基于網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術探討沙棘治療阿爾茨海默病的作用機制

湯威威 趙宏 孔令洲 高琪 焦瑩瑩 張宇 吳麗麗 沈宇 王宇亮

摘 要 目的：揭示沙棘治療阿爾茨海默?。ˋD）的作用機制，為進一步探究沙棘治療AD的藥效物質基礎提供理論參考。方法：通過TCMSP、Uniprot、GeneCards等數(shù)據(jù)庫篩選沙棘活性成分、靶點及AD相關靶點基因;采用Cytoscope 3.7.1軟件構建化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡圖;通過STRING數(shù)據(jù)庫制作靶點相互作用（PPI）網(wǎng)絡，篩選度值較高的沙棘治療AD的潛在靶點與沙棘活性成分進行分子對接;采用Clue GO插件對沙棘治療AD的潛在靶點進行GO基因本體（GO）分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。取50只小鼠隨機分為空白組、模型組[D-半乳糖120 mg/（kg·d）及AlCl3溶液20 mg/（mL·d）]、陽性藥物組[奧拉西坦260 mg/（kg·d）]、沙棘果油提取物組[1.6 g/（kg·d）]、沙棘多酚提取物組[1.6 g/（kg·d）]，每組10只。各組小鼠分別灌胃相應藥物的同時灌胃造模劑，空白組灌胃等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥60 d。通過Morris水迷宮實驗測定各組小鼠學習記憶能力，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測小鼠海馬體組織免疫因子水平，采用蘇木素-伊紅染色（HE）法觀察海馬體的病理學變化，對沙棘治療AD的作用機制進行初步驗證。結果：沙棘22個活性成分（槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-胡蘿卜素、β-谷固醇等）可能通過調控絲氨酸/蘇氨酸激酶編碼蛋白（AKT1）、氨基端激酶 （JUN）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK1）等147個靶點影響核受體活性、脂多糖介導的信號通路等生物過程及白細胞介素17（IL-17）信號傳導途徑、腫瘤壞死因子（TNF）信號傳導途徑等114條代謝通路。分子對接結果顯示，沙棘主要活性成分與主要靶點蛋白結合分值均在4.25以上，具有較好的結合活性。藥理學實驗結果顯示，沙棘提取物能夠使AD模型小鼠的逃避潛伏期縮短、穿越平臺次數(shù)增加，減輕其腦海馬體組織損傷，降低其腦海馬體組織中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17含量。結論：沙棘的活性成分可調控AD發(fā)病重要通路中的多個靶點;動物實驗初步驗證其可通過抑制炎癥因子的表達，來減輕AD模型小鼠海馬體損傷，改善小鼠學習記憶能力。

關鍵詞 沙棘;阿爾茨海默病;網(wǎng)絡藥理學;分子對接

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To explore the mechanism of Hippophae rhamnoides in the treatment of Alzheimers disease （AD）， and to provide theoretic reference for further exploring the material basis. METHODS： TCMSP， Uniprot， GeneCards database were used to screen the active components of H. rhamnoides， targets and AD-related target gene. The “ingredients-targets-related diseases” network was constructed by Cytoscape 3.7.1 software. STRING database was adopted to construct protein interaction （PPI） network， molecular docking was conducted between the potential targets with high degree values and active components of H. rhamnoides. The gene ontology （GO） analysis and Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） pathway enrichment analysis were performed by Clue GO for the potential target of H. rhamnoides in the treatment of AD. Totally 50 mice were randomly divided into blank group， model group [D-galactose 120 mg/（kg·d）， AlCl3 solution 20 mg/（mL·d）]， positive ? ? ? ? ?drug group [oxiracetam 260 mg/（kg·d）]， seabuckthorn oil extract group [1.6 g/（kg·d）]， seabuckthorn polyphenols group ? ? ? ?[1.6 g/（kg·d）]， with 10 mice in each group. ?The mice was given relevant medicine intragastrically and modeling agent; blank group was given constant volume of distilled water intragastrically， once a day， for consecutive 60 d. The learning and memory abilities were detected by Morris water maze test; the levels of immune factors in hippocampus tissue were measured by ELISA. Pathological morphology of hippocampus tissue was observed by HE staining. The mechanism of H. rhamnoides in the treatment of AD was validated preliminarily. RESULTS： Totally 22 active components of H. rhamnoides （quercetin， kaempferol， isorhamnetin， β-carotene， β-sitosterol） may affect biological processes such as nuclear receptor activity， lipopolysaccharide-mediated signal pathway， and may affect 114 methabolism pathways such as IL-17 signal transduction pathway， TNF signal transduction pathway by regulating 147 targets such as serine/threonine kinase coding protein （AKT1）， amino terminal kinase （JUN） and mitogen activated protein kinase （MAPK1）. The results of molecular docking showed that binding scores of the main active components of H. rhamnoides and the main target proteins were all above 4.25， which showed good binding activity. Results of pharmacology experiment showed that H. rhamnoides extract could shorten the escape latency of AD model mice， increased the times of crossing platform， relieved hippocampus injury of cerebral tissue， and decreased the contents of inflammatory factors TNF-α， IL-1β， IL-6 and IL-17 in hippocampus of cerebral tissue. CONCLUSIONS： The active components of H. rhamnoides can regulate multiple targets in the important pathway of AD; animal experiments preliminarily verify that H. rhamnoides can relieve the hippocampus injury and improve the learning and memory ability of AD model mice by inhibiting the expression of inflammatory factors.

