靈芝酸C2調控S6K/SREBPs信號通路對肝細胞脂代謝的影響及機制研究

蔣亞麗 袁永 董帥 高改 趙建平 王輝

摘 要 目的：研究靈芝酸C2（GAC2）的體外降脂作用，并基于核糖體S6蛋白激酶（S6K）/固醇調節(jié)元件結合蛋白（SREBPs）信號通路探討其可能機制。方法：以人肝細胞HL-7702為對象，采用MTT法考察低、中、高劑量（5、10、20 μmol/L，下同）GAC2作用后細胞的相對活力;以洛伐他汀為陽性對照，采用酶聯免疫吸附測定法檢測低、中、高劑量GAC2作用后細胞中膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）的含量，并采用尼羅紅染色法觀察細胞內的脂質堆積情況;轉染SREBPs報告基因質粒后，以25-羥基膽固醇（25-HC）為陽性對照，采用熒光素酶報告基因法檢測低、中、高劑量GAC2作用后細胞中SREBPs熒光素酶的相對活性;以25-HC為陽性對照，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應法檢測中、高劑量GAC2作用后細胞中SREBPs及其下游基因mRNA的表達情況;以SREBPs抑制劑（25-HC）、S6K抑制劑（雷帕霉素）為參照，采用Western blotting法檢測細胞中SREBP-1、SREBP-2的表達情況[以成熟SREBPs（n-SREBPs）表示]以及磷酸化S6K與S6K的相對表達量比值（p-S6K/S6K比值）;利用AutoDock 4.0等軟件對S6K與GAC2進行分子對接。結果：低、中、高劑量GAC2對細胞相對活力無顯著影響（P>0.05）。與空白對照組比較，洛伐他汀組和GAC2高劑量組細胞中TC含量以及洛伐他汀組和GAC2中、高劑量組細胞中TG含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），各給藥組細胞中的脂滴均有所減少。與空白對照組比較，25-HC組和GAC2低、中、高劑量組細胞中的SREBPs熒光素酶相對活性均顯著降低;25-HC組和GAC2中、高劑量組細胞中HMGCS1、MVK、SCD、HMGCR基因mRNA，25-HC組細胞中DHCR7基因mRNA，GAC2高劑量組細胞中SREBP-2基因mRNA，25-HC組和GAC2高劑量組細胞中DHCR24、MSMO2基因mRNA的相對表達量均顯著降低;25-HC組和GAC2低、中、高劑量組細胞中SREBP-1蛋白的相對表達量，25-HC組和GAC2高劑量組n-SREBP-2蛋白的相對表達量以及霉帕霉素組和GAC2各劑量組p-S6K/S6K比值均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。分子對接結果顯示，GAC2可通過氫鍵與S6K的氨基酸殘基Arg335、Arg330、Ala332結合。結論：GAC2可降低HL-7702細胞的脂質水平，其調控作用可能與抑制S6K/SREBPs信號通路的表達有關。

