廣東涼茶顆粒中芳香酚酸類化學(xué)成分研究*

孫彩云, 王志芳, 蘇賢君, 雷玲芳, 宋化燦, 張中強(qiáng), 張翠仙

(1. 河北理工大學(xué) 輕工學(xué)院，河北 唐山063000；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；3. 中國廣州分析測試中心廣東省分析測試技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070)

廣東涼茶顆粒(王老吉)由崗梅、山芝麻、五指柑、淡竹葉、木蝴蝶、布渣葉、火炭母、金沙藤、廣金錢草、金櫻根十味中藥組成。其味甜、苦，藥性寒涼，具有清熱解暑，去濕生津之功效。用于四時感冒，發(fā)熱喉痛，熱積滯，口干尿黃。目前除本課題組外，鮮見關(guān)于其物質(zhì)基礎(chǔ)的報道[1-2]。為了闡明廣東涼茶顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在前期研究的基礎(chǔ)上[2]，采用多種現(xiàn)代色譜分離技術(shù)：正反相材料(硅膠、ODS、凝膠)、HPLC等繼續(xù)對其甲醇提取物進(jìn)行分離，采用現(xiàn)代波譜和物理常數(shù)對照等方法鑒定其結(jié)構(gòu)。從中分離得到7個芳香酚酸類化合物(見圖1)，化合物1、3、5首次從廣東涼茶顆粒中得到。并采用LC-MSn技術(shù)對分離得到的單體化合物和已建立LC-MSn指紋圖譜進(jìn)行指認(rèn)。為進(jìn)一步建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

圖1 從廣東涼茶顆粒中分離得到的7種芳香酚酸類化合物Fig.1 Seven structures of compounds 1,2,3,4,5,6,7from Guangdong Liangcha

1 結(jié)果與討論

1.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1，無色針狀結(jié)晶(CHCl3)，θmp210～213 ℃，溴甲酚綠和FeCl3顯色反應(yīng)均呈陽性，說明其為芳香酚酸類化合物。ESI-MSm/z353 [M-H]-結(jié)合NMR譜(2-CH2、8-CH和6-C )可確定其分子式為C16H18O9，不飽和度為8。1H NMR譜中低場區(qū)出現(xiàn)五組峰信號：δH7.54(1H, d,J=15.5 Hz)，6.25(1H, d,J=16.0 Hz)為反式雙鍵質(zhì)子信號，7.03(1H, d,J=1.6 Hz)，6.94(1H, dd,J=2.0, 8.2 Hz)，6.76(1H, d,J=8.0 Hz)為1,3,4三取代咖啡?；惢衔锏湫吞卣?。13C NMR中δC171.2(s)為羧基碳信號，δC168.7(s)為酯羰基信號。同時高場信號δH5.33 (ddd, 5.5, 4.0, 3.2, 1H, H-3), 4.16 (dd, 10.0, 3.9, 8.0, 1H, H-5), 3.72 (dd, 8.0, 3.0, 1H, H-4), 2.13～2.21 (m, 4H, H-2和H-6)顯示結(jié)構(gòu)中存在奎寧酸結(jié)構(gòu)。將1的NMR數(shù)據(jù)與綠原酸對照[3]，基本一致。確定1為綠原酸。經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)化合物1首次從廣東涼茶顆粒中分離得到。經(jīng)文獻(xiàn)查閱及LC-MSn方法與單味藥化學(xué)成分對比研究發(fā)現(xiàn)，其可能來源于淡竹葉。研究表明此化合物對銅綠假單胞菌具有顯著的抑制作用[4]。

化合物2，白色針晶(MeOH)，θmp205～206 ℃，溴甲酚綠和FeCl3反應(yīng)均呈陽性，說明其為芳香酚酸類化合物。ESI-MSm/z163[M-H]-，結(jié)合NMR譜( 6-CH和3-C )確定2分子式為C9H8O3，不飽和度為6?；衔?低場部分NMR數(shù)據(jù)與1咖啡?；糠諲MR數(shù)據(jù)基本相似，只是芳香環(huán)為1,4對位取代：7.45(2H, d,J=8.4 Hz)，6.81(2H, d,J=8.8 Hz)；同時也存在一個反式雙鍵信息：δH7.60(1H, d,J=15.6 Hz)，6.30(1H, d,J=16.0 Hz)。將2的NMR數(shù)據(jù)與E-p-coumaric acid對照[5-6]，基本一致。確定2為反式-對香豆酸。經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)2首次從廣東涼茶顆粒中分離得到。經(jīng)文獻(xiàn)查閱及LC-MSn方法與單味藥化學(xué)成分對比研究發(fā)現(xiàn)，其可能來源于布渣葉和淡竹葉。

