基于BMP/Runx2/Osx信號通路研究淫羊藿總黃酮改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型大鼠的作用機制

徐眾華 莫雨晴 周馳

摘 要 目的：基于骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）/Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）/成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（Osx）信號通路研究淫羊藿總黃酮對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松（PMOP）模型大鼠的影響，從而明確其防治骨質(zhì)疏松癥（OP）的作用機制。方法：將50只大鼠按體質(zhì)量分層法隨機分為假手術(shù)組，模型組，淫羊藿總黃酮低、高劑量組[265、530 mg/（kg·d）]和雌二醇組[0.09 mg/（kg·d）]，每組10只。除假手術(shù)組大鼠行假手術(shù)外，其余各組大鼠均采用卵巢摘除去勢法建立PMOP模型。大鼠造模成功并進行正常飼養(yǎng)2個月后開始灌胃給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥84 d;假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等量生理鹽水。末次給藥結(jié)束后，測定各組大鼠右側(cè)下肢股骨和椎骨的骨密度（BMD）以及股骨骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分離度（Tb.Sp）;采用酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠血清中鈣離子、骨鈣素、Ⅰ型原膠原N端前肽（P1NP）的水平;采用蘇木精-伊紅染色法觀察股骨的病理學變化;分別采用實時熒光定量-聚合酶鏈式反應法和Western blotting法檢測大鼠骨組織中BMP、Runx2、Osx的mRNA及蛋白的表達水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠股骨、椎骨BMD，血清中鈣離子、骨鈣素、P1NP水平，股骨Tb.N和Tb.Th以及股骨組織中 BMP、Runx2、Osx mRNA及蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01），股骨Tb.Sp顯著升高（P<0.01）;骨小梁組織結(jié)構(gòu)紊亂，斷裂明顯。與模型組比較，各給藥組大鼠上述指標均顯著改善（P<0.05或P<0.01），并且淫羊藿總黃酮的作用具有劑量依賴性（P<0.05）;骨小梁數(shù)目增多，排列整齊，結(jié)構(gòu)較為完整。結(jié)論：淫羊藿總黃酮改善OP的作用機制可能與促進BMP/Runx2/Osx信號通路活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞 淫羊藿總黃酮;骨質(zhì)疏松癥;骨形態(tài)發(fā)生蛋白;Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2;成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子;大鼠

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the effect of total flavonoids of Epimedium brevicornu on postmenopausal osteoporosis （PMOP） model rats based on BMP/Runx2/Osx signaling pathway so as to confirm the mechanism of preventing and treating osteoporosis （OP）. METHODS： By body mass stratification， 50 rats were randomly divided into sham operation group， model group， E. brevicornu total flavonoids low-dose and high-dose groups [265， 530 mg/（kg·d）]， estradiol group [0.09 mg/（kg·d）]， with 10 rats in each group. Except that sham operation group underwent sham operation， PMOP model was established by ovariectomy and castration in other groups. After modeling， they were given normal diet for 2 months and then given relevant medicine intragastrically for consecutive 84 d，once a day; rats in sham operation group and model group were given equal volume of normal saline. After last medication，bone mineral density （BMD） of femur and vertebrae of the right lower limb，the number of trabecular bone （Tb.N）， trabecular bone thickness （Tb.Th） and trabecular separation （Tb.Sp） of femur were determined in each group. The serum levels of Ca2+， OC and P1NP in serum were detected by ELISA. HE staining was used to observe pathological changes of femur. mRNA and protein expressions of BMP， Runx2 and OSX in bone tissue were detected by RT-PCR and Western blotting. RESULTS： Compared with sham operation group， BMD of femur and vertebrae， serum levels of Ca2 +， OC and P1NP， Tb.N and Tb.Th of femur， mRNA and protein expression of BMP， Runx2 and Osx in femur were decreased significantly in model group， while Tb.Sp of femur was increased significantly （P<0.01）; the structure of trabecular bone was disordered and the fracture was obvious. Compared with model group， above indexes of rats in administration groups were improved significantly （P<0.05 or P<0.01）， and the effect of E. brevicornu total flavonoids was dose-dependent （P<0.05）; the number of trabecular bone increased， arranged orderly and the structure was more complete. CONCLUSIONS： E. brevicornu total flavonoids can improve OP， the mechanism of which may be associated with promoting the activity of BMP/Runx2/Osx signaling pathway.