關鍵詞 靈芝酸C2;核糖體S6蛋白激酶/固醇調節(jié)元件結合蛋白信號通路;脂代謝;HL-7702細胞

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study in vitro lipid-lowering effect of ganoderic acid C2 （GAC2）， and to investigate its potential mechanism on the basis of S6K/SREBPs signaling pathway. METHODS： Using human liver cells HL-7702 as objects， MTT assay was used to test relative cell viability after treated with low， medium and high doses （5， 10， 20 μmol/L， hereinafter） of GAC2. Using lovastatin as positive control， ELISA method was used to detect the contents of TC and TG in cells after treated with low， medium and high doses of GAC2. Nile red staining was used to observe the accumulation of lipids in cells. After transfected SREBPs report gene plasmid， using 25-HC as positive control， relative viability of SREBPs luciferase in cells were determined by luciferase assay after treated with low， medium and high doses of GAC2. Using 25-HC as positive control， real-time fluorescent quantitative PCR was used to measure the mRNA expression of SREBPs and their downstream genes in cells after treated with medium and high doses of GAC2. Using SREBPs inhibitor （25-HC） and S6K inhibitor （rapamycin） as control， Western blotting assay was adopted to determine the expression of SREBP-1 and SREBP-2 （in the case of n-SREBPs）， relative expression ratio of phosphorylated S6K to S6K （p-S6K/S6K ratio）. AutoDock 4.0 and other softwares were used for molecular docking of S6K and GAC2. RESULTS： There was no significant effect of low， medium and high doses of GAC2 on relative cell viability （P>0.05）. Compared with blank control group， the content of TC in lovastatin group and GAC2 high-dose group as well as the content of TG in lovastatin group， GAC2 medium- and high-dose groups were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; the number of lipid droplets in the cells of all medication groups decreased. Compared with blank control group， relative viability of SREBPs luciferase in 25-HC group， GAC2 low-， medium- and high-dose groups were decreased significantly; mRNA expression of HMGCS1， MVK， SCD， HMGCR gene in 25-HC group and GAC2 medium-， high-dose groups， mRNA expression of DHCR7 gene in 25-HC group， mRNA expression of SREBP-2 gene in GAC-2 high-dose group as well as mRNA expression of DHCR24 and MSMO2 gene in 25-HC group and GAC2 high-dose group were all decreased significantly; relative protein expression of n-SREBP-1 in 25-HC group， GAC2 low-， medium- and high-dose groups， relative protein expression of n-SREBP-2 in 25-HC group and GAC2 high-dose group as well as p-S6K/S6K ratio in rapamycin group and GAC2 groups were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The molecular docking results showed that GAC2 could bound to amino acid residues Arg335， Arg330 and Ala332 of S6K via hydrogen bond. CONCLUSIONS： GAC2 can reduce the lipid level of HL-7702 cells， which may be associated with inhibiting the expression of S6K/SREBPs signaling pathway.

KEYWORDS ? Ganoderic acid C2; S6K/SREBPs signaling pathway; Lipid metabolism; HL-7702 cells

據成人血脂相關數據統(tǒng)計結果顯示，2016年我國人群血脂異常的患病率約為40.4%，預計到2030年，血清膽固醇水平的異常升高將導致我國心血管病事件增加約920萬例[1]。高血脂癥與動脈血管粥樣硬化、腦梗死、心肌梗死、2型糖尿病等多種疾病的發(fā)生密切相關，已嚴重威脅到人們的生活健康[2-3]。目前，臨床首選的降脂藥物以他汀類為主，主要包括洛伐他汀、普伐他汀、阿托他汀、辛伐他汀等，可通過競爭性抑制3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR）來阻斷細胞內的羥基甲戊酸代謝通道，從而有效抑制膽固醇的合成[4]。然而，隨著臨床研究的不斷深入，學者發(fā)現他汀類藥物在發(fā)揮降脂作用的同時，還具有誘發(fā)肝損傷、肌肉毒性（肌病、肌炎及橫紋肌溶解）、糖尿病、胃腸道反應等毒副作用[5-7]，使得其應用受到一定限制。因此，尋找安全、有效的降脂藥物成為醫(yī)學研究的熱點之一。固醇調節(jié)元件結合蛋白（SREBPs）是脂質從頭合成的關鍵轉錄因子，其下游基因FAS、HMGCR是游離脂肪酸和膽固醇內源性合成的關鍵限速酶的編碼基因，也是降脂藥物研發(fā)的關鍵靶點[8]。核糖體S6蛋白激酶（S6K）是SREBPs上游絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可調控SREBPs的剪切及其進入細胞核的過程，從而促進游離脂肪酸、膽固醇合成限速酶[脂肪酸合成酶（FAS）]和HMGCR的表達[9]。

臨床實踐表明，靈芝具有較好的降脂作用[10]。靈芝酸C2（GAC2，分子式為C30H46O7，化學結構式見圖1）是靈芝的主要成分之一，具有增強免疫力、抗腫瘤、抗病毒等藥理活性[11-12]?；诖耍狙芯繑M以人肝細胞HL-7702為對象，初步探討GAC2的體外降脂作用，并基于S6K/SREBPs通路探討其降脂的可能機制，以期為靈芝活性成分研究及其臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

