甘草次酸修飾多西紫杉醇磁性納米粒的制備與表征

王莎莎 陳家琦 王華華 黃勝楠 賈永艷 祝俠麗

摘 要 目的：制備甘草次酸修飾多西紫杉醇磁性納米粒（GA-DTX-NGO/IONP-NPs），并對其理化性質(zhì)進(jìn)行評價。方法：以磁性納米氧化石墨烯（NGO/IONP）作為抗腫瘤藥物載體，多西紫杉醇（DTX）為模型藥物，甘草次酸（GA）為靶頭分子。采用水熱法合成NGO/IONP、酰胺化反應(yīng)合成GA修飾的殼聚糖（GA-CS）后，采用傅里葉紅外光譜法、差示掃描量熱法及振動樣品磁測量法等對兩者進(jìn)行表征。采用離子凝膠化法制備GA-DTX-NGO/IONP-NPs;采用透射電鏡、納米粒度分析儀等對其微觀形態(tài)、粒徑及Zeta電位進(jìn)行觀察和測定;采用超濾離心法測定其包封率和載藥量;通過觀察有無外加磁場時的狀態(tài)考察其磁性;結(jié)合808 nm激光對其進(jìn)行光熱轉(zhuǎn)換試驗。結(jié)果：成功合成了NGO/IONP和GA-CS，且NGO/IONP呈現(xiàn)超順磁性。GA-DTX-NGO/IONP-NPs在透射電鏡下呈圓球狀，粒徑為（262.8±4.23） nm，Zeta電位為（13.6±1.51） mV，包封率為（94.29±0.50）%，載藥量為（17.12±0.12）%。GA-DTX-NGO/IONP-NPs的外觀呈黑色，分散均勻;其在外加磁場下磁性納米?？啥ㄏ蛞苿樱@示出良好的磁定向性。在808 nm激光照射下，GA-DTX-NGO/IONP-NPs具有良好的光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)，且呈濃度和時間依賴趨勢。結(jié)論：本研究成功制備了一種磁性納米載藥系統(tǒng)GA-DTX-NGO/IONP-NPs，可為腫瘤的磁熱-化療聯(lián)合治療提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 磁性納米氧化石墨烯;甘草次酸;多西紫杉醇;磁性納米粒

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare Glycyrrhetinic acid-modified docetaxel magnetic nanoparticles （GA-DTX-NGO/IONP- NPs）， and to evaluate its physicochemical properties. METHODS： Magnetic nano graphene oxide （NGO/IONP） was chosen as the anti-tumor drug carrier， docetaxel （DTX） as the model drug and glycyrrhetinic acid （GA） as the target molecule. Firstly， NGO/IONP was synthesized by hydrothermal method and GA-CS was synthesized by amidation reaction. Fourier IR spectrometer， DSC and vibration sample magnetic measuring instrument were used to characterize NGO/IONP and GA-CS. GA-DTX-NGO/IONP-NPs were prepared by the ion gelation method. TEM and particle size analyzer were used to observe and determine the morphology， particle size and Zeta potential of GA-DTX-NGO/IONP-NPs; the ultrafiltration-centrifugation method was used to determine encapsulation efficiency and drug loading amount; the magnetic properties were investigated by investigating the state with or without external magnetic field; the photothermal conversion test was carried out with laser irradiation of 808 nm. RESULTS： NGO/IONP and GA-CS were successfully synthesized， and NGO/IONP exhibited superparamagnetism characteristics. GA-DTX-NGO/IONP-NPs were spherical under TEM， the particle size was （262.8±4.23） nm and the Zeta potential was （13.6±1.51） mV. The encapsulation rate and drug loading amount were （94.29±0.50）% and （17.12±0.12）%， respectively. GA-DTX-NGO/IONP-NPs were black in appearance and evenly dispersed. Under the external magnetic field， the magnetic nanoparticles could move directionally， showing good magnetic properties. GA-DTX-NGO/IONP-NPs showed a good concentration- and time-dependent photothermal conversion effect under 808 nm laser irradiation. CONCLUSIONS： GA-DTX-NGO/IONP-NPs are successfully prepared. This study could provide some theoretical basis for the combined treatment of magnetic heating-chemotherapy for liver tumors.

