厚冰凍切片尼氏染色方法研究

金一丹,沈俊媛,解子璇,潘永良,劉婉茹

(湖州師范學(xué)院 醫(yī)學(xué)院,浙江 湖州 313000)

0 引 言

腦區(qū)劃分的精準(zhǔn)程度會(huì)影響細(xì)胞和神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)在不同腦區(qū)的分布統(tǒng)計(jì)結(jié)果,進(jìn)而影響腦科學(xué)整體實(shí)驗(yàn)結(jié)論[1].尼氏染色法使用堿性染料(焦油紫、甲粉紫、硫堇等)使神經(jīng)元胞體內(nèi)的尼氏小體著色[2],染色后,腦區(qū)邊界清晰,組織結(jié)構(gòu)明顯,因此常被用于薄組織切片的二維形態(tài)學(xué)分析[3],是實(shí)現(xiàn)腦區(qū)劃分的重要方法.相較薄切片而言,百微米級(jí)的厚腦切片包含的細(xì)胞更多,且神經(jīng)元的形態(tài)更完整[4],因此更適于一些神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的分析和細(xì)胞整體形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的觀察.雖然已有研究詳細(xì)介紹了幾微米到五十微米厚度薄切片的尼氏染色方法[5-6],但缺乏對(duì)更厚切片尼氏染色方法的相關(guān)報(bào)道,由此導(dǎo)致在對(duì)厚切片區(qū)域劃分時(shí),研究者需參照連續(xù)薄切片的染色圖像,對(duì)解剖結(jié)構(gòu)和相對(duì)位置進(jìn)行人工重建.然而,這種方法易存在主觀差異和產(chǎn)生形態(tài)學(xué)干擾[7-8],極大影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性.因此本實(shí)驗(yàn)以長爪沙鼠200 μm冰凍腦切片為研究對(duì)象,在薄切片尼氏染色方法的基礎(chǔ)上,對(duì)厚冰凍切片染色過程中可能出現(xiàn)冰晶樣空洞、脫片、染色不均等問題的步驟加以改良,以探討出一套適用于厚冰凍切片的尼氏染色方法.

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性長爪沙鼠購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)期間飼養(yǎng)于溫度(22±2)℃、相對(duì)濕度(50±5)%的環(huán)境中.本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的所有操作均遵循湖州師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用規(guī)范,并在處理過程中盡量減少動(dòng)物的痛苦.

1.2 實(shí)驗(yàn)器材與試劑

防脫載玻片(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司)、Leica CM1850 冰凍切片機(jī)(德國雷卡公司)、染色架(FJ026,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、LZJ-6EL型手術(shù)顯微鏡(鎮(zhèn)江中天光學(xué)儀器有限責(zé)任公司)、Zeiss Axio Scope.A1顯微鏡(北京盛鴻程科技有限公司)、立式缸等;4%多聚甲醛(41533,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、TritonX-100(14600102,西隴化工股份有限公司)、PBS溶液(C0221A,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、尼氏(Nissl)染色液(C0117,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、酒精、蒸餾水等.

2 研究方法

2.1 厚切片制備

長爪沙鼠按8 mg/100 g的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉后立即斷頭取腦,將腦組織置于干冰中速凍至表面變白后存于-80 ℃冰箱中,以待備用.冰凍切片機(jī)溫度控制在-10～-12 ℃,切片前將鼠腦移至冰凍切片機(jī)內(nèi)復(fù)溫至少20 min.行200 μm冠狀面切片,取置于室溫下的防脫載玻片與處于冰凍切片機(jī)操作環(huán)境溫度(-10～-12℃)下的腦區(qū)冠狀切片,其溫差近35 ℃,這可使切片自然黏附于防脫載玻片上.

2.2 染色步驟

切片經(jīng)40～50 ℃烘干2～3 h,再經(jīng)室溫完全風(fēng)干后,放入4%多聚甲醛溶液中固定,置于4 ℃冰箱過夜;從4%多聚甲醛固定液中取出,放入鋁制染色架內(nèi),通過立式缸內(nèi)蒸餾水浸泡玻片1 min的洗滌方法,洗去多聚甲醛;將切片置于含0.5% TritonX-100的PBS溶液中破膜2 h,再在立式缸內(nèi)用蒸餾水浸泡玻片1 min,洗去破膜液;室溫下焦油紫染色30 min,將切片浸入蒸餾水2次,再依次浸入濃度分別為 50%、75%、85%、95%、100%的酒精中進(jìn)行梯度脫水,每種溶液的脫水時(shí)間均為1 min,共7 min.以上操作皆于立式缸內(nèi)完成.中性樹膠封片、貼標(biāo)簽,晾干后及時(shí)在顯微鏡下觀察,并拍攝成像.

