NAD+對(duì)tMCAO小鼠的腦保護(hù)作用

陳昕　魏珍玉　岳丹丹　潘杰　鐘萍　吳丹紅

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NAD+對(duì)tMCAO小鼠的腦保護(hù)作用

陳昕魏珍玉岳丹丹潘杰鐘萍吳丹紅

目的探討煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)對(duì)大腦中動(dòng)脈短暫阻塞再灌注(tMCAO)小鼠的腦保護(hù)作用。方法實(shí)驗(yàn)分為正常組、假手術(shù)組，缺血2 h再灌注模型組和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸組；采用線栓法制作tMCAO小鼠模型；2 h后再灌注時(shí)立即腹腔注射NAD+建立tMCAO+ NAD+組；48 h后觀察以上4組小鼠行為學(xué)的差異，采用蘇木素-伊紅(HE)染色法對(duì)小鼠腦組織進(jìn)行染色，觀察其病理變化及計(jì)算梗死體積，利用尼氏染色法檢測(cè)尼氏小體的變化。結(jié)果與正常組及假手術(shù)組相比較，tMCAO組出現(xiàn)明顯神經(jīng)損傷性異常行為；tMCAO組腦組織出現(xiàn)嚴(yán)重病理變化，腦梗死體積增大，單位體積腦組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，尼氏小體減少。tMCAO+NAD+組與tMCAO組比較，神經(jīng)功能缺損程度明顯減輕(P<0.05)，梗死體積減小(P<0.01)，單位體積腦組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量多，尼氏小體多。結(jié)論NAD+對(duì)tMCAO小鼠的腦損傷有一定的保護(hù)作用。

缺血再灌注損傷NAD+保護(hù)

當(dāng)急性缺血性腦卒中發(fā)生后腦組織出現(xiàn)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮功能受損、血腦屏障破壞、纖溶系統(tǒng)失平衡、細(xì)胞死亡等多種病理生理變化[1-2]，在細(xì)胞的代謝反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)是脫氫酶的輔酶，其分子式為C21H27N7O14P2，是一種質(zhì)子傳遞輔酶，在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)及呼吸鏈中發(fā)揮著不可替代的作用，同時(shí)NAD+作為經(jīng)典的能量代謝調(diào)控分子在維持線粒體功能、能量代謝、鈣鹽平衡、基因表達(dá)等生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用[3-6]。

由于缺血性腦卒中有效治療方法的匱乏，探索缺血性腦損傷新的治療方法及藥物一直是腦卒中研究的焦點(diǎn)。近年研究發(fā)現(xiàn)NAD+可能是擁有多個(gè)靶點(diǎn)的神經(jīng)保護(hù)劑[7]。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)在暫時(shí)性局部腦缺血的大鼠模型中給予NAD+能有效減少水腫形成，提示NAD+對(duì)缺血性腦損傷有保護(hù)作用[8]。目前國(guó)內(nèi)尚無NAD+與缺血性腦損傷的相關(guān)研究，本研究將應(yīng)用小鼠大腦中動(dòng)脈短暫阻塞再灌注(temporary middle cerebral artery occlusion,tMCAO)模型進(jìn)一步證實(shí)在急性缺血性腦卒中發(fā)生早期給予NAD+是否具有腦保護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年健康雄性ICR小鼠32只，體重約(25～30 g)，由斯萊克(SLAC)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分籠以標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2主要試劑及試劑盒：

1.2.1NAD+試劑由西格瑪公司(Sigma Chemical Co)提供。

1.2.2蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、尼氏染色試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所提供。

1.2.3其他試劑均為市售分析純產(chǎn)品。

1.3ICR小鼠中動(dòng)脈阻塞是再灌注模型制作

1.3.1分組：將小鼠隨機(jī)分為4組：正常組(control 組),假手術(shù)組( sham組)，缺血2 h再灌注模型組(tMCAO 組)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸組(tMCAO+NAD+組)。

1.3.2建模：采用線栓法制作小鼠大腦中動(dòng)脈短暫阻塞(temporary middle cerebral artery occlusion,tMCAO)模型。每組各8只；首先將老鼠仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，然后腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)來實(shí)現(xiàn)麻醉；然后在手術(shù)顯微鏡下游離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)；用6-0線栓穿入頸外動(dòng)脈殘端，結(jié)扎分叉處縫線后剪斷血管，進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)顱內(nèi)段，阻斷大腦中動(dòng)脈(MCA)起始段，線頭位于大腦前動(dòng)脈；用激光多普勒血流儀測(cè)量并記錄雙側(cè)大腦中動(dòng)脈血流(位置大約在前囟旁3 mm左右處)，以降低至基礎(chǔ)血供10%以下為建模成功的標(biāo)準(zhǔn)。120 min后將線栓抽回至頸外動(dòng)脈，以恢復(fù)頸內(nèi)-大腦中動(dòng)脈的血供，實(shí)現(xiàn)再灌注。