化合物4：無色針晶，θmp214～216℃，溴甲酚綠反應(yīng)陽性，表明結(jié)構(gòu)中存在羧基；FeCl3顯色反應(yīng)陽性，表明其含有酚羥基。ESI-MSm/z137 [M-H]-，結(jié)合NMR譜( 4-CH和3-C )確定4分子式為C7H6O3，不飽和度為5。1H NMR譜中低場區(qū)出現(xiàn)兩組峰信號，分別為δH7.88(2H, d,J=8.8 Hz)和6.82(2H, d,J=8.8 Hz)，提示4為1,4對位代芳香類化合物。13C NMR中δC170.2(s)為羧基碳信號，δC163.4(s)、133.1(d)、122.8(s)、116.1(d)也證明了4為1,4二取代芳香類化合物。將4的NMR數(shù)據(jù)與對羥基苯甲酸的對照[9]，基本一致。故鑒定4為對羥基苯甲酸。經(jīng)文獻(xiàn)查閱及LC-MSn方法與單味藥化學(xué)成分對比研究發(fā)現(xiàn)，其可能來源于布渣葉。

化合物6：無色片狀結(jié)晶(MeOH-H2O)，θmp134～136 ℃，溴甲酚綠反應(yīng)陽性，F(xiàn)eCl3顯色反應(yīng)陽性。分子式C8H8O4，ESI-MSm/z167[M-H]-。將6的NMR數(shù)據(jù)與5對照，二者十分相似，只是6的NMR中明顯增加了一個甲氧基信息：δH3.81(1H, s)、δC56.5(q)，羰基的13C NMR信息明顯向高場移動(δC=5，δC168.2, s)。將6的NMR數(shù)據(jù)與原兒茶酸甲酯對照[13]，基本一致。確定6為原兒茶酸甲酯。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)6首次從廣東涼茶顆粒中分離得到，并采用LC-MSn方法與單味藥化學(xué)成分對比研究表明其可能來源于崗梅。

化合物7：無色針狀結(jié)晶(MeOH)，θmp235～237 ℃，溴甲酚綠反應(yīng)陽性，F(xiàn)eCl3顯色反應(yīng)陽性。結(jié)合ESI-MSm/z169[M-H]-和NMR信息確定其分子式C7H6O5，不飽和度4。將7的NMR數(shù)據(jù)與4對照，發(fā)現(xiàn)1H NMR中僅有一個信號峰且為單峰：δH7.06(s, 2H)，提示該化合物可能為對稱的1,3,4,5-四取代芳香化合物。將7的NMR數(shù)據(jù)與沒食子酸對照[14-15]，基本一致。故確定7為沒食子酸。進(jìn)查閱文獻(xiàn)和LC-MSn方法與單味藥化學(xué)成分對比研究發(fā)現(xiàn)，其可能來源于金櫻根和火炭母。研究表明此化合物具有消除自由基、抗氧化、抑菌等作用[16]。

1.2 指紋圖譜色譜峰指認(rèn)

到目前為止，美國國家食品藥品監(jiān)督局(FDA)、英國草藥典、德國藥用植物學(xué)會、印度草藥典和加拿大藥用及芳香植物學(xué)會等機(jī)構(gòu)均將指紋圖譜作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容之一。HPLC-MSn指紋圖譜是評價中藥和中藥制劑整體質(zhì)量的有效有段。根據(jù)檢測化合物的保留時間和質(zhì)譜信息，將分離得到芳香酚酸類化合物1,2,3,4,5,7與已建立的廣東涼茶顆粒HPLC-MSn指紋圖譜[17]進(jìn)行對照分析(見圖2，共已建立98個主要色譜峰)。結(jié)果表明(見表1)，只有6個化合物(化合物1,2,3,4,5,7)與已建立HPLC-MSn指紋圖譜的色譜峰得以確定。

表1 化合物1,2,3,4,5和7與LC-MSn指紋圖譜對照主要信息表[17]Table 1 Comparament information of compounds 1,2,3,4,5 and 7 with the major finger-prints of Guangdong Liangcha by HPLC-ESI-TOF/IT-MS and ESI-TOF-MS in negative ion mode

注“com.”代表“化合物”