KEYWORDS ? Hippophae rhamnoides; Alzheimers disease; Network pharmacology; Molecular ?docking

阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一種嚴重威脅老年人生命健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。目前，全世界約有5 000萬人患有AD，且患病人數(shù)逐年上升，預計到2050年AD患病人數(shù)會增加3倍以上[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)認為，AD歸屬于中醫(yī)“呆病”“神呆”“善忘”的范疇，其病機涉及脾胃虛弱、氣血虛衰、痰瘀交阻、氣血凝滯等[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，AD發(fā)病機制與氧化應激、膽堿能損傷、神經(jīng)炎癥等相關[3-5]。目前，治療AD的藥物主要為膽堿酯酶抑制劑，如多奈哌齊、美金剛等單一靶點藥物，治療效果不顯著，因此尋找高效低毒、便于長期服用、有效延緩或治愈AD的新型藥物已成為研究者的首要目標[6]。

傳統(tǒng)中藥及其提取物具有安全、不良反應少等特點，已被用于治療AD新藥的研發(fā)，并顯示出良好的效果[7]。沙棘是胡頹子科植物沙棘Hippophae rhamnoides L.的干燥成熟果實，味酸、澀，性溫，歸脾、胃、肺、心經(jīng)，常用于脾虛食少、咳嗽痰多、瘀血經(jīng)閉、跌撲瘀腫的治療[8]。據(jù)《民族藥成方制劑》記載，沙棘的成方制劑吉祥安神丸具有補氣安神作用;《蒙醫(yī)金匱》中記載有沙棘十七味散，主治胃、腎、肝等臟腑之瘀血癥，與中醫(yī)治療AD患者時使用增補氣血、化瘀血、充盈腦髓的藥物相符[9]。本課題組前期研究表明，沙棘中含有多酚、油脂等活性成分，具有抗氧化、抗AD等作用[10]。因此，沙棘抗AD的作用，可能與其補氣健脾、化痰祛濁、活血化瘀的藥效相關[11-13]。

網(wǎng)絡藥理學是利用計算機科學、分子生物學、藥學等學科的成果，對傳統(tǒng)中藥成分的潛在靶點、藥理作用進行多基因、多靶點、多途徑的系統(tǒng)研究，可為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供新的思路[14]。分子對接則是通過受體特征及受體與藥物分子之間的相互作用方式來預測其結合模式和親合力的一種理論模擬方法[15]。本文采用網(wǎng)絡藥理學結合分子對接法對沙棘治療AD的分子機制進行研究，闡明沙棘活性成分治療AD的藥理作用機制并進行初步的藥理學實驗驗證，為沙棘在治療AD方面的應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

FA2004型電子分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）;Morris 水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）;FC型酶標儀[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司];XH-C型漩渦混合器（無錫萊浦儀器設備有限公司）;JJ-12J型脫水機、JB-L7型包埋機（武漢俊杰電子有限公司）;RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）;XSP-13C-LP型顯微鏡（上海精密儀器儀表有限公司）。