KEYWORDS ? Epimedium brevicornu total flavonoids; Osteoporosis; BMP; Runx2; OSX; Rats

骨質(zhì)疏松癥（OP）是以骨量低下、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，導致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。隨著我國人口的老齡化，OP患病率逐年增加，最新調(diào)查顯示，我國40歲以上人群的OP發(fā)病率高達24.62%[1]，其中絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（PMOP）占比最大[2]。目前，西醫(yī)治療OP的基礎(chǔ)用藥有鈣劑、維生素D以及雌激素等[2]，但長期使用副作用較多[3-4]。

中醫(yī)藥在防治OP上具有獨特優(yōu)勢，但其多成分、多靶點的作用機制復雜，尚未完全闡明。淫羊藿具有補腎、健骨等功效，臨床常用于治療腎虛、筋骨萎軟等癥[5]。現(xiàn)有研究已明確，淫羊藿抗OP的主要有效成分是以淫羊藿苷為代表的黃酮類化合物[6]，其中淫羊藿總黃酮可促進骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）的成骨性分化[7]，并具有促進骨形成和抑制骨吸收的雙重活性[8-9]，但其信號轉(zhuǎn)導機制尚未明確。

相關(guān)研究顯示，由骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（Osx）組成的BMP/RunX2/Osx信號通路與骨形成密切相關(guān)[10-12]，基于對淫羊藿的相關(guān)藥理機制的研究[13]，筆者推測淫羊藿總黃酮可能是通過BMP/Runx2/Osx通路防治OP。本研究通過建立PMOP大鼠模型，探索淫羊藿總黃酮對其骨組織學和BMP/Runx2/Osx信號通路的影響，從而明確淫羊藿總黃酮防治OP的作用機制。

1 材料

1.1 儀器

MK3型酶標儀（美國Bio-Rad公司）;ZF-208型凝膠成像系統(tǒng)（上海恒勤儀器設備有限公司）;PIDRed 96型聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;RM2245型冰凍切片機（北京世貿(mào)遠東科學儀器有限公司）;EG1150型包埋機、SM2000R石蠟滑動式切片機（德國Leica 公司）;BX-2型光學顯微鏡（日本Olympus公司）;Allegra X-15R型醫(yī)用離心機（美國Beckman公司）;Dexa Pro-1型雙能X射線骨密度儀（美國GE公司）;JS-Power300型電泳儀（上海迪奧生物科技有限公司）;SkyScan1272型超高分辨率microCT系統(tǒng)（比利時Bruker公司）。

1.2 藥品與試劑

淫羊藿總黃酮（江蘇康緣陽光藥業(yè)有限公司，批號：20198954，純度：>90%）;戊酸雌二醇片（廊坊高博京邦制藥有限公司，批號：20191125，規(guī)格：2 mg/片）;血清鈣離子、骨鈣素、Ⅰ型原膠原N端前肽（P1NP）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號：ZN2797349、ZN27840113、ZN27528941）;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠試劑盒（批號：ED2036r）、羊抗鼠BMP多克隆抗體（批號：jx-2350）、羊抗鼠Runx2多克隆抗體（批號：jx-2056）、羊抗鼠Osx多克隆抗體（批號：jx-2752）、羊抗鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（批號：jx-1379）、辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號：jx-1943）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（批號：ED2582r）、實時熒光定量-PCR試劑盒（批號：ED37945r）均購自廣州晶欣生物科技有限公司;蘇木精、伊紅染液（武漢科諾生物科技有限公司）;其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ迷噭疄檎麴s水。

1.3 動物

50只健康成年SD大鼠，SPF級，雌性，6月齡，體質(zhì)量為170～210 g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供[實驗動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（粵）2018-0034]。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±2） ℃、相對濕度為50%。本研究通過廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心倫理委員會批準。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

選取50只SD大鼠，適應性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量分層法隨機分為5組：假手術(shù)組，模型組，淫羊藿總黃酮低、高劑量組和雌二醇組，每組10只。除假手術(shù)組外，其余4組大鼠均采用卵巢摘除去勢法建立PMOP模型[14]，具體操作為：用10%水合氯醛將大鼠麻醉后，在其腰椎棘突旁開1 cm處，沿著皮膚和肌肉縱向剖離1.5 cm左右的深度，在脂肪團中找到雙側(cè)卵巢并切除雙側(cè)卵巢;假手術(shù)組大鼠采用同樣的手術(shù)操作暴露卵巢，但不摘除。術(shù)后腹腔注射青霉素（10萬單位/d），連續(xù)3 d。術(shù)后大鼠正常飼養(yǎng)，2個月后開始灌胃給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥84 d（12周）。其中，淫羊藿總黃酮低、高劑量組大鼠的給藥劑量分別為265、530 mg/（kg·d）[分別為成人（體質(zhì)量以50 kg計）臨床用量的1、2倍等效劑量]，雌二醇組大鼠的給藥劑量為0.09 mg/kg[15]，假手術(shù)組和模型組大鼠均灌胃等量生理鹽水，給藥體積均為1 mL/100 g。

