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    四君子湯對(duì)慢性腎臟病-蛋白質(zhì)能量消耗模型小鼠的改善作用及機(jī)制研究

    2020-10-30 01:55:26許燁李志明遠(yuǎn)方
    中國(guó)藥房 2020年19期
    關(guān)鍵詞:酮酸四君子湯骨骼肌

    許燁 李志明 遠(yuǎn)方

    摘 要 目的:研究四君子湯對(duì)慢性腎臟病-蛋白質(zhì)能量消耗(CKD-PEW)模型小鼠骨骼肌萎縮的改善作用,并探討其可能的作用機(jī)制。方法:將80只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=10)和造模組(n=70)。造模組小鼠采用切除5/6腎聯(lián)合低蛋白(4%酪蛋白)飲食法建立CKD-PEW模型。將造模成功的50只小鼠隨機(jī)分為模型組,四君子湯低、中、高劑量組[2.34、4.68、9.36 g/(kg·d),以生藥量計(jì)]和復(fù)方α-酮酸片組[陽性對(duì)照,1 g/(kg·d)],每組10只。各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物,假手術(shù)組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水,每天1次,連續(xù)灌胃14 d。末次給藥后,稱定小鼠體質(zhì)量、左側(cè)脛骨前肌(TA)濕質(zhì)量,并測(cè)定TA橫截面積;檢測(cè)小鼠TA蛋白合成與分解代謝情況;采用實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)小鼠TA中B淋巴細(xì)胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)及胱天蛋白酶3(Caspase-3) mRNA表達(dá)水平;采用Western blotting法檢測(cè)小鼠TA中肌萎縮蛋白Fbox-1(Atrogin-1)、肌環(huán)指蛋白1(MuRF-1)、Rho相關(guān)蛋白激酶1(ROCK1)、磷酸化腫瘤抑制基因(p-PTEN)、磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)及磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:與假手術(shù)組比較,模型組小鼠的體質(zhì)量、TA濕質(zhì)量、TA蛋白合成代謝能力以及PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),TA橫截面積顯著減?。≒<0.05),TA蛋白分解代謝能力、Bax/Bcl-2比值、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平和Atrogin-1、MuRF-1、ROCK1、p-PTEN蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠上述指標(biāo)均顯著改善(P<0.05)。結(jié)論:四君子湯能夠增加CKD-PEW模型小鼠體質(zhì)量,抑制其骨骼肌萎縮;其機(jī)制可能與調(diào)控ROCK1/PTEN/Akt信號(hào)通路,抑制Atrogin-1和MuRF-1表達(dá)有關(guān)。

    關(guān)鍵詞 四君子湯;慢性腎臟病;蛋白質(zhì)能量消耗;Rho相關(guān)蛋白激酶1;磷酸化腫瘤抑制基因;磷脂酰肌醇-3-激酶;蛋白激酶B;小鼠

    ABSTRACT ? OBJECTIVE: To study the improvement effects of Sijunzi decoction on skeletal muscle atrophy in chronic kidney disease-protein energy wasting (CKD-PEW) model mice, and to explore its potential mechanism. METHODS: A total of 80 mice were randomly divided into sham operation group (n=10) and modeling group (n=70). CKD-PEW model was established by removing 5/6 kidneys and giving a low-protein diet (4% casein) for mice in modeling group. Totally 50 modeled mice were randomly divided into model group, Sijunzi decoction low-dose, medium-dose and high-dose groups [2.34, 4.68, 9.36 g/(kg·d),by crude drug], Compound α-ketoacid tablets group [positive control, 1 g/(kg·d)], with 10 mice in each group. Administration groups were given relevant medicine intragastrically; sham operation group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically, once a day, for consecutive 14 d. After last medication, body weight of mice and wet mass of left tibialis anterior muscle (TA) were weighed; TA cross-sectional area was determined; protein synthesis and decomposition metabolism ability of TA were detected; mRNA expressions of Bcl-2, Bax and Caspase-3 in TA were detected by Real-time PCR; protein expressions of muscular dystrophin Fbox-1 (Atrogin-1), myofloin-1 (MuRF-1), Rho-related protein kinase 1 (ROCK1), phosphorylated PTEN (p-PTEN), phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) and phosphorylated Akt (p-Akt) in TA were detected by Western blotting. RESULTS: Compared with the sham operation group, the body weight, TA wet weight, protein synthesis metabolism ability of TA as well as protein expressions of PI3K and p-Akt were decreased significantly in model group (P<0.05); the cross-sectional area of TA decreased significantly (P<0.05); protein decomposition metabolism ability of TA, Bax/Bcl-2 ratio, Caspase-3 mRNA expression, protein expressions of Atrogin-1, MuRF-1, ROCK1 and p-PTEN were increased significantly (P<0.05). Compared with model group, above indexes of mice were all improved significantly in Sijunzi decoction medium-dose, high-dose groups and Compound α-ketoacid tablets group (P<0.05). CONCLUSIONS: Sijunzi decoction can increase the body weight of CKD-PEW model mice and alleviate the skeletal atrophy; the mechanism may be related to regulating ROCK1/PTEN/Akt signaling pathway activity, inhibiting the expression of Atrogin-1 and MuRF-1.