1.2 藥品與試劑

氯化鋁（AlCl3，天津市凱通化學試劑有限公司，批號：170814，分析純）;D-半乳糖（北京化學試劑公司，批號：1711016，分析純）;奧拉西坦膠囊（石藥集團歐意藥業(yè)有限公司，批號：485180416，規(guī)格：0.4 g/粒） ;腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒（批號：2018011）、白細胞介素 ? 1β（IL-1β）試劑盒（批號：2011104）、IL-6試劑盒（批號：2018031）、IL-10試劑盒（批號：2017125）均購自碧云天生物科技公司。

沙棘購于佳木斯民生藥行（批號：180312），經(jīng)佳木斯大學藥學院張宇教授鑒定為胡頹子科植物沙棘H. rhamnoides L.的干燥果實，經(jīng)石油醚回流提取，經(jīng)高溫水化法脫膠、高溫淡堿法脫酸、活性白土脫色精制后，得沙棘果油提取物。沙棘用71%乙醇提取，得沙棘多酚提取物（多酚含量：56.25%）。以上提取物由佳木斯大學藥學院藥物化學實驗室提供并測定。

1.3 動物

清潔級KM小鼠60只，6周齡，體質量18 g～22 g，購自哈爾濱醫(yī)科大學，動物使用許可證號：SYXK（黑）2014-003。小鼠飼養(yǎng)于SPF 級動物實驗室。

2 方法

2.1 沙棘活性成分與相應靶點基因收集與篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中，以“沙棘”為關鍵詞，以類藥性（DL）≥0.18、口服生物利用度（OB）≥30%為條件對化學成分進行篩選，獲取沙棘活性成分及對應靶點信息，然后在 ?UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）獲取靶點對應基因名，并下載活性成分的三維結構文件，得到沙棘的主要活性成分[16]。

2.2 沙棘活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡構建

以“Alzheimers disease”為關鍵詞，通過人類基因平臺（GeneCards）數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）獲取AD的相關靶點，使用R語言中Venny程序映射活性成分、預測靶點和疾病相關靶點，獲得沙棘與AD的交集靶點，即為沙棘治療AD的潛在靶點。將“2.1”項下獲得的沙棘活性成分與沙棘治療AD的潛在靶點，導入生物信息分析軟件Cytoscape 3.7.1，構建沙棘活性成分-AD靶點網(wǎng)絡。網(wǎng)絡中的節(jié)點（Node）表示靶點或化合物，邊（Edge）表示活性成分與疾病之間相互作用。復雜網(wǎng)絡節(jié)點中心性可用于衡量節(jié)點在網(wǎng)絡中影響能力大小，以判斷節(jié)點的重要性。其中，度值為重要參數(shù)，度值越高代表該成分或靶點在網(wǎng)絡中的位置越重要。

2.3 沙棘治療AD靶點相互作用網(wǎng)絡構建

將“2.2”項下映射后的沙棘治療AD的潛在靶點導入蛋白質相互作用（STRING）數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），將最低相互作用閾值調整為“中置信度（Medium confidence）”，其值為0.400，其余參數(shù)選擇默認設置，獲得靶點的相互作用關系數(shù)據(jù)，導入Cytoscape 3.7.1軟件中以“Network analyzer”插件制作靶點相互作用（PPI）網(wǎng)絡[17]。選擇度值排名靠前的沙棘治療AD的潛在靶點作為關鍵靶點進行分子對接。

2.4 分子對接

篩選“2.3”項下的關鍵靶點與“2.1”項下的沙棘活性成分，導入SYBYL-X 2.1軟件（https：//en.freedownloadmanager.org/Windows-PC/SYBYL-X.html）中進行分析、預測，評價沙棘活性成分與關鍵靶點之間的結合活性，并以分值來評價其結合活性：分值>4.25表示兩者有一定的結合活性，分值>5.0表明有較強的結合活性，分值>7.0表明具有很強的結合活性[18]。

2.5 GO分析與KEGG通路富集分析

將“2.2”項下沙棘治療AD的潛在靶點導入Cytoscape 3.7.1軟件，使用“Clue GO”插件進行基因本體（Gene ontology，GO）分析、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and gnomes，KEGG）通路富集分析。以P<0.05表示信號通路為顯著富集。