2.2 大鼠股骨、椎骨骨密度（BMD）和股骨微結(jié)構(gòu)檢測

末次給藥結(jié)束后24 h，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，將其右股骨、椎骨部位置于雙能X線密度儀上檢測BMD。將各組大鼠完整的股骨置于microCT系統(tǒng)上進行掃描，掃描完成后，通過Evaluation V6.5.3軟件建模采集圖像并對股骨微結(jié)構(gòu)進行分析，采集骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分離度（Tb.Sp）等數(shù)據(jù)。

2.3 大鼠血清中鈣離子、骨鈣素、P1NP水平檢測

采用ELISA法進行檢測。末次給藥后1 h從大鼠的腹主動脈取血5 mL，放置1 h后，以3 000 r/min離心10 min，分離上層血清。分別按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測血清中鈣離子 、骨鈣素、P1NP水平。

2.4 大鼠股骨組織的病理學觀察

采用蘇木精-伊紅（HE）染色法進行觀察。取血后，將各組大鼠處死，取其左側(cè)股骨，以10%甲醛固定，再用20%EDTA脫鈣液進行脫鈣，然后進行脫水（60 min）;用二甲苯Ⅰ和Ⅱ進行透明（分別處理60 min），常規(guī)浸蠟、包埋后進行組織切片（4 ?m）。行HE染色后，在光學顯微鏡下觀察股骨的病理學變化。

2.5 大鼠骨組織中BMP、Runx2、Osx mRNA表達情況檢測

采用實時熒光定量-PCR法進行檢測。取大鼠右側(cè)股骨洗凈，取部分骨片（另一部分保存于-80 ℃）。采用Trizol法提取其總RNA，確定其純度和濃度后，將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系（共20 ?L）：SYBR熒光染料10 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA模板4 μL，無核酸酶水2 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min; 95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min ，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各目標基因mRNA的表達水平（式中Ct表示熒光信號強度達到設定閾值時經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)）。引物由武漢擎科生物公司設計并提供，其引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

2.6 大鼠骨組織中BMP、Runx2、Osx蛋白表達情況檢測

采用Western blotting法進行檢測。取冷凍保存的大鼠右股骨組織，每組隨機取3個樣本，用無菌眼科剪刀將其盡可能剪碎，置于研缽內(nèi)研磨，加入裂解液使其充分裂解。裂解完畢后，以12 000 r/min離心15 min，取上清液，用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經(jīng)變性后，取50 ?g進行SDS-PAGE電泳（140 V），然后在300 mA下轉(zhuǎn)膜1 h至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上;TBST緩沖液洗膜5 min×3次;將膜放入5%的脫脂奶粉中，室溫條件下封閉孵育2 h;將膜取出后，用TBST 緩沖液洗膜5 min×3次;分別加入BMP、Runx2和Osx一抗 （稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;加入二抗（稀釋度為 ? ? 1 ∶ 200），室溫孵育1h;以ECL試劑盒顯色后，置于凝膠成像系統(tǒng)上成像。采用Image J v1.5.1軟件進行分析，以目標蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目標蛋白的表達水平。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗;若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗進行組間比較。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 淫羊藿總黃酮對PMOP模型大鼠股骨、椎骨BMD的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠股骨、椎骨BMD顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，淫羊藿總黃酮低、高劑量組和雌二醇組大鼠股骨、椎骨BMD均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與淫羊藿總黃酮低劑量組比較，淫羊藿總黃酮高劑量組和雌二醇組大鼠股骨BMD顯著升高（P<0.05）;與雌二醇組比較，淫羊藿總黃酮高劑量組大鼠股骨、椎骨BMD差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠股骨、椎骨BMD測定結(jié)果見表2。