KEYWORDS?Magnetic nano graphene oxide; Glycyrrhetinic acid; Docetaxel; Magnetic nanoparticles

肝癌是危害人類健康的重大疾病之一 [1-2]。近年來，一種通過磁性納米粒子（Magnetic nanoparticles，MNPS）發(fā)揮作用的磁熱療法（Magnetic hyperthermia therapy，MHT）受到眾多研究學(xué)者的關(guān)注[3]。MHT通過磁滯機(jī)制或交變磁場可以誘導(dǎo)MNPS 在腫瘤病灶部位產(chǎn)熱，使局部升溫至42～46 ℃，但不損傷周圍正常組織[4-5]。納米氧化石墨烯（Nano graphene oxide，NGO）因獨特的二維平面結(jié)構(gòu)使其具有載藥量高、生物相容性好及穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)點[6-7]。在各種功能化的NGO中，經(jīng)過磁性材料修飾后的NGO即磁性納米氧化石墨烯（NGO/IONP）已作為磁熱療法的藥物載體受到了相應(yīng)研究[8-9]。

多西紫杉醇（Docetaxel，DTX）屬于紫杉烷類抗腫瘤藥物，具有較為廣泛的抗瘤作用，但其本身水溶性差、毒性大、缺乏腫瘤靶向性[10-11]。甘草次酸（Glycyrrhetinic acid，GA）是傳統(tǒng)中藥甘草中天然產(chǎn)物甘草酸的三萜苷元成分[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，GA具有良好的肝靶向性[14]。鑒于此，本研究以DTX為模型藥物，GA修飾的殼聚糖（GA-CS）為主要載體材料，采用離子凝膠化法制備一種同時包裹NGO/IONP、DTX的磁性納米粒（GA-DTX- NGO/IONP-NPs），并對其進(jìn)行表征，為肝腫瘤的磁熱-化療聯(lián)合治療提供參考。

1 材料

1.1 儀器

METTLERAE240型十萬分之一天平、DSC 1 STARE型差式掃描量熱（DSC）儀（德國Mettler-Toledo公司）;Nano-ZS90型電位及粒度分析儀（英國Malvern公司）;FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）;Spectrum 100型傅里葉變換紅外光譜（IR）儀（美國Perkin Elmer公司）;JEM-1400型透射電鏡（日本JEOL公司）;22331 Hamburg小型臺式高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）;COS-30 A型真空干燥箱（上海施都凱儀器設(shè)備有限公司）;T6型新世紀(jì)紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）;DYNACOOL型振動樣品磁測量儀（美國Quantum Design公司）;MW-GX-808/3000 mW型激光器（中國科學(xué)院長春激光所）;KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

GA原料藥（武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，批號：405310，純度：>98%）;DTX原料藥（上海瀚香生物科技有限公司，批號：C338774，純度：>98%）;納米氧化石墨烯（南京吉倉納米科技有限公司，批號：JC181213）;N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、CS（上海瑞永生物科技有限公司，批號：RT19U311、RA2017L712）;N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、三聚磷酸鈉（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號：2010082022、2017112022）;1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl，上海思域化工科技有限公司，批號：HF1160624）;甲醇、丙酮等其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 NGO/IONP及GA-CS的合成

2.1.1 NGO/IONP的合成 采用水熱法進(jìn)行合成。稱取NGO 20 mg，加入乙二醇-二乙二醇（1 ∶ 19，V/V）混合溶液20 mL，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）30 min，再以探頭超聲（功率：80 W，頻率：20 kHz）5 min。依次稱取醋酸鈉0.3 g、FeCl3·6H2O 0.108 g加入上述溶液中，攪拌溶解混勻，必要時超聲（條件同上），然后放置于200 ℃油浴中攪拌反應(yīng)10 h[15]。反應(yīng)結(jié)束后，以5 000 ? ?r/min離心處理10 min，沉淀用無水乙醇和水多次洗滌后，冷凍干燥即得黑色固體NGO/IONP，以此為抗腫瘤藥物載體。

