)腸轉(zhuǎn)運和停留的時間較長，減少了DMY 過早釋放藥效和臨床療效差的問題；提高了DMY的穩(wěn)定性，進而提高DMY的生物利用度。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1260 Infinity 高效液相色譜儀（安捷倫）；Nano ZSMPT-2 納米粒度電位儀（英國Malvern公司）；JY92-IIDN 超聲波細胞粉碎機（900 W，寧波新芝生物科技股份有限公司）；B13-3型智能恒溫定時磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；DZF-300真空干燥箱（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；pH 計、十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；低速臺式離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）。

1.2 材料 DMY 對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：Q-006-181218），DMY（長沙上禾生物科技有限公司）；CS（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：L2004257）；PEC（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：SLCG1374）；氫氧化鈉（成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開發(fā)區(qū)，批號：20120202）；無水乙醇（成都市科隆化學品有限公司，批號：2021091002）；乙腈（賽默飛世爾科技有限公司，批號：206482）；甲醇（賽默飛世爾科技有限公司，批號：204135）；磷酸（重慶川東化工集團有限公司，批號：2021110801）；三乙胺（天津市大茂化學試劑廠，批號：20210217）；冰乙酸（成都市科隆化學品有限公司，批號：2017041301）；鹽酸（廉江市愛廉化試劑有限公司，批號：2020092201）。

2 方 法

2.1 色譜條件 Kromasil C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相∶乙腈—0.2%磷酸三乙胺（22∶78）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：291 nm；進樣量：20 μL。

2.2 溶液制備（1）對照品溶液的制備：精密稱取1 mg DMY 對照品，置于5 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容，得質(zhì)量濃度為200 μg/mL 對照品溶液。（2）供試品CS-DMY-PEC-NPs的制備：精密量取CS-DMYPEC-NPs溶液1～5 mL，甲醇定容至刻度線，得供試品溶液。（3）陰性對照品CS-PEC-NPs的制備：取CSPEC-NPs 按供試品溶液配制方法制備陰性對照溶液。

2.3 專屬性考察 分別將DMY 對照品溶液、CSDMY-PEC-NPs 溶液和CS-PEC-NPs 陰性對照溶液按“2.1 項”下方法進樣測定，記錄進樣色譜圖，結(jié)果表明，DMY 在供試品溶液和對照品溶液中出峰位置一致，樣品中其他成分對DMY含量測定無干擾，見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取DMY 1.00 mg，置于5 mL 容量瓶中，加入適量的甲醇溶解并定容，得200 μg/mL 的對照品母液，從母液中精密吸取適量的對照品溶液分別配置成1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL 系列質(zhì)量濃度的溶液。在“2.1 項”色譜條件下進樣，該色譜條件下，出峰時間約為6.5 min，以峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，得回歸方程為Y=43.808X-14.681（r=0.999 6），表明DMY在1～16 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.5 精密度考察 低、中、高（2 μg/mL、6 μg/mL、12 μg/mL）3個濃度的DMY原料藥溶液，在“2.1項”色譜條件下進樣分析，每一濃度進樣6次，記錄峰面積，測得日內(nèi)精密度（RSD）分別為1.04%、0.75%和1.44%；日間RSD分別為1.08%、0.99%、0.59%（n=6，連續(xù)6 d）。

2.6 重復(fù)性考察 按照“2.1 項”方法平行制備6 份樣品溶液，進樣記錄峰面積，計算得CS-DMY-PECNPs的峰面積RSD值為2.38%，所以重復(fù)性良好。

2.7 NPs 的制備（1）CS-PEC-NPs 的制備：采用離子凝膠法制備，將PEC 和STPP 用純水配制，用2%的醋酸配制CS并調(diào)至一定pH。隨后在磁力攪拌鍋中按照1 mL/min的速度勻速將STPP溶液和PEC溶液依次加入CS 溶液中，滴加完畢后攪拌30 min，通過離心收集NPs，實驗重復(fù)3 次。（2）CS-DMY-PECNPs 的制備：載體溶液配制同上，稱取適量DMY 溶解于無水乙醇中，在磁力攪拌鍋中按照1 mL/min的速度勻速將STPP溶液、DMY溶液和PEC依次加入CS 溶液中，滴加完畢后攪拌30 min，通過離心收集NPs，實驗重復(fù)3次。