FLUOstar OPTIMA型多功能酶標儀（德國BMG Labtech公司）;Gel Doc XR型全能型凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）;7500 Fast型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國ABI公司）;Series Ⅱ Water Jackxet型CO2細胞培養(yǎng)箱、Multiskan GO型全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;SW-CJ-ZF型超凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設備有限公司）;Eclipset S100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）;Microfuge 20R型冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 藥品與試劑

GAC2對照品（成都普菲德生物技術有限公司，批號：150320，純度：≥98%）;25-羥基膽固醇（25-HC）對照品（批號：H1015，純度：≥98%）、美伐他汀對照品（批號：M2537，純度：≥98%）、洛伐他汀對照品（批號：M2147，純度：≥98%）、雷帕霉素對照品（批號：R0395，純度：≥98%）均購自美國Sigma公司;青-鏈霉素雙抗、MTT試劑、胰酶、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為20191126、725C056、20191128、PC0020）;胎牛血清、F-12K Nutrient Mixture培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號分別為42G3279K、1930074）;尼羅紅染液（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10558414）;低脂蛋白血清（LPDS，美國Kalen Biomedical公司，批號：BS042101）;RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0013B）;Poly Jet體外轉染試劑（深圳恩科生物科技有限公司，批號：20191126）;細胞總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）含量測定試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司，批號分別為E1015、E1013）;鼠源SREBP-1單克隆抗體（美國Santa Cruz公司，批號：sc-13551）;兔源SREBP-2多克隆抗體（英國Abcam公司，批號：ab30682）;兔源S6K單克隆抗體、兔源磷酸化核糖體S6蛋白激酶（p-S6K）單克隆抗體（美國Cell Signaling公司，批號分別為2708、9205S）;辣根過氧化物酶（HRP）標記的小鼠抗人β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體、HRP標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（武漢三鷹生物技術有限公司，批號分別為66009、SA00001-1、SA00001-2）;Hiscript Ⅱ qRT ? ? Super MixⅡ逆轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司，批號：R323-01）;Power UpTM SYBRTM Green PCR Master Mix試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：775498）;DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Corning公司，批號：10013023）;熒光素酶報告基因試劑盒（含報告基因裂解液和報告基因裂解底物，美國Promega公司，批號：0000312919）;ECL顯色試劑盒（美國Bio-Rad公司，批號：1705061）;二甲基亞砜（DMSO）等其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 細胞與質粒

人肝細胞HL-7702購自美國模式培養(yǎng)物研究所（ATCC）細胞庫;SREBPs報告基因質粒由河南中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學院謝治深博士惠贈。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將HL-7702細胞置于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”）中，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），隔天換液1次;待細胞生長融合至約80%時，進行傳代培養(yǎng)。

2.2 細胞相對活力檢測

采用MTT法檢測。取對數生長期的HL-7702細胞，用完全培養(yǎng)基調整細胞密度后，以1.2×104個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，將其隨機分為空白對照組和GAC2低、中、高劑量組（5、10、20 μmol/L，劑量設置參考本課題組前期預試驗結果，下同），每組設置5個復孔?？瞻讓φ战M加入含1‰DMSO的完全培養(yǎng)基100 μL，各給藥組加入含相應藥物的完全培養(yǎng)基100 μL。培養(yǎng)18 h后，加入5 mg/mL MTT試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，振搖10 min，使用全波長酶標儀于490 nm波長處測定各孔的光密度（OD）值，并計算細胞的相對活力：相對活力=（試驗組OD值-對照組OD值）/對照組OD值。上述試驗重復3次。

2.3 細胞中TC、TG含量檢測

采用生化法檢測。取對數生長期的HL-7702細胞，按“2.2”項下方法接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，將其隨機分為空白對照組、洛伐他汀組（陽性對照，1 μmol/L，劑量設置參考已有文獻[13]）和GAC2低、中、高劑量組（5、10、20 μmol/L），每組設置6個復孔?？瞻讓φ战M加入含1‰DMSO的完全培養(yǎng)基100 μL，各給藥組加入含相應藥物的完全培養(yǎng)基100 μL。培養(yǎng)18 h后，用胰酶消化，以1 000 r/min離心5 min，收集沉淀，嚴格按照相應試劑盒說明書方法操作，使用全波長酶標儀于500 nm波長處檢測OD值，并以試驗組與空白對照組OD值的比值表示TC、TG的含量。上述試驗重復3次。