1.3.3給藥：將NAD+溶解于0.9%的生理鹽水中，其中tMCAO+NAD+組在再灌注后立即腹腔注射NAD+生理鹽水溶液，給藥劑量為50 mg/kg。tMCAO組同時(shí)注射同容積生理鹽水。

1.3.4行為學(xué)評(píng)分：tMCAO模型建立后飼養(yǎng)48 h，采用神經(jīng)損傷行為學(xué)評(píng)分(LONGA分級(jí)法)對(duì)4組小鼠術(shù)后行為進(jìn)行評(píng)分[9]。具體評(píng)分準(zhǔn)則如下：0分為無缺陷；1級(jí)為不能伸展對(duì)側(cè)前肢；2分為對(duì)側(cè)前肢屈曲；3分為輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分為嚴(yán)重向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；5分為向?qū)?cè)跌倒。

1.3.5組織取材及大腦梗死體積計(jì)算：四組小鼠在tMCAO模型建立后飼養(yǎng)48 h進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分后，通過注射水合氯醛處死，取出大腦，冰凍切片，H-E染色觀察腦組織損傷。具體步驟如下：先用多聚甲醛固定，然后用蘇木素染色液染色，之后用自來水沖洗染液，95%乙醇洗滌，伊紅染色液染色，再經(jīng)過梯度酒精脫水和二甲苯透化，行封片處理，晾干之后，再放于顯微鏡下進(jìn)行觀察。利用掃描儀拍下切片的H-E全局圖片，無著色或者著色淺為梗死區(qū)。利用Image Pro Plus計(jì)算每個(gè)切片梗死對(duì)側(cè)半腦面積和梗死區(qū)未梗死區(qū)面積，差值即為梗死面積，得出每片腦組織的梗死面積、梗死側(cè)腦片的總面積、梗例對(duì)側(cè)腦片的總面積，計(jì)算梗死體積：總梗死體積=總梗死面積×腦片厚度，并計(jì)算單位體積腦組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。

1.3.6尼氏染色：用多聚甲醛固定冰凍切片，采用尼氏染色液染色，再用蒸餾水洗滌，再經(jīng)過梯度酒精脫水、二甲苯透化、封片、晾干之后，放于顯微鏡下觀察分析。

1.3.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用Graphpad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用t檢驗(yàn)對(duì)4組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

2　結(jié)　果

1.神經(jīng)損傷評(píng)分：正常組與假手術(shù)組之間(神經(jīng)損傷評(píng)分、大腦梗死體積、尼氏染色)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與正常組比較，tMCAO組小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重程度的神經(jīng)缺損性癥狀，表現(xiàn)在小鼠行走嚴(yán)重障礙，向?qū)?cè)傾倒，缺血對(duì)側(cè)前后肢屈曲，按照LONGA法評(píng)分，tMCAO模型組得分(3.40±0.24)分(n=8)。與tMCAO組比較，tMCAO+NAD+組小鼠神經(jīng)缺損性癥狀明顯減輕，小鼠可曲線行走，僅向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，行為學(xué)評(píng)分顯著下降至(2.10±0.33)分(n=8)。

2.大腦梗死體積及細(xì)胞數(shù)量：我們利用腦切片HE染色法評(píng)價(jià)大腦組織壞死情況。正常組小鼠大腦無損傷，HE著色均勻(圖2)；tMCAO組腦組織出現(xiàn)嚴(yán)重壞死，缺血區(qū)細(xì)胞核急劇減少，HE著色淡(圖2)；NAD+組腦組織壞死體積顯著減少(圖2)。利用數(shù)學(xué)模型估算出小鼠腦梗死的體積(圖2)，tMCAO組小鼠腦梗死體積約為43.26 mm3，NAD+組小梗死體積下降至25.69 mm3。正常組小鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞豐富，尼氏染色顯示較多神經(jīng)細(xì)胞(圖3組)；tMCAO組腦組織出現(xiàn)嚴(yán)重壞死，尼氏染色顯示神經(jīng)細(xì)胞明顯減少(圖3組)；tMCAO+NAD+組腦組織神經(jīng)細(xì)胞明顯增加(圖3組)。利用數(shù)學(xué)模型估算出小鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量(圖3)，正常組小鼠腦組織單位體積神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量約為1.48×105/mm3；tMCAO組小鼠腦組織單位體積神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量約為0.65×105/mm3；NAD+組小鼠腦組織單位體積神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量約為1.25×105/mm3。