    KEYWORDS ? Sijunzi decoction; Chronic kidney disease; Protein energy wasting; Rho-related protein kinase 1; PTEN; Phosphatidylinositol-3-kinase; Akt; Mice

    慢性腎臟?。–hronic kidney disease,CKD)是一個(gè)嚴(yán)重的公共健康問題,其發(fā)病率逐年增高,且有年輕化的趨勢(shì)[1]。CKD常伴有多種代謝性紊亂,其中將近50%的患者會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良,導(dǎo)致蛋白質(zhì)能量消耗(Protein energy wasting,PEW),主要表現(xiàn)為肌肉萎縮、體質(zhì)量下降、血清白蛋白水平降低等,這不僅影響了患者的生存質(zhì)量、降低了其治療耐受性,而且還是造成CKD患者死亡的主要誘因之一[2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,CKD歸屬“水腫”“慢腎風(fēng)”“尿血”“腰痛”等范疇,病機(jī)主要與脾、腎、肺有關(guān)[3]。有研究認(rèn)為,CKD以脾、腎虧虛為主,脾虛導(dǎo)致陽氣不升、谷氣下流,因此CKD的中醫(yī)治療多以健脾為主[4]。

    四君子湯是益氣健脾的代表方劑,出自《太平惠民和劑局方》,由人參、茯苓、白術(shù)和甘草4味中藥組成。本課題組前期將四君子湯應(yīng)用于脾腎兩虛型CKD患者的治療,發(fā)現(xiàn)其可明顯改善CKD患者PEW狀態(tài)[5],但是其作用機(jī)制尚未闡明。近年來的研究發(fā)現(xiàn),Rho相關(guān)蛋白激酶1(ROCK1)/人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)CKD-PEW模型骨骼肌發(fā)育與蛋白質(zhì)代謝的能力,其主要組成蛋白R(shí)OCK1、PTEN、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)及Akt的活性變化對(duì)CKD-PEW疾病進(jìn)展具有重要影響,是CKD患者PEW狀態(tài)的潛在干預(yù)靶點(diǎn)[6-7]。鑒于此,本課題組擬通過研究四君子湯對(duì)CKD-PEW模型小鼠骨骼肌ROCK1/PTEN/Akt信號(hào)通路及其下游蛋白的影響,探討其改善CKD相關(guān)PEW的可能作用機(jī)制,為四君子湯用于CKD-PEW患者的治療提供參考。

    1 材料

    1.1 儀器

    Triathler型液體閃爍及發(fā)光測(cè)定儀(京樂自然基因生命科學(xué)有限公司);Ti-S型熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司);RM2235型石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司);7500型實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(美國(guó)ABI公司);Mini-Sub Cell GT Cell型電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

    1.2 藥品與試劑

    四君子湯(由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供,批號(hào):201801014,規(guī)格:每1 mL含生藥量為0.5 g);復(fù)方α-酮酸片(北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司,批號(hào):U1430,規(guī)格:0.63 g/片);酪蛋白(廣東捷倍斯生物科技公司,批號(hào):201803214);Masson染色試劑盒(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司,批號(hào):20190623);B淋巴細(xì)胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶3(Caspase-3)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)引物購于上海生工生物技術(shù)有限公司;HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mix(北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司,批號(hào):201712135-01、201801012-03);兔源肌萎縮蛋白Fbox-1(Atrogin-1)、肌環(huán)指蛋白1(MuRF-1)、ROCK1、PTEN、磷酸化PTEN(p-PTEN)、PI3K、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、β-actin抗體(美國(guó)CST公司,批號(hào):CST4041T、CST6367T、CST4035T、CST9188S、CST9551S、CST4249S、CST582- 95S、CST9614S、CST4970S);總蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(北京碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào):121017200621、0106201700628);辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號(hào):2018001005);酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司,批號(hào):209-113-1,純度:99%);14+C-苯丙氨酸(中國(guó)原子能科學(xué)研究院);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格,水為蒸餾水。