2.4 細胞內脂質堆積情況觀察

采用尼羅紅染色法[14]觀察。取對數生長期的HL-7702細胞，用完全培養(yǎng)基調整細胞密度后，以2.4×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h后，按“2.3”項下方法分組，每組設置3個復孔?？瞻讓φ战M加入含1‰DMSO的完全培養(yǎng)基2 mL，各給藥組加入含相應藥物的完全培養(yǎng)基2 mL。培養(yǎng)18 h后，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH為7.2～7.4）清洗3 min×3次，隨后每孔加入100 μg/mL尼羅紅染液500 μL，于37 ℃下避光染色10 min后，棄去染液;用PBS清洗后，使用熒光顯微鏡觀察并拍照（染色后，細胞中若有脂質堆積則可見桔紅色脂滴[15]）。

2.5 細胞中SREBPs熒光素酶活性檢測

采用熒光素酶報告基因法[16]檢測。取對數生長期的HL-7702細胞，按“2.2”項下方法接種于96孔板中，待細胞鋪板融合度超過70%時，將其隨機分為空白對照組、25-HC組（陽性對照，1 μmol/L，劑量設置參考已有文獻[17]，下同）和GAC2低、中、高劑量組（5、10、20 μmol/L），每組設6個復孔。所有組細胞均瞬時轉染SREBPs報告基因質粒，并于轉染6 h后更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。次日，棄去各孔上清液，空白對照組加入含1‰DMSO的新鮮培養(yǎng)基（以等體積混合的F-12K Nutrient Mixture培養(yǎng)基和DMEM高糖培養(yǎng)基為基質，并含有5%LPDS、1%青-鏈霉素雙抗、10 μmol/L美伐他汀，下同）100 μL，各給藥組加入含相應藥物的新鮮培養(yǎng)基100 μL。培養(yǎng)18 h后，棄去培養(yǎng)基，加入報告基因裂解液振搖裂解30 min，隨后加入報告基因裂解底物，使用多功能酶標儀于560 nm波長處檢測各孔的化學發(fā)光值，同時按照BCA蛋白濃度試劑盒說明書方法檢測各孔的蛋白含量，并計算SREBPs的熒光素酶相對活性：熒光素酶相對活性=（試驗組化學發(fā)光值/試驗組蛋白含量）/（空白對照組化學發(fā)光值/空白對照組蛋白含量）。上述試驗重復3次。

2.6 細胞中SREBPs及其下游基因mRNA表達檢測

采用實時熒光定量PCR法[18]檢測。取對數生長期的HL-7702細胞，按“2.4”項下方法接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h后，將其隨機分為空白對照組、25-HC組（陽性對照，1 μmol/L）和GAC2中、高劑量組（10、20 μmol/L，為驗證“2.5”項下結果暫只設定了中、高劑量），每組設3個復孔。空白對照組加入含1‰DMSO的完全培養(yǎng)基2 mL，各給藥組加入含相應藥物的完全培養(yǎng)基2 mL。培養(yǎng)18 h后，采用Trizol法提取細胞RNA，按照Hiscript Ⅱ qRT Super MixⅡ逆轉錄試劑盒說明書轉錄得cDNA，使用Power UpTM SYBRTM Green PCR Master Mix試劑盒以實時熒光定量PCR儀進行擴增。反應體系（共10 μL）：cDNA 4 μL，SYBR Green Mix試劑5 μL，上、下游引物（序列見表1）各0.5 μL。反應條件：50 ℃加熱2 min，95 ℃預變性2 min;95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內參基因，采用2-ΔΔCt法分析目標基因mRNA的相對表達量。上述試驗重復3次。