2.8 CS-DMY-PEC-NPs包封率、載藥量的測定

采用低速離心法測定CS-DMY-PEC-NPs 的包封率和載藥量。將“2.7 項”制備的樣品，在4 000 r/min離心20 min，取上清液，HLPC檢測，計算游離濃度，結(jié)果為未被包封DMY質(zhì)量，離心后沉淀物真空干燥后的重量為載藥系統(tǒng)總質(zhì)量。包封率=（DMY質(zhì)量-未被包封DMY 質(zhì)量）/DMY 總質(zhì)量×100%，載藥量=（DMY 質(zhì)量-未被包封DMY 質(zhì)量）/載藥系統(tǒng)總質(zhì)量×100%。

2.9 CS-DMY-PEC-NPs 粒徑、聚合物分散性指數(shù)（PDI）和電位的測定 取“2.8 項”下離心后沉淀物真空烘干的樣品，在酸性條件下重新分散后稀釋至一定倍數(shù)，過膜后測定其粒徑、PDI和電位。

2.10 單因素分析 在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，分別對CSDMY-PEC-NPs 的制備過程中影響包封率的6 個主要影響因素：不同的質(zhì)量比（CS∶STPP∶DMY∶PEC）、PEC濃度、CS的pH值、CS濃度、TPP濃度、離心轉(zhuǎn)速等進行逐一考察。

2.11 質(zhì)量比考察 固定PEC、STPP、DMY 濃度為1 mg/mL，分別考察CS∶STPP∶DMY∶PEC 的質(zhì)量比（2.1∶1∶1∶1、2.8∶1∶1∶1、3.5∶1∶1∶1、4.2∶1∶1∶1）對CS-DMY-PEC-NPs包封率、載藥量和粒徑的影響。

2.12 PEC 濃度考察 固定CS∶STPP∶DMY∶PEC的質(zhì)量比為2.8∶1∶1∶1，STPP、DMY 濃度1.0 mg/mL，CS 濃度1.4 mg/mL，分別考察PEC 濃度1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL 和4.0 mg/mL 對CSDMY-PEC-NPs包封率、載藥量和粒徑的影響。

2.13 CS的pH值考察 固定CS∶STPP∶DMY∶PEC的質(zhì)量比為2.8∶1∶1∶1，STPP、DMY 濃度1.0 mg/mL，CS 濃度1.4 mg/mL，分別考察CS 溶液的pH 值3.5、4.0、4.5 和5.0 對CS-DMY-PEC-NPs 包封率、載藥量和粒徑的影響。

2.14 CS 濃度考察 固定CS∶STPP∶DMY∶PEC 的質(zhì) 量 比 為2.8∶1∶1∶1，PEC、STPP 和DMY 濃 度1.0 mg/mL，分別考察CS 濃度0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL 和2.0 mg/mL 對CS-DMY-PEC-NPs包封率、載藥量和粒徑的影響。

2.15 STPP 濃度考察 固定CS∶STPP∶DMY∶PEC的質(zhì)量比為2.8∶1∶1∶1，PEC、DMY濃度1.0 mg/mL，CS 濃度1.4 mg/mL，分別考察STPP 濃度0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL 和1.5 mg/mL 對CSDMY-PEC-NPs包封率、載藥量和粒徑的影響。

2.16 離心轉(zhuǎn)速考察 固定CS∶STPP∶DMY∶PEC的質(zhì)量比為2.8∶1∶1∶1，PEC、STPP、DMY 濃度1.0 mg/mL，CS 濃度1.4 mg/mL，分別考察離心轉(zhuǎn)速1 000 r/min、2 000 r/min、3 000 r/min 和4 000 r/min對CS-DMY-PEC-NPs包封率、載藥量和粒徑的影響。2.17 最優(yōu)處方實驗設(shè)計 根據(jù)響應(yīng)面法，結(jié)合前期處方篩查單因素考察結(jié)果，選取對NPs 性質(zhì)影響最大的3個因素進行響應(yīng)面考察，獲取最優(yōu)處方。

3 結(jié)果

3.1 質(zhì)量比的考察結(jié)果 結(jié)合粒徑、包封率和載藥量分析，CS∶STPP∶DMY∶PEC 的質(zhì)量比2.8∶1∶1∶1是最佳條件，見表1。