2.1.2 GA-CS的合成 采用酰胺反應(yīng)合成GA-CS。稱取CS 50 mg，溶于1%醋酸溶液10 mL中，4 ℃下放置過夜，使其溶解完全。稱取GA 12.5 mg溶于DMF 5 mL中，加入NHS 4.59 mg、EDC·HCl 7.65 mg后冰浴30 min，冰浴結(jié)束后將此溶液緩慢滴加到CS溶液中，室溫下反應(yīng)6 h，然后在80 ℃下反應(yīng)48 h[16]。反應(yīng)結(jié)束后，加入過量（50 mL）丙酮，沉淀6 h以純化除雜，以3 000 r/min離心5 min后棄去上清，沉淀依次用乙醇、乙醚洗滌后，真空干燥即得淡黃色固體GA-CS。

2.2 NGO/IONP及GA-CS的表征

2.2.1 IR表征 分別將NGO、NGO/IONP以及CS、GA、GA-CS與溴化鉀混合后（1 ∶ 100，m/m），壓片，采用IR法對上述物質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果見圖1、圖2。

由圖1可見，與NGO的IR譜圖相比，NGO/IONP除了具有NGO的特征峰外，在575 cm-1處出現(xiàn)了Fe—O伸縮峰，提示NGO/IONP成功合成。

由圖2可見，在CS的IR譜圖中，2 878 cm-1處出現(xiàn)ν（CH2基）伸縮振動吸收峰，1 655 cm-1處出現(xiàn)的弱吸收峰為未完全脫乙酰度ν（NHCOCH3）的酰胺吸收峰，1 596 cm-1處出現(xiàn)的為ν（NH2基）彎曲振動吸收峰。在GA的IR譜圖中，2 947 cm-1處出現(xiàn)的為ν（CH2基）伸縮振動吸收峰。在GA-CS 的IR譜圖中，出現(xiàn)在GA圖譜中2 934 cm-1和CS圖譜中2 881 cm-1處出現(xiàn)的ν（CH2基）伸縮振動吸收峰，1 662 cm-1處酰胺ν（C=O）峰明顯增強(qiáng)，1 563 cm-1處的ν（NH2基）振動吸收峰減弱，并和酰胺（Ⅱ）峰相重疊成一個較寬的峰，提示GA-CS成功合成。

2.2.2 DSC表征 對CS、GA、GA-CS以及GA-CS物理混合物（質(zhì)量比為1 ∶ 1）進(jìn)行DSC掃描，掃描溫度為30～400 ℃，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，CS與GA有各自不同的吸熱峰與放熱峰，GA-CS物理混合物中具有二者共同的特征峰。而GA-CS與GA-CS物理混合物的峰形完全不同，與CS相比也有所改變，這證明GA-CS成功合成。

2.2.3 磁性表征 稱取NGO/IONP 10 mg，加5 mL水超聲，得到NGO/IONP水分散液。在室溫條件下，于振動樣品磁測量儀中測定該水分散液的磁滯回線，外加磁場區(qū)間為-20 000～20 000 Oe，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，NGO/IONP的磁化強(qiáng)度隨外加磁場的變化而變化，呈現(xiàn)超順磁性，幾乎無磁滯現(xiàn)象，飽和磁化強(qiáng)度大約為22 emu/g。參考前期本課題組建立的IONP的磁滯回線[17]可知，本研究合成的NGO/IONP具有超順磁性。

2.3 GA-DTX-NGO/IONP-NPs的制備

采用離子凝膠化法[18]制備GA-DTX-NGO/IONP- NPs。稱取GA-CS 10 mg，溶于1%醋酸溶液（pH 4.5）5 mL中，攪拌溶解后得GA-CS的高分子溶液。稱取NGO/IONP 3 mg，分散于GA-CS溶液中，超聲處理30 min，探頭超聲（功率：80 W，頻率：20 kHz）5 min，制得溶液①。稱取DTX 3 mg，溶于0.2 mL甲醇中，將DTX藥液加入上述溶液①中，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）2 h，制得溶液②。然后在室溫下攪拌的同時，將TPP水溶液（1 mg/mL）緩慢滴加入溶液②中，直至產(chǎn)生淡藍(lán)色乳光時停止滴加，繼續(xù)攪拌1 h，即得GA-DTX-NGO/IONP-NPs。同法制備空白納米粒（僅不加DTX，其余步驟相同）。