2.7 細胞中S6K/SREBPs通路相關蛋白表達檢測

采用Western blotting法檢測。取對數生長期的HL-7702細胞，按“2.4”項下方法接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，將其隨機分為空白對照組、25-HC組（SREBPs抑制劑，1 μmol/L）、雷帕霉素組（S6K抑制劑，1 μmol/L，劑量設置參考已有文獻[19]）和GAC2低、中、高劑量組（5、10、20 μmol/L），每組設5個復孔?？瞻讓φ战M加入含1‰DMSO的完全培養(yǎng)基2 mL，各給藥組加入含相應藥物的完全培養(yǎng)基2 mL。培養(yǎng)18 h后，棄去培養(yǎng)基，加入RIPA裂解液裂解以提取總蛋白;蛋白于95 ℃變性10 min后，采用BCA法測定蛋白含量。取變性蛋白適量進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并濕法轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，以脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入SREBP-1、SREBP-2、S6K、p-S6K一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;以TBST溶液清洗10 min×4次，隨后加入相應二抗（SREBP-1對應HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗，SREBP-2、S6K、p-S6K對應HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，稀釋度均為1 ∶ 2 000）室溫孵育1.5 h，以TBST溶液清洗10 min×4～5次。經ECL試劑顯色后，于凝膠成像儀上成像，使用Image J V1.8.0軟件分析，以成熟SREBPs（n-SREBPs）與內參（β-actin）條帶的灰度值比值表示SREBPs的相對表達量，并記錄p-S6K與S6K的相對表達量比值（簡稱為“p-S6K/S6K比值”）。上述試驗重復3次。

2.8 S6K與GAC2的分子對接

采用Chem Draw Ultra 8.0軟件繪制GAC2分子結構，利用Chem3D Ultra 8.0軟件將其能量優(yōu)化后作為分子對接配體，隨后從蛋白質結構數據庫（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中查找具高分辨率的S6K蛋白的“PDB”文件作為分子對接受體（PDB編號：4rlp）。使用AutoDock 4.0軟件將S6K蛋白受體與GAC2配體進行對接，最后利用Ligplot V.1.4軟件進行可視化處理，模擬S6K蛋白受體與GAC2配體之間的相互作用并計算其結合能。結合能數值越小，表明兩者相互作用越強[20-21]。

2.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析。所有數據均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 GAC2對HL-7702細胞活力的影響

GAC2各劑量組細胞的相對活力與空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見表2。

3.2 GAC2對HL-7702細胞中TC、TG含量的影響

與空白對照組比較，洛伐他汀組和GAC2高劑量組細胞中TC含量以及洛伐他汀組和GAC2中、高劑量組細胞中TG含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表3。

3.3 GAC2對HL-7702細胞中脂質堆積的影響

空白對照組細胞中可見大量桔紅色脂滴;各給藥組細胞中的脂滴有所減少，且隨著GAC2劑量的增加，脂滴有逐漸減少的趨勢，詳見圖2。

3.4 GAC2對HL-7702細胞中SREBPs熒光素酶相對活性的影響

與空白對照組比較，25-HC組和GAC2低、中、高劑量組細胞中的SREBPs熒光素酶相對活性均顯著降低（P<0.05或P<0.01），其相對活性分別下降約61%、19%、30%、34%，有隨GAC2劑量增加而降低的趨勢，詳見表4。

3.5 GAC2對HL-7702細胞中SREBPs及其下游基因mRNA表達的影響

與空白對照組比較，25-HC組和GAC2中、高劑量組細胞中HMGCS1、MVK、SCD、HMGCR基因mRNA，25-HC組細胞中DHCR7基因mRNA，GAC2高劑量組細胞中SREBP-2基因mRNA以及25-HC組和GAC2高劑量組細胞中DHCR24、MSMO1基因mRNA的相對表達量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表5。

3.6 GAC2對HL-7702細胞中S6K/SREB通路相關蛋白表達的影響

與空白對照組比較，25-HC組和GAC2低、中、高劑量組細胞中n-SREBP-1蛋白的相對表達量，25-HC組和GAC2高劑量組細胞中n-SREBP-2蛋白的相對表達量以及雷帕霉素組和GAC2各劑量組細胞中p-S6K/S6K比值均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖3（圖中，pre-SREBP-1、pre-SREBP-2表示無活性前體蛋白SREBP-1、SREBP-2）、表6（表中，“-”表示沒有加入相應的藥物進行干預，故無結果）。