表1 CS∶STPP∶DMY∶PEC的質(zhì)量比對CS-DMY-PEC-NPs各指標的影響，n=3

表1 CS∶STPP∶DMY∶PEC的質(zhì)量比對CS-DMY-PEC-NPs各指標的影響，n=3

3.2 PEC濃度的考察結(jié)果 結(jié)合粒徑、包封率和載藥量分析，PEC濃度1.0 mg/mL是最佳條件，見表2。

表2 PEC濃度對CS-DMY-PEC-NPs各指標的影響，n=3

表2 PEC濃度對CS-DMY-PEC-NPs各指標的影響，n=3

3.3 CS的pH值的考察結(jié)果 結(jié)合粒徑、包封率和載藥量分析，pH值4.5是最佳條件，見表3。

表3 CS的pH值對CS-DMY-PEC-NPs各指標的影響，n=3

表3 CS的pH值對CS-DMY-PEC-NPs各指標的影響，n=3

3.4 CS 濃度的考察結(jié)果 結(jié)合粒徑、包封率和載藥量分析，CS濃度1.0 mg/mL是最佳條件，見表4。

表4 CS濃度對CS-DMY-PEC-NPs各指標的影響，n=3

表4 CS濃度對CS-DMY-PEC-NPs各指標的影響，n=3

3.5 STPP 濃度的考察結(jié)果 結(jié)合粒徑、包封率和載藥量分析，STPP 濃度1.0 mg/mL 時是最佳條件，見表5。

表5 STPP濃度對CS-DMY-PEC-NPs各指標的影響，n=3

表5 STPP濃度對CS-DMY-PEC-NPs各指標的影響，n=3

3.6 離心轉(zhuǎn)速的考察結(jié)果 結(jié)合粒徑、包封率和載藥量分析，離心轉(zhuǎn)速2 000 r/min是最佳條件，見表6。

表6 離心轉(zhuǎn)速對CS-DMY-PEC-NPs各指標的影響，n=3

表6 離心轉(zhuǎn)速對CS-DMY-PEC-NPs各指標的影響，n=3

3.7 響應(yīng)面法得出最優(yōu)處方 采用響應(yīng)面法，以PEC 濃度（X1）、CS 的pH 值（X2）、離心轉(zhuǎn)速（X3）為考察因素，在單因素考察的基礎(chǔ)上，確定取值范圍，PEC 濃度2.0～4.0 mg/mL，CS 的pH 值3.5～4.0，離心轉(zhuǎn)速2 000～4 000 r/min。以包封率（Y1）、載藥量（Y2）、粒徑（Y3）為指標，按照“2.7項”下方法制備CSDMY-PEC-NPs，獲取最適宜的納米給藥系統(tǒng)。因素水平見表7，實驗設(shè)計見表8。

表7 響應(yīng)面法試驗因子水平

本試驗有3個函數(shù)指標，所以將包封率、載藥量和粒徑歸一化處理得出總評歸一值（OD）值，并以O(shè)D 值為CS-DMY-PEC-NPs 的響應(yīng)指標。從圖2 中可以看出OD值三維響應(yīng)面均為曲面。說明PEC濃度、CS的pH值、離心轉(zhuǎn)速三者用量與OD值之間為非線性關(guān)系。計算過程：（1）包封率（d1）和載藥量（d2）越大越好，dmax=（Mi-Mmin）/（Mmax-Mmin）；粒徑（d3）越小越好，dmax=（Mmax-Mi）/（Mmax-Mmin）（Mi 表示測量值，Mmin 表示最小值，Mmax表示最大值）。（2）各指標歸一值算幾何平均數(shù)，得總評歸一OD 值，計算公式為（k 為指標數(shù)），見表8。

表8 CS-DMY-PEC-NPs的實驗設(shè)計因素及結(jié)果

圖2 CS-DMY-PEC-NPs處方優(yōu)化中各因素交互作用的響應(yīng)面圖

采用Design-Expert 8.0.6.1 軟件，以O(shè)D 值為因變量對各因素進行二項式擬合分析，擬合方程為：OD=0.53-0.005X1+0.074X2+0.33X3-0.17X1X2-0.022X1X3-0.075X2X3-0.094X12-0.066X22-0.046X32（R2=0.837 6，Radj2=0.628 7，P=0.040 3），二項式方程擬合時用相關(guān)系數(shù)R2表示，由擬合方程式得知此模型的擬合度較高，能很好地反映3 個考察因素與評價指標之間的關(guān)系。模型的確定系數(shù)為Radj2值，OD值Radj2值為0.628 7，表明響應(yīng)值的變化有62.87%來源于3 個自變量的影響，方程的因變量與全體自變量間具有顯著的線性關(guān)系。