2.6 動物實驗

2.6.1 分組、造模及給藥 選取50只小鼠隨機分為空白組、模型組[皮下注射5% D-半乳糖溶液，120 mg/（kg·d）;灌胃AlCl3溶液，20 mg/（mL·d）]、陽性藥物組[奧拉西坦，260 mg/（kg·d）]、沙棘果油提取物組[按2015年版《中國藥典》[8]人用劑量折算為小鼠等效劑量，即相當于生藥量1.6 g/（kg·d）;下同]、沙棘多酚提取物組[相當于生藥量1.6 g/（kg·d）]，每組10只。各組小鼠分別灌胃，給予相應藥物的同時給予造模劑，空白組給予等體積的蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥治療60 d。

2.6.2 各組小鼠學習記憶能力檢測 采用Morris水迷宮實驗檢測。（1）定位航行實驗：給藥結束后，以小鼠面向池壁放入水中至找到平臺時間為逃避潛伏期。實驗時間設置為120 s，若超時未找到平臺，則引導小鼠至平臺停留片刻，將其逃避潛伏期計為120 s。實驗進行5 d，每天訓練1次，于第5天記錄小鼠逃避潛伏期。（2）空間探索實驗：于水迷宮定位航行實驗第6天撤去水池中的平臺，將小鼠面向池壁放入無平臺的水池中自由游泳。實驗時間設置為120 s，記錄120 s內小鼠穿越原來平臺位置的次數(shù)[19]。

2.6.3 各組小鼠血清中免疫因子檢測和海馬體組織病理學變化觀察 采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法和蘇木精-伊紅（HE）染色檢測。水迷宮實驗結束后，各組小鼠禁食、自由飲水24 h。然后將小鼠脫頸處死后，于冰臺上迅速剝離大腦并取出海馬體。取海馬體的一半，制成10%海馬組織勻漿液，4 ℃下以1 000 r/min離心10 min，取上清液于4 ℃下保存，嚴格按試劑盒說明書測定海馬組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的水平。另一半海馬體用4%多聚甲醛固定，采用HE法染色，于100倍顯微鏡下進行圖像采集分析，觀察其病理結構[20]。

2.6.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 沙棘活性成分與其作用靶點

經(jīng)DL≥0.18、OB≥30%條件篩選，獲得沙棘活性成分33個，刪除無對應靶點信息的活性成分后得到22個活性成分，主要包括多酚及油脂類成分，例如槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-胡蘿卜素、β-谷固醇等，結果詳見表1。22個活性成分共對應423個作用靶點，刪除重復靶點后剩余213個作用靶點，包括AKT1、JUN、MAPK8、MAPK14等。

3.2 沙棘活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡

由GeneCards數(shù)據(jù)庫得到8 731個AD相關基因，經(jīng)R語言Venny映射，得到147個沙棘治療AD的潛在靶點。建立的沙棘活性成分-AD靶點網(wǎng)絡圖中共包括171個節(jié)點及450條邊，其中槲皮素、山柰酚、β-胡蘿卜素、異鼠李素、β-谷甾醇、豆甾醇的度值較高，為主要活性成分，結果詳見圖1（圖中，一個活性成分可對應多個靶點，如槲皮素對應IL-6、IL-1β、JUN等;一個靶點也可與多個活性成分相對應，如JUN對應槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等）。

3.3 PPI網(wǎng)絡

采用Cytoscape 3.7.1軟件構建的沙棘治療AD靶點PPI網(wǎng)絡圖共包括129個節(jié)點及514條邊，圖中度值越大則節(jié)點顏色越深。度值排名靠前的靶點有AKT1、JUN、MAPK1、轉錄因子p65 （RELA）、IL-6、MAPK8、MAPK14、表皮生長因子受體（EGFR）、c-fos原癌基因蛋白（FOS），結果詳見圖2。

3.4 分子對接結果

分子對接結果顯示，沙棘主要活性成分與主要靶點蛋白的結合分值均在4.25以上，部分分值超過5.0、接近7.0;β-胡蘿卜素對接JUN、MAPK1的分值甚至超過了7.0，表明其具有很強的結合活性，結果詳見表2。