2.4 GA-DTX-NGO/IONP-NPs中DTX的含量測定

采用紫外-可見分光光度法測定GA-DTX-NGO/IONP-NPs中DTX的含量。

2.4.1 檢測波長的確定 稱取DTX 2.01 mg，加甲醇溶解并定容至2 mL，得質(zhì)量濃度為1.005 mg/mL的DTX貯備液;取上述貯備液適量，加甲醇稀釋，制成質(zhì)量濃度為20.1 μg/mL的DTX供試品溶液。取空白納米粒適量，加甲醇稀釋，得空白納米粒供試品溶液。以甲醇為空白對照進(jìn)行調(diào)零，分別取上述2種供試品溶液于200～500 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，DTX的最大吸收波長為230 nm，空白納米粒在此波長處基本無吸收，表明空白輔料對DTX測定無干擾，故選擇檢測波長為230 nm。

2.4.2 方法學(xué)考察 （1）線性關(guān)系考察：精密吸取“2.4.1”項下DTX貯備液適量，加甲醇分別稀釋制成質(zhì)量濃度為5.02、10.05、15.07、30.15、40.2 μg/mL的對照品溶液，并于230 nm波長處測定其吸光度。以DTX質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL）、吸光度為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得DTX的回歸方程為y=0.025x-0.043 2（R2=0.999 1）。結(jié)果表明，DTX在5.02～40.2 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。（2）其他方法學(xué)考察：按照2015年版《中國藥典》（四部）[19]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性和加樣回收率考察。結(jié)果，精密度、穩(wěn)定性（0、2、4、6、8、12 h）、重復(fù)性試驗的RSD分別為0.81%（n=6）、1.04%（n=6）、0.62%（n=6）;低、中、高（6、20、40 μg/mL）3個質(zhì)量濃度的平均加樣回收率分別為99.67%、99.90%、99.89%，RSD分別為0.16%、0.09%、0.04%（n=3）。

2.5 GA-DTX-NGO/IONP-NPs的表征

2.5.1 形態(tài)觀察 采用透射電鏡法進(jìn)行觀察。吸取“2.3”項下空白納米粒和GA-DTX-NGO/IONP-NPs 2.5 mL，分別加水定容至5 mL，混勻后，滴至專用的碳膜銅網(wǎng)上，采用磷鎢酸染色，待干燥后于透射電鏡下觀察其形態(tài)，結(jié)果見圖6。

由圖6可見，空白納米粒和GA-DTX-NGO/IONP-NPs的形態(tài)良好，粒徑均約為200 nm。與空白納米粒相比，GA-DTX-NGO/IONP-NPs呈圓球狀，有黑色簇狀物吸附在納米粒內(nèi)外，筆者推測這可能是由于納米粒負(fù)載了大量DTX-NGO/IONP。

2.5.2 粒徑及Zeta電位測定 精密吸取“2.3”項下空白納米粒和GA-DTX-NGO/IONP-NPs各0.5 mL，分別加水定容至5 mL，混勻后，采用電位及粒度分析儀測定其粒徑及Zeta電位的分布，結(jié)果見圖7、圖8。

結(jié)果顯示，空白納米粒的粒徑為（226.0±3.6） nm，Zeta電位為（15.1±1.0） mV;GA-DTX-NGO/IONP-NPs的粒徑為（262.8±4.2） nm，Zeta電位為（13.6±1.5） mV。由圖7、圖8可見，空白納米粒和GA-DTX-NGO/IONP-NPs的粒徑和電位分布均較均勻。

2.5.3 包封率及載藥量測定 采用超濾離心法[20]測定GA-DTX-NGO/IONP-NPs的包封率和載藥量。精密吸取“2.3”項下GA-DTX-NGO/IONP-NPs 0.2 mL，加適量甲醇破乳0.5 h，然后再用甲醇定容至5 mL，采用紫外-可見分光光度儀于230 nm波長處測定溶液吸光度，按照“2.4.2（1）”項下DTX回歸方程計算出溶液中DTX總質(zhì)量，記為W總。精密吸取“2.3”項下GA-DTX-NGO/IONP- NPs 1 mL，置于超濾管中（分子量30 kDa），以5 000 r/min離心15 min，取上清液0.2 mL，加甲醇破乳0.5 h，再用甲醇定容至5 mL，同法于230 nm波長處測定溶液吸光度，按照“2.4.2（1）”項下DTX回歸方程計算出溶液中DTX質(zhì)量，記為W游。納米粒混懸液中其他材料的質(zhì)量根據(jù)加入量記為W其他。按公式計算包封率和載藥量：包封率（%）= [（W總-W游）/W總]×100%;載藥量（%）= [（W總-W游）/（W總+W其他）]×100%。結(jié)果，DTX的包封率為（94.29±0.50）%，RSD=0.53%（n=3）;載藥量為（17.12±0.12）%，RSD=0.70%（n=3）。