    1.3 動(dòng)物

    SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠80只,6~8周齡,體質(zhì)量18~20 g,購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2016-0002]。小鼠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室[恒溫(22±4) ℃、恒濕(60±5)%、明暗時(shí)間各12 h],自由飲食。本研究實(shí)驗(yàn)方案得到了遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    2 方法

    2.1 造模

    采用切除5/6腎聯(lián)合低蛋白飲食法建立CKD-PEW模型。利用3.5%水合氯醛麻醉小鼠后,將其背部左側(cè)毛發(fā)剃除,用碘伏進(jìn)行消毒處理。用干凈紗布將剃毛處四周遮住,露出手術(shù)區(qū)域,并用剪刀剪開一個(gè)小口,逐層剝離,暴露腎臟,擠出左側(cè)腎臟并剝離腎臟兩極組織,分離腎蒂周圍及結(jié)締組織,完全游離左腎;從上至腎門約0.4 cm、下至腎門約0.4 cm預(yù)置縫合線,勒緊縫合線并切除兩極腎臟組織;7 d后暴露右側(cè)腎臟,止血鉗夾緊腎門處并緊靠血管夾下方放置縫合線,在血管夾上方切除腎臟,縫合并消毒手術(shù)切口,以復(fù)制CKD模型。假手術(shù)組小鼠同期進(jìn)行手術(shù),僅剝離腎包膜,不切除腎組織。術(shù)后,用棉簽壓迫法止血,縫合傷口并涂上碘伏消毒,將小鼠放入鼠籠飼養(yǎng)。手術(shù)1周后對(duì)CKD造模小鼠分別給予4%酪蛋白飲食飼養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,以建立CKD-PEW模型;假手術(shù)組給予正常飲食。通過比較各組小鼠體質(zhì)量、肌酐、尿素氮、白蛋白及24 h尿蛋白水平判斷模型制備是否成功[8]。

    2.2 分組與給藥

    將80只小鼠分為假手術(shù)組(n=10)和造模組(n=70),分別按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行假手術(shù)或者CKD-PEW造模。將造模成功的50只小鼠隨機(jī)分為模型組,四君子湯低、中、高劑量組[2.34、4.68、9.36 g/(kg·d),以生藥量計(jì);根據(jù)成人(60 kg)臨床等效劑量的1、2、4倍換算]和復(fù)方α-酮酸片組[陽性對(duì)照,1 g/(kg·d);根據(jù)成人(60 kg)臨床等效劑量換算],每組10只。小鼠灌胃給藥,每天給藥1次,連續(xù)給藥14 d;假手術(shù)組和模型組小鼠同法灌胃等體積生理鹽水。

    2.3 樣本采集及處理

    在末次給藥1 h后,稱定小鼠體質(zhì)量;然后利用3.5%水合氯醛麻醉小鼠后,剪開小鼠皮膚,迅速分離出完整的左側(cè)脛骨前?。═ibialis anterior,TA),稱量并記錄TA濕質(zhì)量。將一半TA樣本量(n=5)用4%多聚甲醛固定,用于測(cè)量TA橫截面積。另一半TA樣本量(n=5)取部分新鮮組織立即用于蛋白合成和分解代謝檢測(cè);剩余組織置于-80 ℃冰箱中保存,用于凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)和Atrogin-1、MuRF-1及ROCK1/PTEN/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)。