3.7 GAC2與S6K蛋白分子對接情況

分子對接結果顯示，GAC2可完全嵌入S6K的結合口袋中，并以氫鍵與3個氨基酸殘基結合，分別為Arg335、Arg330、Ala332;結合能為-6.81 kcal/mol（1 kcal=4.19 kJ），詳見圖4。

4 討論

高血脂是指血液中TC或TG含量過高或低密度脂蛋白膽固醇含量異常升高，又或上述多種指標同時增高所引發(fā)的全身代謝性疾病，現代醫(yī)學表明，血脂異常會加速動脈粥樣硬化、冠心病等心腦血管疾病的進程[2-3]。因此，如何維持血脂平衡成為亟待解決的重要問題。SREBPs是調節(jié)細胞脂質代謝平衡的核轉錄因子，包括SREBP-1（含SREBP-1c、SREBP-1a）、SREBP-2等亞型。其中，SREBP-1c主要參與調控內源性游離脂肪酸的從頭合成，SREBP-2主要調節(jié)膽固醇的生產，而目前有關SREBP-1a轉錄活性的研究較少[22]。SREBPs首先在內質網上形成無活性前體（pre-SREBP），當細胞內TC水平較低時，pre-SREBP與剪切激活蛋白（SCAP）形成復合物[23];該復合物由細胞質被膜復合體Ⅱ（CopⅡ）轉運至高爾基體，再經蛋白水解成核內成熟SREBP（n-SREBPs）后，與細胞核中轉錄結合區(qū)域結合，并啟動下游HMGCS1、MVK、SCD、HMGCR、SREBP-2、DHCR7、DHCR24、 ? ?MSMO1等脂質合成關鍵基因的轉錄[24]。有研究指出，SREBPs的轉錄活性主要受上游S6K蛋白磷酸化的影響[19]，當機體營養(yǎng)過剩時，作為調控蛋白生成及葡萄糖平衡維持的重要蛋白激酶S6K被磷酸化，從而促使下游SREBPs剪切入核，最終導致脂質合成增多而誘發(fā)肥胖、胰島素抵抗以及高脂血癥[25]。

基于S6K/SREBPs通路在調節(jié)脂質平衡中的重要作用，本課題組對GAC2體外降脂作用及可能機制進行了初步探討。首先，本研究采用MTT法檢測了GAC2對HL-7702細胞活力的影響，明確了低、中、高劑量GAC2對細胞均無明顯毒性。同時，以HMGCR競爭性抑制劑洛伐他汀為陽性對照，評價了GAC2對HL-7702細胞藥效學指標（TC、TG）的影響。結果顯示，洛伐他汀組和GAC2高劑量組細胞中TC含量以及洛伐他汀組和GAC中、高劑量組細胞中TG含量均較空白對照組顯著降低，且GAC2可不同程度地減少細胞中的脂質堆積。

同時，本研究以SREBPs經典抑制劑25-HC為陽性對照，從轉錄水平評價了GAC2對SREBPs熒光素酶活性的影響，并采用實時熒光定量PCR法檢測了GAC2對SREBPs及下游脂質合成關鍵基因mRNA表達的影響。結果顯示，25-HC組和GAC2各劑量組細胞中的SREBPs熒光素酶相對活力以及各給藥組細胞中HMGCS1、MVK、SCD、HMGCR基因mRNA，25-HC組細胞中DHCR7基因mRNA，GAC2高劑量組細胞中SREBP-2基因mRNA，25-HC組和GAC2高劑量組細胞中DHCR24、MSMO1基因mRNA的相對表達量均較空白對照組顯著降低。值得注意的是，HMGCR是SREBPs下游調控膽固醇內源性合成的限速酶靶基因[26]。故筆者推測，GAC2與SREBPs抑制劑25-HC的降脂作用機制可能是相似的，即通過抑制膽固醇的生物合成從而減少脂質的生成。