對于響應(yīng)指標OD值進行方差結(jié)果分析，從表9方差分析的顯著性檢驗可知，模型P小于0.05 說明模型顯著，表明單獨或相互作用項之間沒有顯著差異。擬失項大于0.05，說明未知因素對模型干擾很小。

表9 OD值方差分析結(jié)果

3.8 工藝驗證 平行制備并測定3 份CS-DMYPEC-NPs最優(yōu)處方的包封率、載藥量、粒徑，并與預(yù)測值相比較，計算實際值與預(yù)測值的偏差，偏差=（預(yù)測值-實測值）/預(yù)測值×100%，見表10，實測值與預(yù)測值在誤差范圍內(nèi)。實測包封率、載藥量和粒徑大小與預(yù)測值較為接近，證明應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化CSDMY-PEC-NPs 處方具有良好的預(yù)測性，可靠性較高。CS-DMY-PEC-NPs粒徑分布圖見圖3。

圖3 CS-DMY-PEC-NPs粒徑圖

表10 預(yù)測值與實測值的比較

4 討論

離子凝膠法通過STPP 上帶負電荷PO-Na-與CS上帶正電荷質(zhì)子化的-NH3+發(fā)生分子間和分子內(nèi)交聯(lián)而形成NPs[11]，該法操作簡單、作用時間短、工藝條件易得且所用試劑無毒[12]，所以用該法研究制備的CS-DMY-PEC-NPs 沒有毒副作用。本實驗應(yīng)用該法可在室溫條件下制備出粒徑大小均一、穩(wěn)定的NPs。

響應(yīng)面法可以建立二次多項式方程，利用多項式近似把因子與研究結(jié)果關(guān)系函數(shù)化，既可以保證實驗準確度，還可以研究多種因素相互影響。從而獲取了多個因素的最佳組合和整個區(qū)域的最佳響應(yīng)值[13]。響應(yīng)面法可以同時對實驗的各個水平因素進行分析，具有良好的預(yù)測性。研究證明，采用響應(yīng)面法進行處方優(yōu)化，得到的預(yù)測值與理論值較接近，說明建立的模型預(yù)測性較好。本實驗在單因素的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對CS-DMY-PEC-NPs處方進行優(yōu)化，對結(jié)果進行二項式擬合分析以及二維、三維效應(yīng)面，并在最優(yōu)區(qū)域篩選出最佳處方范圍值，得到最佳的制備工藝。

CS 是一種陽離子聚合物。由于其具有生物降解性、生物相容性、生物靶向性、生物粘附特性和滲透性增強等特性，已成為納米藥物載體的研究熱點[14]。PEC 是一種陰離子可溶性多糖，從植物的初生細胞壁中提取。PEC可以完整地通過上消化道，并被腸道菌群分解。PEC 在結(jié)腸的堿性pH 值下是一種粘稠的粘合劑[10]。然而，單獨使用時，PEC在堿性條件下會膨脹，這可能導致藥物負荷過早釋放。當與其他聚合物結(jié)合使用時，會產(chǎn)生更穩(wěn)定的基質(zhì)。因此，使用PEC 和CS 作為載體，以限制DMY在較高pH 值下的過早釋放，確保在腸道條件下改善黏液黏附性。此外，PEC 容易被結(jié)腸微生物降解，這將確保DMY 從復(fù)合聚合物基質(zhì)中局部釋放。所以在本研究中用傳統(tǒng)的CS作為納米藥物載體以及STPP作為交換劑制備NPs外，還增加了PEC作為納米藥物載體。為后續(xù)用CS-PEC作為載體包載藥物達到靶向腸道菌群奠定實驗基礎(chǔ)。

在后續(xù)研究中，還對CS-DMY-PEC-NPs的質(zhì)量表征及體內(nèi)外的藥效、藥動及安全性進行深入研究，為其新劑型的開發(fā)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。