3 結(jié) 果

采用Zeiss Axio Scope.A1顯微鏡,在50倍和200倍下觀察長爪沙鼠厚冰凍腦切片,結(jié)果見圖1.由圖1可見,尼氏小體著色明顯,呈深藍(lán)色;背景著色均勻,呈淡藍(lán)色;無冰晶空洞,染色對(duì)比度強(qiáng)(圖1).

手術(shù)顯微鏡所成的切片圖像見圖2.由圖2可見,腦區(qū)界限清晰,皮層、海馬、腦室等組織結(jié)構(gòu)明顯,切片形態(tài)基本完整,無松散、皺褶、脫片現(xiàn)象.

4 討 論

在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域,用百微米級(jí)的厚切片開展特定腦區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察和基因表達(dá)分布等研究,越來越受到人們的重視.雖然尼氏染色在幾微米至數(shù)十微米厚度的薄切片染色中較為成熟,但在厚切片中報(bào)道較少.以往研究發(fā)現(xiàn),厚切片染色易出現(xiàn)空洞、脫片、染色效果不佳等問題.因此,本研究在薄切片尼氏染色方法的基礎(chǔ)上,對(duì)厚切片染色過程中出現(xiàn)問題的步驟進(jìn)行改良,以建立一套適用于厚切片尼氏染色的方法.

在腦組織冷凍切片染色中,切片最好稍晾干后再固定,而不能立即固定[9-10].因?yàn)槟X組織內(nèi)有多個(gè)微囊,冰凍切片立即固定染色會(huì)出現(xiàn)類似冰晶的空洞,而用電熱吹風(fēng)正吹后或室溫晾干后固定染色則無空洞形成[11-12].馮家成等用電熱吹風(fēng)正吹切片或?qū)⑶衅糜谑覝亓栏? min以上后固定,可使微囊消失彌合,且無空洞產(chǎn)生[13].因馮家成等處理的是4～6 μm冰凍切片,所以本研究根據(jù)切片厚度及烘干溫度,調(diào)整了烘片時(shí)間的長短,染色效果理想.實(shí)驗(yàn)證明,烘片時(shí)間與切片厚度成正比,與烘片溫度成反比.但要注意的是:溫度不可過高,否則會(huì)破壞細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)[14];烘片時(shí)間也不宜過長,在切片較為透明時(shí)即可停止烘片,否則會(huì)出現(xiàn)染色過程中的“灰染”現(xiàn)象.

固定和染色的時(shí)間長短常影響切片的染色效果.本方法將200 μm切片置于4%多聚甲醛溶液中固定超12 h,切片固定充分,染色均勻,細(xì)胞著色清晰.梁艷清等認(rèn)為,4%多聚甲醛較溫和,可維持細(xì)胞形態(tài),適合作為新鮮組織冰凍切片的固定液[15].但其固定速度慢,通常需要較長的固定時(shí)間[16],而且厚切片的中間組織不易徹底固定,染色后中間細(xì)胞著色模糊,染色不均[17].延長固定時(shí)間可使核漿著色后的光學(xué)差異更為顯著,顏色更加鮮明,便于觀察[18].這與本研究的染色結(jié)果一致.本文采用焦油紫染液染色30 min左右,染色結(jié)果清晰、對(duì)比度強(qiáng).探索染色時(shí)間時(shí),在尼氏染色第一遍蒸餾水洗滌后,直接在鏡下觀察切片的染色程度.若染色較淺、核質(zhì)清晰度一般,可復(fù)染并適當(dāng)延長染色時(shí)間;若染色過深、核漿顯色對(duì)比度弱,可適當(dāng)延長不同梯度酒精的分色時(shí)間.

防脫片在染色過程中十分重要,實(shí)驗(yàn)操作一般要做到以下幾點(diǎn):①固定前充分烘片,使切片與載玻片貼合得更緊密,以降低脫片的概率;②使用染色架要以立式缸浸泡玻片的洗滌方法取代流水直接沖洗,以有效減少因劇烈洗滌而導(dǎo)致的脫片;③尼氏染色切片需經(jīng)梯度脫水和二甲苯透明.但厚切片經(jīng)二甲苯透明后,易發(fā)脆變硬,進(jìn)而出現(xiàn)破碎、松散、脫片.因此,本文未采用二甲苯透明,而是用酒精脫水后直接封片,在保證切片質(zhì)量的同時(shí),還可避免與有毒試劑接觸,且更為安全.

本研究改良了厚切片尼氏染色過程中易產(chǎn)生的冰晶樣空洞、脫片、染色效果不佳等問題,獲得了良好的染色效果,能較為清晰地展現(xiàn)出厚切片的組織形態(tài),進(jìn)一步提高了尼氏染色技術(shù)在厚切片中的應(yīng)用價(jià)值.這種適用于厚切片尼氏染色的方法也可為多種厚度、多種組織切片類型的尼氏染色提供參考.