為進一步明確GAC2的降脂作用機制，本研究分別以SREBPs經典抑制劑25-HC、S6K經典抑制劑雷帕霉素為陽性對照，評價了GAC2對SREBP、S6K蛋白表達的影響。結果顯示，25-HC組和GAC2各劑量組細胞中n-SREBP-1蛋白的相對表達量，25-HC組和GAC2高劑量組細胞中n-SREBP-2蛋白的相對表達量以及雷帕霉素組和GAC2各劑量組細胞中p-S6K/S6K比值均較空白對照組顯著降低。這提示GAC2可能通過抑制肝細胞內S6K蛋白的磷酸化，使得下游核內n-SREBPs合成減少，進而抑制SREBPs下游調控脂質合成相關靶基因的轉錄來發(fā)揮降脂作用。此外，分子對接結果顯示，GAC2可通過氫鍵與S6K的氨基酸殘基（Arg335、Arg330、Ala332）結合，進一步證實了S6K可能是GAC2的作用靶點。

已有研究表明，靈芝能夠有效改善高脂飲食誘導的肥胖及脂質聚集情況[27]，但降脂作用機制尚未闡明。本研究結果顯示，GAC2可通過抑制S6K/SREBPs信號通路來調控HL-7702細胞的脂質水平，從而發(fā)揮降脂作用。本研究為靈芝及GAC2的降脂活性及作用機制的進一步研究提供了有益參考，但尚未通過動物實驗予以驗證，故有待后續(xù)研究進一步完善。

參考文獻

[ 1 ] MORAN A，GU D，ZHAO D，et al. Future cardiovascular disease in China：Markov model and risk factor scenario projections from the coronary heart disease policy mo- del：China[J]. Circ Cardiovasc Qual Outcomes，2010，3（3）：243-252.

[ 2 ] REN J，GRUNDY SM，LIU J，et al. Long-term coronary heart disease risk associated with very-low-density lipoprotein cholesterol in Chinese ：the results of a 15-year Chinese multi-provincial cohort study （CMCS）[J]. Atherosclerosis，2010（211） ：327-333.

[ 3 ] The Global Burden of Metabolic Risk Factors for Chronic Diseases Collaboration. Cardiovascular disease，chronic kidney disease，and diabetes mortality burden of cardiometabolic risk factors from 1980 to 2010：a comparative risk assessment[J]. Lancet Diabetes Endocrinol，2014 （2） ：634-647.

[ 4 ] 侯晅，戴學文，房志仲.抗高血脂藥物的研究進展[J].天津藥學，2016，28（4）：59-64.

[ 5 ] GUO M，ZHAO J，ZHAI Y，et al. A prospective study of hepatic safety of statins used in very elderly patients[J]. BMC Geriatr，2019. DOI：10.1186/s12877-019-1361-2.

[ 6 ] RAWAT A，KAUSHIK R. Statin induced myopathy：the tip of the iceberg[J]. J Assoc Physicians India，2020，68（1）：67.

[ 7 ] HOFFMEISTER T，KAISER J，L?DTKE S，et al. Interactions between atorvastatin and the farnesoid X receptor impair insulinotropic effects of bile acids and modulate ?diabetogenic risk[J]. Mol Pharmacol，2020，97（3）：202- 211.

[ 8 ] DONG XY，TANG SQ，CHEN JD. Dual functions of insig proteins in cholesterol homeostasis[J]. Lipids Health Dis，2012. DOI：10.1186-1476-511X-11-173.

[ 9 ] BIEVER A，VALJENT E，PUIGHERMANAL E. Ribosomal protein S6 phosphorylation in the nervous system：from regulation to function[J]. Front Mol Neurosci，2015. DOI：10.3389/fnmol.2015.00075.

[10] CHU TTW，BENZIE IFF，LAM CWK，et al. Study of potential cardioprotective effects of Ganoderma lucidum （Lingzhi）：results of a controlled human intervention ? ? trial[J]. Br J Nutr，2012，107（7）：1017-1027.