    2.4 TA橫截面積測(cè)定

    取出4%多聚甲醛固定的TA,流水沖洗數(shù)小時(shí)后,分別經(jīng)70%、80%、90%、100%乙醇脫水,二甲苯Ⅰ、Ⅱ各透明15 min,再放入石蠟Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中分別浸蠟60 min,并進(jìn)行連續(xù)切片(5 μm)。切片脫蠟水化,Weigert鐵蘇木素染色液染色5~10 min,酸性乙醇分化5~15 s,流水洗3 min;Masson藍(lán)化液返藍(lán)3~5 min,流水洗3 min;水洗1 min,麗春紅酸性品紅染色液染色5~10 min;弱酸工作液洗1 min,磷鉬酸溶液洗1~2 min,弱酸工作液洗1 min,放入苯胺藍(lán)染色液中染色1~2 min;弱酸工作液洗1 min,95%乙醇快速脫水,無水乙醇分別脫水10 s×3次,二甲苯透明5 min×3次,中性樹膠封片。將切片置于倒置顯微鏡下觀察,并利用Image pro plus 6.0軟件計(jì)算TA橫截面積。

    2.5 TA蛋白合成代謝能力檢測(cè)

    將新鮮的TA置于DMEM培養(yǎng)基(5 mL)中,37 ℃下充氧孵育30 min,然后在含放射性同位素14+C-苯丙氨酸的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育1 h,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min×3次,隨后制備50% TA勻漿液,加入10%三氨乙酸(TCA)沉淀蛋白質(zhì);吸棄上清,加入0.5 mol/L NaOH溶液溶解沉淀的蛋白。取1.8 mL該蛋白溶液加入閃爍液進(jìn)行液閃計(jì)數(shù),取0.2 mL該蛋白溶液利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè),檢測(cè)單位時(shí)間內(nèi)(1 h)摻入的14+C-苯丙氨酸的放射性含量,分析蛋白合成代謝能力[8]。

    2.6 TA蛋白分解代謝能力檢測(cè)

    將新鮮的TA置于KRB緩沖液中,37 ℃下充氧孵育2 h,取該孵育液用10%TCA沉淀,取上清0.5 mL與1.0 mL 5%TCA混合均勻,依次加入0.75 mL硝酸、0.75 mL一氧化二氮,混合均勻,55 ℃下孵育30 min;隨后加入2 mL雙氯乙烯萃取,吸取上清液200 μL至96孔板中,利用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值,根據(jù)前期繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線[以不同濃度(0~1 nmol/L)酪氨酸為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)],計(jì)算TA蛋白分解代謝能力[8]。

    2.7 TA中凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)檢測(cè)

    采用實(shí)時(shí)熒光定量-PCR法檢測(cè)TA中Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平。采用Trizol法提取小鼠TA中總RNA,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA,然后以cDNA為模板采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(共 20 μL):cDNA 2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,2×Top Green qPCR SuperMix 10 μL,ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法測(cè)定目的基因mRNA的表達(dá)水平(式中Ct表示目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)),并計(jì)算Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的比值(Bax/Bcl-2)。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。

    2.8 TA中Atrogin-1、MuRF-1及ROCK1/PTEN/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)

    采用Western blotting法進(jìn)行檢測(cè)。利用總蛋白提取試劑盒提取小鼠TA中總蛋白,根據(jù)BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液,進(jìn)行蛋白變性,然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳(100 V、1.5 h),濕法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(250 mA 、90 min);TBST緩沖液洗膜5 min×3次,5%脫脂牛奶封閉1 h;分別加入Atrogin-1、MuRF-1、ROCK1、PTEN、p-PTEN、PI3K、Akt、p-Akt及β-actin一抗(稀釋度均為1 ∶ 1 000),4 ℃孵育過夜;次日,TBST緩沖液洗膜5 min×3次,加入二抗(稀釋度為1 ∶ 1 000),室溫孵育1 h;經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光顯色后,使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。采用Image J 1.8.0軟件對(duì)圖像光密度進(jìn)行分析,以目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin條帶的光密度比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平,以p-PTEN/PTEN、p-Akt/Akt的光密度比值表示PTEN、Akt蛋白的磷酸化水平。

    2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 小鼠體質(zhì)量和TA濕質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

    與假手術(shù)組比較,模型組小鼠體質(zhì)量、TA濕質(zhì)量顯著降低(P<0.05);與模型組比較,四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠體質(zhì)量、TA濕質(zhì)量均顯著升高(P<0.05),且均顯著高于四君子湯低劑量組(P<0.05);四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組之間小鼠體質(zhì)量、TA濕質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組小鼠體質(zhì)量、TA濕質(zhì)量測(cè)定結(jié)果見表2。