圖1 tMCAO組和tMCAO+NAD+神經(jīng)損傷評(píng)分 按照LONGA法評(píng)分對(duì)小鼠神經(jīng)損傷評(píng)分,tMCAO組行為學(xué)得分3.40±0.24(n=8);tMCAO+NAD+組行為學(xué)得分2.10±0.33(n=8)

圖2 tMCAO組和tMCAO+NAD+組梗死體積 A:正常組小鼠腦切片;B:tMCAO組,著色淡;C:tMCAO+NAD+組,梗死組織明顯減少;D:數(shù)學(xué)模型計(jì)算出的2組的梗死體積;與tMCAO+NAD+組比較,*P<0.01

3.尼氏小體：結(jié)果發(fā)現(xiàn)，tMCAO小鼠梗死核心區(qū)尼氏小體急劇減少(圖2B，2b)，在其半暗帶區(qū)，尼氏小體數(shù)量較正常組顯著減少(如圖2D，2d)，表明蛋白合成能力下降，意味著神經(jīng)細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷。

圖3 正常組、tMCAO組和tMCAO+NAD+組單位體積內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量 A:正常組小鼠腦切片神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量(HE染色×40倍);tMCAO組單位體積內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少(HE染色×40倍);tMCAO+NAD+組單位體積內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較tMCAO組明顯增加(HE染色×40倍);B:數(shù)學(xué)模型計(jì)算出的三組的神經(jīng)細(xì)胞存活數(shù)量;與tMCAO組比較,*P<0.01

我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)給藥NAD+，梗死核心區(qū)細(xì)胞數(shù)高于tMCAO模型組，低于正常組(圖2C，2c)，在半暗帶區(qū)尼氏小體細(xì)胞數(shù)高于tMCAO組，低于正常組(圖2E，2e)；結(jié)果提示，缺血再灌注損傷對(duì)神經(jīng)細(xì)胞蛋白合成功能有嚴(yán)重影響，NAD+對(duì)蛋白功能損傷有保護(hù)效果。

圖4 正常組、tMCAO組和tMCAO+NAD+組尼氏小體數(shù)目 A,B,C,D,E為5X物鏡,a,b,c,d,e為20X物鏡。A,a為正常組,尼氏小體豐富;B,b為tMCAO組缺血核心區(qū),尼氏小體急劇減少;C,c為tMCAO+NAD+組缺血核心區(qū),尼氏小體數(shù)目上調(diào);D,d為tMCAO組半暗帶區(qū)域,靠近缺血測(cè)尼氏小體數(shù)目減少;E,e為tMCAO+NAD+組半暗帶區(qū)域,尼氏小體數(shù)目較tCMAO組回調(diào)

3　討　論

NAD+不僅是經(jīng)典的能量代謝調(diào)控分子[10-11]，而且還參與介導(dǎo)細(xì)胞死亡和其他多種生物學(xué)過程，由于 NADH/NAD+是細(xì)胞還原勢(shì)能的標(biāo)識(shí)，因此它在細(xì)胞許多氧化還原反應(yīng)中扮演重要的作用[12]。有研究提示NAD+對(duì)腦卒中后的腦損傷具有保護(hù)作用，也研究證明NAD+能夠減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡[13-14]。有關(guān)腦缺血的動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)在暫時(shí)性局部腦缺血的動(dòng)物模型中通過鼻腔給予NAD+能顯著減少缺血性腦損傷：在缺血開始2 h后給予NAD+能有效減小水腫形成，并且可以抑制腦缺血誘導(dǎo)的皮質(zhì)和海馬細(xì)胞自噬作用，從而可以減輕缺血性腦損傷[15]。同時(shí)也有研究表明NAD+能減少由于DNA烷化試劑、軸突損傷、OGD和鋅離子等刺激導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞死亡[14]。

本研究重點(diǎn)探討NAD+對(duì)成年雄性小鼠發(fā)生腦缺血再灌注后的腦保護(hù)作用。

通過選取易于麻醉和控制、腦血管解剖和生理機(jī)能和人類相似、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好的小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，建立小鼠短暫性局灶性腦缺血再灌注模型來探討腦血管疾病的發(fā)病早期內(nèi)NAD+對(duì)腦組織的保護(hù)作用。tMCAO模型有不開顱、準(zhǔn)確控制缺血和再灌注時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，目前普遍認(rèn)為是短暫性局灶性腦缺血再灌注模型的標(biāo)準(zhǔn)模型。