3.5 GO分析和KEGG代謝通路富集分析結果

將147個沙棘治療AD的潛在靶點進行GO富集分析，主要包括分子功能、細胞組成和生物過程3個部分。結果，上述靶點的分子功能集中于激活轉錄因子結合、抑制轉錄因子結合等;其細胞組成與小窩等相關性較大;主要參與了細胞對活性氧的反應、核受體活性、脂多糖介導的信號通路、神經(jīng)遞質的生物合成過程等生物過程，結果詳見圖3。

在KEGG代謝通路富集分析中，共富集到114條相關代謝通路（P<0.05），包括Toll樣受體（TLRs）信號通路、IL-17信號傳導途徑、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路等，結果詳見圖4。

3.6 動物實驗結果

3.6.1 Morris水迷宮實驗結果 與空白組比較，模型組小鼠逃避潛伏期顯著延長（P<0.01），穿越平臺次數(shù)顯著減少（P<0.05），表明模型組小鼠出現(xiàn)學習記憶障礙，造模成功;與模型組比較，陽性藥物組、沙棘果油提取物組和沙棘多酚提取物組小鼠逃避潛伏期顯著縮短（P<0.05或P<0.01），穿越平臺次數(shù)顯著增加（P<0.05或P<0.01），結果詳見表3。

3.6.2 大鼠海馬體病理學觀察結果 空白組小鼠海馬體細胞排列整齊、緊密，細胞層次較多、結構清楚，細胞核形態(tài)完整、染色正常;模型組小鼠海馬體細胞分布較稀疏、排列較散亂，出現(xiàn)大面積細胞壞死，有大量空泡，細胞核著色較深;與模型組比較，各給藥組小鼠海馬體細胞排列整齊、緊密，細胞層次增多，局部有少量細胞核染色加深，未出現(xiàn)空泡，細胞整體狀態(tài)較好，結果詳見圖5。

3.6.3 小鼠海馬體組織中免疫因子檢測結果 與空白組比較，模型組小鼠海馬體組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17水平顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，陽性藥物組、沙棘果油提取物組及沙棘多酚提取物組上述水平含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），結果見表4。

4 討論

在傳統(tǒng)中醫(yī)治療中，對癡呆病癥的認識相對較早，但是缺乏系統(tǒng)性的診斷標準[21]。中藥網(wǎng)絡藥理學是融合系統(tǒng)生物學、生物信息學、計算機網(wǎng)絡分析技術、蛋白組學等多個領域的新興學科，可通過計算機構建網(wǎng)絡模型對中藥的整體作用進行分析，為中藥的有效性和科學性提供理論科學基礎，同時一步闡釋中藥多靶點協(xié)同作用的特點[22]。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學對沙棘抗AD的作用機制進行探討，發(fā)現(xiàn)沙棘抗AD共有22個活性成分，包括槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-谷甾醇、豆甾醇、β-胡蘿卜素等。清代陳士鐸在《辨證錄》中指出：“治呆無奇法，治痰即治呆”，在中醫(yī)治療中考慮對AD患者化痰祛濁的治療[23]。李學堅等[24]研究發(fā)現(xiàn)，芒果苷有抗炎和祛痰作用，槲皮素有抗炎作用但無祛痰作用，但兩藥在祛痰實驗中有明顯的協(xié)同效應，槲皮素能明顯提高芒果苷的祛痰藥效。因此，沙棘在治療AD過程中，其活性成分槲皮素或可與其他成分相互作用而發(fā)揮化痰祛濁的作用。AD患者多由于年老體虛、肝血不足、血虛精少導致脾胃虛弱、氣血虛衰，因而在AD的臨床治療中應當注意對患者氣血的補充。邊亞倩等[25]基于系統(tǒng)中藥學的黃芪補氣潛在功效標志物的研究，發(fā)現(xiàn)異鼠李素可通過改善物質代謝、調節(jié)機體免疫等方面發(fā)揮補氣功效。因此，沙棘在治療AD過程中，其活性成分異鼠李素可能發(fā)揮補氣健脾作用?？梢?，對于瘀血內阻而氣血精微不能上榮于元神者，治宜活血化瘀、醒腦開竅。趙文竹[26]在對玉米須功能因子活性評價及其降血糖機制研究中發(fā)現(xiàn)，甾醇類化合物具有抗凝血作用。因此，沙棘在治療AD過程中，其活性成分豆甾醇或將發(fā)揮活血化瘀作用。