    3.2 小鼠TA橫截面積測(cè)定結(jié)果

    與假手術(shù)組比較,模型組小鼠TA明顯萎縮,肌纖維變細(xì),橫截面積顯著減小(P<0.05);與模型組比較,四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠TA肌纖維變粗,橫截面積顯著增大(P<0.05),且四君子湯高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠TA橫截面積顯著大于四君子湯低劑量組(P<0.05);四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組之間小鼠TA橫截面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組小鼠的TA橫截面顯微圖見圖1,橫截面積測(cè)定結(jié)果見表3。

    3.3 小鼠TA蛋白合成與分解代謝能力測(cè)定結(jié)果

    與假手術(shù)組比較,模型組小鼠TA單位時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)合成代謝能力顯著減弱、分解代謝能力顯著增強(qiáng)(P<0.05);與模型組比較,四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠TA單位時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)合成代謝能力顯著增強(qiáng)、分解代謝顯著減弱(P<0.05);與四君子湯低劑量組比較,四君子湯高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠單位時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)合成代謝能力顯著增強(qiáng)、分解代謝顯著減弱(P<0.05);四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組之間小鼠TA單位時(shí)間內(nèi)蛋白合成與分解代謝能力差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組小鼠單位時(shí)間內(nèi)蛋白合成與分解代謝能力測(cè)定結(jié)果見表4。

    3.4 小鼠TA中凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果

    與假手術(shù)組比較,模型組小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與四君子湯低劑量組比較,四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組之間小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見表5。

    3.5 小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果

    與假手術(shù)組比較,模型組小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與四君子湯低劑量組比較,四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸組之間小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組小鼠TA中Atrogin-1、MuRF-1蛋白表達(dá)電泳圖見圖2,蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見表6。

    3.6 小鼠TA中ROCK1/PTEN/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果

    與假手術(shù)組比較,模型組小鼠TA中ROCK1蛋白表達(dá)水平、p-PTEN/PTEN比值顯著升高(P<0.05),PI3K蛋白表達(dá)水平、p-Akt/Akt比值顯著降低(P<0.05);與模型組比較,四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠TA中ROCK1蛋白表達(dá)水平、p-PTEN/PTEN 比值顯著降低(P<0.05),PI3K蛋白表達(dá)水平、p-Akt/Akt比值顯著升高(P<0.05);與四君子湯低劑量組比較,四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組小鼠TA中ROCK1蛋白表達(dá)水平、p-PTEN/PTEN 比值顯著降低(P<0.05),PI3K蛋白表達(dá)水平、p-Akt/Akt比值顯著升高(P<0.05);四君子湯中、高劑量組和復(fù)方α-酮酸片組之間小鼠TA中上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組小鼠TA中ROCK1/PTEN/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖見圖3,蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見表7。

    4 討論

    肌肉萎縮是伴隨著CKD的治療同步發(fā)生的一種并發(fā)癥。有研究表明,超過半數(shù)的血液透析CKD患者存在PEW狀態(tài)[9]。而肌肉萎縮是CKD患者PEW的主要表現(xiàn)形式,也可作為預(yù)測(cè)CKD患者預(yù)后的重要指標(biāo)之一。CKD-PEW患者大多會(huì)缺乏必需氨基酸,復(fù)方α-酮酸片不僅可以直接補(bǔ)充必需氨基酸,并且可與體內(nèi)的氨基結(jié)合生成必需氨基酸,使體內(nèi)蛋白質(zhì)合成代謝增加,改善營(yíng)養(yǎng)狀況[10],故本研究選用復(fù)方α-酮酸片作為陽性對(duì)照藥。四君子湯具有補(bǔ)氣、益氣健脾之功效,杜紅蓮等[11]的研究結(jié)果證實(shí)了四君子湯能夠改善脾腎兩虛型CKD患者的腎功能。為了探討四君子湯對(duì)CKD患者PEW的作用,本課題組通過5/6腎切除法構(gòu)建CKD小鼠模型,同時(shí)根據(jù)CKD患者PEW的臨床特點(diǎn),給予4%酪蛋白飲食建立了CKD-PEW小鼠模型[12]。結(jié)果顯示,四君子湯給藥14 d后,CKD-PEW模型小鼠體質(zhì)量和TA濕質(zhì)量減輕、TA橫截面積減小的情況有不同程度改善,且四君子湯還能夠升高模型小鼠TA蛋白合成代謝、降低其蛋白分解代謝,這說明四君子湯對(duì)CKD-PEW模型小鼠的骨骼肌萎縮具有一定的緩解作用。