2.5.4 磁性檢測 將GA-DTX-NGO/IONP-NPs置于西林瓶中，旁邊放置磁鐵，0.5 h后室溫下拍照，觀察有或者無外加磁場時的狀態(tài)，結(jié)果見圖9。

由圖9可知，GA-DTX-NGO/IONP-NPs在室溫下為均勻黑色分散液，在外加磁場下能夠迅速向磁場聚集得到澄清溶液，經(jīng)振搖后又重新分散均勻。綜合“2.2.3”項下結(jié)果，表明GA-DTX-NGO/IONP-NPs具有良好的磁定向性。

2.5.5 光熱轉(zhuǎn)換試驗 參考文獻(xiàn)方法[21]進(jìn)行光熱轉(zhuǎn)換試驗。精密吸取GA-DTX-NGO/IONP-NPs適量，加水稀釋，制成NGO/IONP質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL的溶液，并以水為對照組（記為0 mg/mL）。分別取上述溶液各3 mL，置于石英比色皿中，采用激光器（2.5 W/cm2）照射，激發(fā)波長為808 nm，每30 s記錄1次溫度。以時間（min）為橫坐標(biāo)、溫度（℃）為縱坐標(biāo)，采用Origin 2019軟件繪制光熱轉(zhuǎn)換曲線，結(jié)果見圖10。

由圖10可知，0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL 4 個質(zhì)量濃度的GA-DTX-NGO/IONP-NPs隨著照射時間的延長，其溫度均先快速上升，而后趨于平緩;且質(zhì)量濃度越大，溫度上升速度越快。試驗過程中對照組溫度幾乎無變化。結(jié)果表明，GA-DTX-NGO/IONP-NPs 具有濃度和時間依賴趨勢的光熱轉(zhuǎn)換特性。

3 討論

以CS作為納米粒的載體材料，不僅安全無毒，且能夠大幅提高藥物的包封率及載藥量，有效改善DTX入血后血藥濃度低、生物利用度低等缺點。采用GA靶向修飾CS，利用GA良好的肝靶向性能賦予納米粒主動靶向性，有望提高藥物的肝腫瘤靶向性。

在腫瘤的治療中，磁熱療法往往要與化療結(jié)合。NGO/IONP作為磁熱療法中采用的常見納米材料之一，因其獨特的理化特性和光學(xué)性質(zhì)，具有緩釋性、靶向性及血腦屏障穿透性等優(yōu)點，多用作腫瘤藥物的載體從而進(jìn)行靶向治療[22-23]。NGO/IONP納米尺徑的大小會影響藥物載體結(jié)合后的穩(wěn)定性、納米粒的成形甚至靶向定位效果，故對磁性材料尺徑的調(diào)控至關(guān)重要。本研究所合成的NGO/IONP粒徑在200 nm左右，對納米粒的成形基本沒有干擾作用。目前，關(guān)于NGO/IONP的研究大多只限于細(xì)胞試驗和動物實驗，真正用于臨床上的成熟劑型很少，且國際上對其毒性大小也沒有一個公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，故NGO/IONP的安全性及穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步考察改進(jìn)，以期未來其能在腫瘤的診斷與治療中發(fā)揮更大的作用。

本研究所制備的GA-DTX-NGO/IONP-NPs分散性良好、粒徑大小較為均勻、包封率和載藥量均較高，在外加磁場下可定向移動，具有良好的光熱轉(zhuǎn)換性能，可為將其應(yīng)用于肝腫瘤磁熱-化療聯(lián)合治療提供一定的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2020-06-23 修回日期：2020-08-13）

（編輯：林 靜）