本研究對沙棘活性成分作用靶點與AD 疾病靶點進行了交集分析，共發(fā)現(xiàn)147個關鍵靶點，這147個靶點可能是沙棘治療AD的靶點。結合PPI網(wǎng)絡與分子對接結果發(fā)現(xiàn)，AKT1、JUN、MAPK1、RELA、IL-6、MAPK8、MAPK14、EGFR、FOS是網(wǎng)絡的關鍵靶點，且與沙棘活性成分具有較好的結合活性。其中，AKT1作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶編碼蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中是一個關鍵的調控因子，用于神經(jīng)細胞調節(jié)，而AKT1的氧化修飾可導致突觸功能障礙，導致AD患者產(chǎn)生認知功能障礙[27]。MAPK可傳導細胞膜受體信號到細胞核，參與調節(jié)神經(jīng)元增殖、凋亡等，其與學習記憶能力聯(lián)系緊密，可調控與AD密切相關的病理機制如神經(jīng)毒性、神經(jīng)炎癥和突觸功能障礙等[28]。因此，以上靶點可能在沙棘治療AD中發(fā)揮重要作用。

GO富集分析結果顯示，從分子功能富集結果來看，沙棘治療AD主要體現(xiàn)為激活轉錄因子結合;從細胞組成富集結果來看，沙棘治療AD主要體現(xiàn)在小窩;從生物過程富集結果來看，沙棘治療AD主要體現(xiàn)為細胞對活性氧的反應、核受體活性、脂多糖介導的信號通路。這提示沙棘治療AD呈現(xiàn)多成分、多靶點、多途徑的作用特點。

KEGG代謝通路富集結果顯示，沙棘治療AD涉及的信號通路包括TLRs信號通路、IL-17信號轉導途徑、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路等。TLRs是天然免疫受體，TLRs家族中的TLR4信號轉導通路可通過髓樣分化因子88的激活和相應的下游效應因子，使核因子κB（NF- ? κB）的抑制因子IκB磷酸化，從而活化NF-κB，啟動相應的基因轉錄[29]。NF-κB是最重要的轉錄因子之一，具有多向性轉錄激活功能，可參與炎癥反應、免疫反應、細胞凋亡等多種生理病理過程[30]。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白家族可通過Trk酪氨酸激酶受體結合發(fā)揮作用。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白/Trk信號通路通過連接多種細胞內信號轉導調節(jié)，對于神經(jīng)發(fā)育、學習記憶起著重要作用[31]。因此，推測沙棘活性成分可通過抑制TLRs家族中TLR4信號的轉導，減少NF-κB信號通路下游的炎性因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α）等的分泌;同時還可抑制IL-17信號轉導途徑，降低IL-17含量;激活神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路，增加神經(jīng)營養(yǎng)蛋白因子含量，發(fā)揮抗AD作用。結合分子對接和KEGG代謝通路富集分析結果發(fā)現(xiàn)，沙棘治療AD是通過炎癥相關通路及炎癥因子發(fā)揮著重要作用，因此后續(xù)需通過體內藥理實驗對炎癥相關通路進行驗證。

本研究通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，沙棘提取物對AlCl3聯(lián)合D-gal所致AD模型小鼠有積極影響：在水迷宮試驗中，沙棘提取物能夠使模型小鼠的逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加，提高其學習記憶能力;組織病理學觀察結果顯示，沙棘提取物能使模型小鼠的腦海馬體組織損傷減輕;機制研究顯示，沙棘提取物能夠降低模型小鼠腦海馬體組織中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17含量，該結果與網(wǎng)絡藥理學分析結果一致。

綜上所述，本研究初步預測了沙棘治療AD的活性成分、靶點以及信號通路，其中活性成分可調控多個靶點，關鍵靶點同時參與多個重要信號通路的調控，體現(xiàn)出沙棘多靶點、多通路協(xié)同作用的特點;同時，通過動物實驗初步驗證了沙棘可通過抑制炎癥因子的表達，來減輕AD模型小鼠海馬體損傷，改善小鼠學習記憶能力。本課題組將以此結果為理論基礎，對沙棘的活性成分及治療AD的藥理機制進行深入研究，為沙棘治療AD機制的進一步研究及其相關產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

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（收稿日期：2020-04-13 修回日期：2020-09-07）

（編輯：羅 瑞）