    CKD-PEW引起的代謝性酸中毒、胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)、血管緊張素Ⅱ分泌增多等因素均可激活 Caspase-3 及泛素蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin proteasome system,UPS),導(dǎo)致肌肉萎縮[13]。有研究表明,在CKD-PEW模型大鼠中骨骼肌嚴(yán)重萎縮,同時(shí)肌纖維中促凋亡基因Bax、Caspase-3表達(dá)上調(diào),而抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào),說明線粒體凋亡途徑在骨骼肌蛋白能量消耗過程中具有重要作用[14]。本研究結(jié)果顯示,給予四君子湯治療14 d后,CKD-PEW模型小鼠TA中Bax/Bcl-2比值和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著降低,說明四君子湯可抑制骨骼肌細(xì)胞凋亡,從而緩解肌肉萎縮。在CKD中,P13K/Akt信號(hào)通路受損是引起骨骼肌蛋白質(zhì)丟失的主要原因。該信號(hào)通路受損后繼發(fā)UPS激活,繼而引起Atrogin-1和MuRF-1的表達(dá)升高,這是骨骼肌萎縮的經(jīng)典機(jī)制[15-16]。因此,骨骼肌組織中的Atrogin-1和MuRF-1的表達(dá)量可作為衡量肌肉蛋白質(zhì)分解代謝情況的生物學(xué)標(biāo)志[17]。本研究結(jié)果顯示,四君子湯治療14 d后,CKD-PEW模型小鼠TA中Atrogin-1和MuRF-1的蛋白表達(dá)水平均顯著降低,說明四君子湯可通過抑制UPS的激活來減輕CKD-PEW小鼠的骨骼肌萎縮。

    Caspase-3也是參與蛋白降解的蛋白酶,可切割肌球蛋白和肌原纖維蛋白,并切割特定的19S蛋白酶體亞基,加速26S蛋白酶體的降解,而且Caspase-3能夠切除ROCK1 的C端半胱氨酸結(jié)構(gòu)域而使其活化[18]。活化的ROCK1能夠增強(qiáng)PTEN磷酸化,而活化的PTEN又可抑制PI3K/Akt的活性,從而促進(jìn)蛋白降解,引起肌肉萎縮[19]。有研究發(fā)現(xiàn),敲低ROCK1水平可抑制PTEN活性,從而負(fù)調(diào)控PI3K與p-Akt蛋白的表達(dá),并通過下調(diào)Atrogin-1和MuRF-1表達(dá)來調(diào)控肌肉蛋白質(zhì)代謝[20]。另有研究運(yùn)用 ROCK1的抑制劑法舒地爾干預(yù)CKD模型小鼠后發(fā)現(xiàn),法舒地爾可使CKD模型小鼠的肌肉質(zhì)量顯著提升、體質(zhì)量顯著增長(zhǎng),故推測(cè)其是通過抑制ROCK1來降低PTEN活性、激活A(yù)kt來降低Atrogin-1 和 MuRF-1 表達(dá),從而抑制蛋白質(zhì)分解代謝、延緩肌肉萎縮[21]。可見,ROCK1/PTEN/Akt途徑在骨骼肌萎縮的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn),四君子湯治療14 d后,CKD-PEW模型小鼠TA中ROCK1、p-PTEN蛋白表達(dá)水平顯著降低,而PI3K與p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著升高,說明四君子湯也可通過調(diào)控ROCK1/PTEN/Akt信號(hào)通路,抑制Atrogin-1和 MuRF-1表達(dá),來改善CKD-PEW模型小鼠的骨骼肌萎縮。

    綜上所述,四君子湯可增加CKD-PEW模型小鼠體質(zhì)量,抑制骨骼肌萎縮,這可能是通過調(diào)控ROCK1/PTEN/Akt信號(hào)通路、抑制Atrogin-1和 MuRF-1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。但本研究只是初步探討了四君子湯改善CKD-PEW模型小鼠骨骼肌萎縮的作用機(jī)制,具體分子學(xué)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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    (收稿日期:2020-05-30 修回日期:2020-08-09)

    (編輯:林 靜)

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