[11] KIMURA Y，TANIGUCHI M，BABA K. Antitumor and antimetastatic effects on liver of triterpenoid fractions of Ganoderma lucidum：mechanism of action and isolation of an active substance[J]. Anticancer Res，2002，22（6A）：3309-3318.

[12] 邢康康，劉艷，賀宗毅，等.靈芝酸研究進展[J].重慶中草藥研究，2018（2）：56.

[13] ZHONG C，FAN L，LI Z，et al. SREBP2 is upregulated in esophageal squamous cell carcinoma and co-operates with c-Myc to regulate HMGCR expression[J]. Mol Med Rep，2019，20（4）：3003-3010.

[14] QIN P，WANG Z，LU D，et al. Neutral lipid content in li- pid droplets ：potential biomarker of cordycepin accumulation in cordycepin-producing fungi[J]. Molecules，2019. DOI：10.3390/molecules24183363.

[15] ALFOTAWI R，ELSAFADI M，MUTHURANGAN M，et al. A new procedure in bone engineering using induced ?adipose tissue[J]. J Invest Surg，2019. DOI：10.1080/08941939.2019.1604915.

[16] MIYATA S，INOUE J，SHIMIZU M，et al. Xanthohumol improves diet-induced obesity and fatty liver by suppre- ssing sterol regulatory element-binding protein （SREBP） activation[J]. J Biol Chem，2015，290（33）：20565-20579.

[17] IWASE M，WATANABE K，SHIMIZU M，et al. Chrysin reduces the activity and protein level of mature forms of sterol regulatory element-binding proteins[J]. Biosci Biotechnol Biochem，2019，83（9）：1740-1746.

[18] 郝軒軒，王新陸，崔琳，等.加參方浸膏對H2O2誘導的H9c2心肌細胞凋亡的干預作用研究[J].中國藥房，2018，29（14）：1898-1903.

[19] QUAN HY，KIM DY，KIM SJ，et al. Betulinic acid alle- viates non-alcoholic fatty liver by inhibiting SREBP1 activity via the AMPK-mTOR-SREBP signaling pathway[J].Biochem Pharmacol，2013，85（9）：1330-1340.

[20] 蓋偉，張燕玲，艾路，等.利用Autodock篩選復方丹參方中HMG-CoA還原酶抑制活性成分：英文[J].中國天然藥物，2010，8（1）：51-56.

[21] 張海晴，薛鑫，王小龍.桂枝中酚類提取物潛在作用靶點的探索[J].南京中醫(yī)藥大學學報，2019，35（3）：319-325.

[22] SHIMANO H，SATO R. SREBP-regulated lipid metabolism：convergent physiology-divergent pathophysiology [J]. Nat Rev Endocrinol，2017，13（12）：710-730.

[23] GUO C，CHI Z，JIANG D，et al. Cholesterol homeostatic regulator SCAP-SREBP2 integrates NLRP3 inflammasome activation and cholesterol biosynthetic signaling in macrophages[J]. Immunity，2018，49（5）：842-856.

[24] INOUE J，MIYATA S，SHIMIZU M，et al. Isoxanthohumol stimulates ubiquitin-proteasome-dependent degradation of precursor forms of sterol regulatory element-bin- ding proteins[J]. Biosci Biotechnol Biochem，2018，82（9）：1591-1598.

[25] OWEN JL，ZHANG Y，BAE SH，et al. Insulin stimulation of SREBP-1c processing in transgenic rat hepatocytes requires p70S6-kinase[J]. Proc Natl Acad Sci，2012，109（40）：16184-16189.

[26] SHI J，LI R，LIU Y，et al. Shuangyu tiaozhi granule atte- nuates hypercholesterolemia through the reduction of cholesterol synthesis in rat fed a high cholesterol diet[J]. Biomed Res Int，2019. DOI：10.1155/2019/4805926.

[27] ZHU J，JIN J，DING J，et al. Ganoderic acid A improves high fat diet-induced obesity，lipid accumulation and insulin sensitivity through regulating SREBP pathway[J]. Chem Biol Interact，2018. DOI：10.10168/j.cbi.2018.05. 014.

（收稿日期：2019-12-26 修回日期：2020-05-17）

（編輯：張元媛）