圖2 由負(fù)離子ESI-TOF-MS基峰離子流圖獲得的廣東涼茶顆粒高效液相色譜圖[17]Fig.2 HPLC chromatogram of Guangdong Liangcha obtained by BPC of negative-ion ESI-TOF-MS[17]

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 材料與儀器

北京泰克光學(xué)儀器廠X-6型熔點(diǎn)儀(熔點(diǎn)未矯正)；旋光由德國POLARTRONIC H H W5 polarimeter(SCHMIDT+ HAENSCH，Germany) 測定；NMR數(shù)據(jù)由瑞士Bruker 公司AVANCE AV 400和500兆超導(dǎo)核磁共振儀測試；質(zhì)譜由美國Finnigan公司LCQDECAXP高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測試完成；1200 HPLC高效液相色譜儀，配備在線脫氣機(jī)、二元梯度泵、自動進(jìn)樣器和柱溫箱(美國Agilent公司)；Agilent Poroshell 120 SB-C18快速分離型高效液相色譜柱(150 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國Agilent公司)；6210 TOF質(zhì)譜儀配備ESI(美國Agilent公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE2010，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；電子分析天平(AUY120，廣州湘儀機(jī)電設(shè)備有限公司)；凝膠為Sephadex LH-20(日本YMC)；柱層析硅膠(200～300目)為青島海洋化工有限公司生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)用甲醇和乙腈為色譜純(美國Sigma公司)，甲酸為分析純(廣州化學(xué)試劑廠)，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由超純水設(shè)備制備(美國Milipore公司)，其余的溶劑：石油醚、乙酸乙酯、甲醇(分離用)、氯仿等試劑均為廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品(分析純)。

廣東涼茶顆粒(廣州王老吉藥業(yè)股份有限公司 批號: 1002037)。

2.2 提取與分離

廣東涼茶顆粒(10 kg)，經(jīng)甲醇滲漉提取，減壓回收甲醇，得深黃褐色浸膏(1.18 kg)。浸膏用水捏溶至5回路轉(zhuǎn)L，依次用石油醚(PE)、乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BuOH)萃取，萃取液減壓濃縮得PE相(5 g)、EtOAc相(51.5 g)、n-BuOH相(188.0 g)和H2O相(500 mL)。

乙酸乙酯部位(51.5 g)進(jìn)行硅膠(200～300目)柱層析。以極性逐增加的氯仿-甲醇溶劑體系(VPE∶VEtOAc=10∶1, 9∶1, 7∶3, 6∶4，1∶1, 4∶6, 2∶8, 0 ∶100)洗脫。TLC跟蹤合并得到8個流分(Fr-1至Fr-8)。流分Fr-1(4.0 g)經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析(VCHCl3∶VMeOH=12∶1, 5∶2)，其中Fr1-1(1.5g)凝膠柱層析(VCHCl3∶VMeOH=1∶1)依次得到化合物3(15 mg)、6(89 mg)、4(50 mg)；流分Fr-1-2(100 mg)硅膠柱層析(VCHCl3∶VMeOH=32∶1)及重結(jié)晶得2(4.6 mg)；流分Fr-3經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析(VCHCl3∶VMeOH=7∶1)得Fr3-3(600 mg)；Fr3-3經(jīng)凝膠柱層析(VCHCl3∶VMeOH=1∶1)依次得1(18 mg)、5(47.5 mg)、4(39.3 mg)、2(2.6 mg)。Fr4(1.5 g)重結(jié)晶后得4(794.2 mg)。

正丁醇部位部位(188 g)進(jìn)行硅膠(200～300目)柱層析。以極性逐增加的氯仿-甲醇溶劑體系(VCHCl3∶VMeOH=9∶1, 8∶2, 7∶3, 6∶4, 5∶5, 4∶6, 3∶7, 0∶1)洗脫。TLC跟蹤，得到6個流分(LCDC-1至LCDC-6)。流分LCDC-1(1.5 g)經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析(VCHCl3∶VMeOH=3∶1)，TLC追蹤合并得到LCDC-1-2(1.0 g)。LCDC-1-2經(jīng)凝膠柱層析(VCHCl3∶VMeOH=1∶1)得到7(794.2 mg)；流分LCDC-2(1.5 g)經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析(VCHCl3∶VMeOH=6∶1)，TLC追蹤得到LCDC-2-2 (200 mg)，LCDC-2-2經(jīng)制備型HPLC分離(VMeOH∶VH2O=1∶1)得到2(79 mg)。