3.2 淫羊藿總黃酮對PMOP模型大鼠股骨微結(jié)構(gòu)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠股骨Tb.N、Tb.Th顯著降低（P<0.01），Tb.Sp顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，淫羊藿總黃酮低、高劑量組和雌二醇組大鼠股骨 ?Tb.N、Tb.Th顯著升高（P<0.05或P<0.01），Tb.Sp顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與淫羊藿總黃酮低劑量組比較，淫羊藿總黃酮高劑量組和雌二醇組大鼠股骨Tb.N、Tb.Th顯著升高（P<0.05），Tb.Sp顯著降低（P<0.05）;與雌二醇組比較，淫羊藿總黃酮高劑量組大鼠股骨Tb.N、Tb.Th顯著升高（P<0.05），Tb.Sp差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠股骨微結(jié)構(gòu)microCT掃描圖見圖1，Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp測定結(jié)果見表3。

3.3 淫羊藿總黃酮對PMOP模型大鼠血清中鈣離子、骨鈣素、P1NP水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中鈣離子、骨鈣素、P1NP水平顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，淫羊藿總黃酮低、高劑量組和雌二醇組大鼠血清中鈣離子、骨鈣素、P1NP水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與淫羊藿總黃酮低劑量組比較，淫羊藿總黃酮高劑量組和雌二醇組大鼠血清中鈣離子、骨鈣素、P1NP水平均顯著升高（P<0.05）;與雌二醇組比較，淫羊藿總黃酮高劑量組大鼠血清中P1NP水平顯著升高（P<0.05），血清中鈣離子、骨鈣素水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠血清中鈣離子、骨鈣素、P1NP水平測定結(jié)果見表4。

3.4 淫羊藿總黃酮對PMOP模型大鼠股骨組織病理學的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨小梁組織結(jié)構(gòu)紊亂，斷裂明顯，骨髓腔內(nèi)部空洞較多;與模型組比較，淫羊藿總黃酮低、高劑量組和雌二醇組大鼠骨小梁數(shù)目增多、排列整齊，結(jié)構(gòu)較為完整，其中以淫羊藿總黃酮高劑量組和雌二醇組改善較為明顯。各組大鼠股骨組織病理學觀察顯微圖見圖2。

3.5 淫羊藿總黃酮對PMOP大鼠骨組織中BMP、Runx2、Osx mRNA表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨組織中BMP、Runx2、Osx mRNA的表達水平顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，淫羊藿總黃酮低、高劑量組和雌二醇組大鼠骨組織BMP、Runx2、Osx mRNA表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與淫羊藿總黃酮低劑量組比較，淫羊藿總黃酮高劑量組和雌二醇組大鼠骨組織中BMP、Runx2、Osx mRNA表達水平均顯著升高（P<0.05）;與雌二醇組比較，淫羊藿總黃酮高劑量組大鼠骨組織中Runx2、Osx mRNA表達水平均顯著升高（P<0.05），但BMP mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠骨組織BMP、Runx2、Osx mRNA的表達水平測定結(jié)果見表5。

3.6 淫羊藿總黃酮對PMOP模型大鼠骨組織BMP、Runx2和Osx蛋白表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨組織中BMP、Runx2、Osx蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，淫羊藿總黃酮低、高劑量組和雌二醇組大鼠骨組織中BMP、Runx2、Osx蛋白表達水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與淫羊藿總黃酮低劑量組比較，淫羊藿總黃酮高劑量組和雌二醇組大鼠骨組織中BMP、Runx2、Osx蛋白的表達水平均上升（P<0.05）;與雌二醇組比較，淫羊藿總黃酮高劑量組骨組織中BMP、Runx2、Osx蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠骨組織中BMP、Runx2、Osx的蛋白表達電泳圖見圖3，蛋白表達水平測定結(jié)果見表6。

4 討論

中醫(yī)雖無OP的直接記載，但據(jù)OP的病因病機及臨床癥狀可知，其與中醫(yī)學的“骨痹”“骨痿”非常相似[16]。根據(jù)中醫(yī)“腎主骨”的理論，腎精盛衰是誘發(fā)OP的重要因素[17]，故中醫(yī)治療多以補腎益精為主。西醫(yī)治療OP的方式主要包括給予雌二醇等骨吸收抑制劑[2]，故本研究以其為陽性藥對照。淫羊藿總黃酮是補腎中藥淫羊藿中的一種有效成分，以其為主要成分的制劑（如淫羊藿總黃酮膠囊）在臨床上已用于OP的治療。雖然有研究表明，淫羊藿總黃酮可以促進BMSCs的表達以及骨愈合和骨吸收[18]，但是具體相關(guān)藥理機制尚未明確。