為了探討NAD+對(duì)tMCAO小鼠模型的腦保護(hù)作用，本研究采用觀察神經(jīng)損傷行為學(xué)評(píng)分、腦組織梗死體積、單位體積腦組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量、尼氏染色后尼氏小體數(shù)量等評(píng)估不同處理小鼠的腦損傷程度。

本實(shí)驗(yàn)建立小鼠tMCAO模型，觀察到缺血性腦卒中發(fā)生早期(48 h)，與正常組比較，tMCAO組小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)缺損癥狀，同時(shí)腦組織出現(xiàn)嚴(yán)重病理變化，腦梗死體積增大，單位體積腦組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，尼氏小體減少；tMCAO+NAD+組與tMCAO組比較，小鼠神經(jīng)功能缺損程度明顯減輕，梗死體積減小，單位體積腦組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多，尼氏小體較多。這與其他關(guān)于NAD+腦保護(hù)作用的研究結(jié)果[15]基本一致，也再次證明了NAD+對(duì)缺血性腦損傷有保護(hù)作用。

腦缺血過程是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，它會(huì)導(dǎo)致腦內(nèi)發(fā)生多種變化，如氧化應(yīng)激的產(chǎn)生、能量的耗竭、離子流的平衡被打破等。通?；钚匝?ROS)和自由離子的不平衡導(dǎo)致的氧化應(yīng)激被認(rèn)為是導(dǎo)致缺血性腦損傷的主要因素之一。在腦缺血再灌注過程中 ROS可通過多個(gè)途徑產(chǎn)生。NAD+不僅是經(jīng)典的能量代謝調(diào)控分子[10-11]，還參與介導(dǎo)細(xì)胞死亡和其他多種生物學(xué)過程。研究表明細(xì)胞內(nèi)NAD+的剝奪可以介導(dǎo) RARP-1 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，NAD+的水平也影響細(xì)胞抗氧化能力和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。由于 NADH/NAD+是細(xì)胞還原勢(shì)能的標(biāo)識(shí)，因此它在細(xì)胞許多氧化還原反應(yīng)中扮演重要的作用[12]。此外， NAD+可以通過丙酮酸脫氫酶來抑制 ROS 的產(chǎn)生。有研究證明NAD+能夠減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡[13-14]。

本研究結(jié)果證明了NAD+對(duì)缺血性腦損傷有保護(hù)作用。NAD+有可能成為治療缺血性腦卒中的一個(gè)新靶點(diǎn)。今后需在NAD+對(duì)缺血性腦損傷保護(hù)作用的具體機(jī)制研究方面進(jìn)一步深入。

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(2016-03-01收稿)

Treatment of NAD+protects transient middle cerebral artery occlusion in the mouse model of tMCAO

ChenXin,WeiZhenyu,YueDandan,etal.

DepartmentofNeurology,theThirdPeople'sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai201999

ObjectiveTo explore the effect of NAD+treatment for AIS in the mouse model of transient focal brain ischemia(tMCAO). MethodsAnimals was divided into control group, sham group, tMCAO group and tMCAO+NAD+group. tMCAO model was generated by nylon suture method. We built the tMCAO+NAD+group by the intra-peritoneal injection NAD+50 mg/kg immediately after reperfusion. The behaviour was quantified 48hours later. HE-staining was performed to compared pathological changes and infarct volumes by, meanwhile, nissl staining was used to detect the Nissl changes. ResultsCompare to the sham group, 48hours after ischemia, severe damages were determined in tMCAO group, including pathological changes, increasing infarct volumes, decreaseing of neurones and Nissl signals. compared to the the tMCAO group,the tMCAO+NAD+group had significant decreases of infarct volumes(P<0.01), less neurological deficits(P<0.05) and more neurones and the Nissl signals. ConclusionOur study indicated the protective effort of NAD+for brain after transient middle cerebral artery occlusion.

Reperfusion injuryNAD+Protection

寶山區(qū)科委基金(11-E-3)；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院基金(13×J10030)

201999上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科[陳昕魏珍玉岳丹丹潘杰吳丹紅(通信作者)]；上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腦病科(鐘萍)

R743

A

1007-0478(2016)05-0318-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2016.05.003