BMP/Runx2/Osx信號通路與骨形成密切相關(guān)，參與調(diào)控成骨細胞的分化[19-20]。BMPs屬于轉(zhuǎn)化生長因子 （TGF-β） 超家族，可誘導BMSCs向成軟骨細胞、成骨細胞等分化，促進成骨細胞功能。其中，BMP能通過與細胞膜表面的異二聚體受體特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)Runx2及其下游Osx基因的轉(zhuǎn)錄和表達[21]。作為特異性成骨細胞轉(zhuǎn)錄因子和成骨細胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Runx2通過結(jié)合成骨細胞特異性順式作用元件（OSE），激活骨橋素、骨鈣蛋白、骨涎蛋白和Ⅰ型膠原基因等多種成骨細胞增殖、分化特異性標志物的轉(zhuǎn)錄和表達，促進膜內(nèi)和軟骨內(nèi)骨化成骨[22]。而Osx屬于鋅指蛋白，是Runx2的下游關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控許多成骨細胞重要晚期表型和功能蛋白的表達，促進BMSCs的成骨轉(zhuǎn)化[23-26]。而在骨組織構(gòu)建過程中，骨質(zhì)的形成和吸收是同時發(fā)生的，骨構(gòu)建過程處于失衡狀態(tài)時，骨吸收顯著高于骨形成，進而導致OP[27]。有細胞試驗證實，BMP/Runx2/Osx信號通路參與了淫羊藿總黃酮促BMSCs定向成骨分化的進程，淫羊藿總黃酮能明顯上調(diào)BMP-2的轉(zhuǎn)錄和表達[10]。

本研究結(jié)果顯示，淫羊藿總黃酮可以升高PMOP模型大鼠股骨BMD、血清鈣離子，股骨Tb.N和Tb.Th，降低股骨Tb.Sp，增多且增寬骨小梁，上調(diào)骨組織中BMP、Runx2、Osx的mRNA及其蛋白的表達。以上結(jié)果提示，淫羊藿總黃酮可以通過對BMP/Runx2/Osx信號通路的調(diào)控，從而升高骨骼BMD，增加骨形成，減少鈣丟失以及改善骨小梁形態(tài)排列，從而降低或延緩OP的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，淫羊藿總黃酮可通過上調(diào)股骨中BMP、Runx2、Osx的mRNA和蛋白表達，增加BMD和骨小梁的數(shù)量，改善股骨微結(jié)構(gòu)，提高血清中鈣離子、骨鈣、P1NP的水平，從而修復骨構(gòu)建失衡，起到防治OP的作用。但由于中藥對機體或者細胞具有多途徑、多靶點作用的特點，BMP/Runx2/Osx信號通路未必是淫羊藿總黃酮防治OP的唯一途徑，此過程中還可能有其他信號轉(zhuǎn)導通路的參與，故其具體的分子機制仍需進一步深入研究。

參考文獻

[ 1 ] 張智海，張智若，劉忠厚，等.中國大陸地區(qū)以-2.0SD為診斷標準的骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率文獻回顧性研究[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2016，22（1）：1-8.

[ 2 ] 中華中醫(yī)藥學會.絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（骨痿）中醫(yī)藥診療指南：2019年版[J].中醫(yī)正骨，2020，32（2）：1-13.

[ 3 ] 吳繼云，陳偉南，蔣春華.仙靈骨葆膠囊對老年大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程 PDGF、TGF-β和VEGF表達的影響[J].貴州醫(yī)科大學學報，2019，11（ 5）：541-546.

[ 4 ] WAJANVISI W，SUPPACHOKMONGKORN S，WORA- TANAAT P，et al. The association of bone mineral density and G2014A polymorphism in the estrogen receptor alpha gene in osteoporotic hip fracture in Thai population[J]. J Med Assoc Thai，2015，98（ 8）：82-87.

[ 5 ] 陳克明.淫羊藿總黃酮的抗骨質(zhì)疏松作用機制[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（12）：5485-5489.

[ 6 ] MING LG，XIAN CJ，CHEN KM，et al. Function and action mechanism of flavoidsgenistein and icariin in regula- ting bone remodeling[J]. J Cell Physiol，2013，228（3）：513-521.

[ 7 ] 葸慧榮，馬慧萍，高玉海，等.淫羊藿苷是一種植物雌激素嗎？[J].中華骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病雜志，2016，9（4）：421-427.

[ 8 ] MA HP，MING LG，GE BF，et al. Icariin is more potent than genistein in promoting osteoblast differentiation and mineralization in vitro[J]. J Cellular Biochemistry，2015，112（3）：916-923.

[ 9 ] 孟寧，孔凱，李時翁，等.淫羊藿屬植物化學成分及藥理活性研究進展[J].西北植物學報，2010，30（5）：209-219.

[10] 梁廣勝，陳偉才，殷嫦嫦，等.淫羊藿總黃酮對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程BMP-2/RunX2/Osx通路的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，36（5）：614-618.

[11] 喬虎軍，王國祥，郝鑫，等.轉(zhuǎn)化生長因子β/Smad信號通路和骨關(guān)節(jié)炎研究進展[J].中國運動醫(yī)學雜志，2019，38（2）：143-151.

[12] 余翔，姜自偉，鄭曉輝，等.補腎中藥調(diào)控BMP-Smad信號通路促進牽張成骨的研究進展[J].遼寧中醫(yī)雜志，2017，44（9）：1991-1994.

[13] 王宥涵，孔令擘，賀寶榮.淫羊藿苷調(diào)控破骨細胞分化治療骨質(zhì)疏松癥的機制研究進展[J].中華創(chuàng)傷雜志，2020，36（4）：377-382.

[14] 巢傳琦，蔡君，呂俊華.補骨方對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的防治作用研究[J].中藥材，2015，38（4）：807-809.

[15] 顏春魯，王琳，安方玉，等.地黃飲子水煎劑對去勢骨質(zhì)疏松大鼠生物力學及OPG/RANKL/RANK含量的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（10）：4642-4645.

[16] 譚英華，楊茂偉.補脾益腎方藥治療老年性骨質(zhì)疏松癥30例[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育，2016，14（3）：85-86.

[17] LIU T，GAO Y，SAKAMOTO K，et al. BMP-2 promotes differentiation of osteoblasts and chondroblasts in Runx2-deficient cell lines[J]. J Cell Physiol，2007，211（3）：728-735.

[18] 李燁，童杰，周衍晶，等.補腎壯骨中藥抗骨質(zhì)疏松有效成分及其藥理作用研究進展[J].中國中藥雜志，2015，40（6）：1038-1043.

[19] 任格，聶利，楊霞，等. Smad信號通路在骨形成蛋白9 促進牙囊干細胞成骨向分化中的研究[J].第三軍醫(yī)大學學報，2018，40（12）：1066-1072.

[20] 吉彩霞，劉曉驊，徐麗，等. Runx1促進BMP9誘導的間充質(zhì)干細胞MEFs的成骨分化[J].中國生物工程雜志，2017，37（3）：10-17.

[21] 徐練，孔清泉.調(diào)控成骨細胞分化及骨形成關(guān)鍵信號通路的研究進展[J].中國修復重建外科雜志，2014，28（12）：1484-1489.

[22] 高璐.補腎復方對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠BMP2/RUNX2/ MEK1相關(guān)信號網(wǎng)絡的調(diào)控作用[D].沈陽：遼寧中醫(yī)藥大學，2014.

[23] NEUSS S，SCHNEIDER RK，TIETZE L，et al. Secretion of fibrinolytic enzymes facilitates human mesenchymal stem cell invasion into fibrin clots[J]. Cells Tissues Organs，2010，191（1）：36-46.

[24] LIU H，XUE W，GE G，et al. Hypoxic preconditioning advances CXCR4 and CXCR7 expression by activating HIF-1α in MSCs[J]. Biochem Biophys Res Commun，2010，401（4）：509-515.

[25] 訾慧，鄭洪新，蔣寧，等.淫羊藿素通過BMP/Runx2/Osx信號通路促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化研究[J].中華中醫(yī)藥學刊，2020，38（7）：212-215、270.

[26] NAKASHIMA K，DE CROMBRUGGHE B. Transcriptional mechanisms inosteoblast differentiation and bone formation[J]. Trends Genet，2003，19（8）：458-466.

[27] 嚴偉，王中漢，劉賀.骨重建失衡導致骨質(zhì)疏松發(fā)生的作用機制及其藥物治療策略[J].中國組織工程研究，2020，24（30）：4866-4874.

（收稿日期：2020-07-29 修回日期：2020-08-30）

（編輯：林 靜）