2.3 HPLC-MSn指紋圖譜確認(rèn)

2.3.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取分離純化所得的綠原酸、反式-對香豆酸、咖啡酸、對羥基苯甲酸、原兒茶酸、原兒茶酸甲酯、沒食子酸各5.0 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解，定溶，作為對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取廣東涼茶顆粒10 g (廣州王老吉藥業(yè)股份有限公司，批號為1002037)，置錐形瓶中，100 mL水浸泡過夜，經(jīng)0.45 (m微孔濾膜過濾后作為供試品溶液。

2.3.3 樣品分析 采用1200 HPLC高效液相色譜儀配備6210 TOF質(zhì)譜儀分析對照品和供試品的質(zhì)譜信息，并確定其色譜峰代表的化合物信息。檢測條件如下，色譜柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18(150 mm×2.1 mm，2.7μm)；流動相A為φ=0.5%甲酸，B為乙腈，進(jìn)行梯度洗脫：0～5 min，0% B；5～25 min，φ=0～12% B；25～60 min，φ=12%～20% B；60～90 min，φ=20%～40% B；90～110 min，φ=40%～60% B；110～120 min，φ=60%～95% B，后運(yùn)行10 min，0 B。流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：1.0 μL，柱溫：25 ℃。質(zhì)譜儀條件，干燥氣體溫度：350 ℃，流速：10 L·min-1，噴霧氣壓：50 psi，毛細(xì)管電壓：5 000 V，碰撞電壓：100 V，擋熱電壓：65 V，八極射頻電壓：250 V。

2.4 物理常數(shù)及波譜數(shù)據(jù)

化合物1：無色針狀結(jié)晶(CHCl3), C16H18O9,θmp210～213 ℃,ESI-MSm/z353[M-H]-;1H NMR (500 MHz, D2O)δH: 7.54(1H, d,J=15.5 Hz, H-7′), 7.03(1H, d,J=1.6 Hz, H-2′), 6.94(1H, dd,J=8.0, 1.6 Hz, H-6′), 6.76(1H, d,J=8.0 Hz, H-5′), 6.25(1H, d,J=16.0 Hz, H-8′), 5.33 (ddd, 5.5, 4.0, 3.2, 1H, H-3), 4.16 (dd, 10.0, 3.9, 8.0, 1H, H-5), 3.72 (dd, 8.0, 3.0, 1H, H-4), 2.13 (m, 2H, H-2或H-6), 2.21(m, 2H, H-2或H-6);13C NMR (125 MHz, D2O)δC: 171.2(C-7, COOH, s), 168.7(C-9′, s), 149.6 (C-4′, s), 147.1(C-3′, s), 146.8(C-7′, d), 127.8(C-1′, s), 123.0(C-6′, d), 116.5 (C-2′, d), 115.3 (C-8′, d), 115.2(C-5′, d), 76.2(C-1, s), 73.5(C-3, d), 72.0(C-4, d), 71.4(C-5, d), 38.8 (C-2, t), 38.2(C-6, t)。

化合物2：白色針晶(MeOH), C9H8O3,θmp205～206 ℃, ESI-MSm/z163 [M-H]-;1H NMR (400 MHz, CD3OD)δH: 7.60(1H, d,J=15.6 Hz, H-7), 7.45(2H, d,J=8.4 Hz, H-2, 6), 6.81(2H, d,J=8.8 Hz, H-3, 5), 6.30(1H,d,J=16.0 Hz, H-8);13C NMR (100 MHz, CD3OD)δC: 171.1 (C-9, s), 161.3(C-4, s), 146.7(C-7, d), 131.2(C-2, 6, d), 127.3(C-1, s), 116.9(C-3, 5, d), 115.7(C-8, d)。

化合物3：淡黃色結(jié)晶(MeOH), C9H8O4,θmp188～190 ℃, ESI-MSm/z179[M-H]-;1H NMR (500 MHz, CD3OD)δH: 7.52(1H, d,J=16.0 Hz, H-8), 7.02(1H, d,J=2.0 Hz, H-2), 6.92(1H, dd,J=2.0, 8.5 Hz, H-6 ), 6.76(1H, d,J=8.5 Hz, H-5), 6.20(1H, d,J=16.0 Hz, H-7);13C NMR (125 MHz, CD3OD)δC: 171.1(C-9, s), 149.5(C-3, s), 147.1(C-4, s), 146.8(C-7, d), 127.8(C-1, s), 123.0(C-8, d), 116.5(C-6, d), 115.5(C-5, d), 15.1(C-2, d)。

化合物4：無色針晶(MeOH), C7H6O3,θmp214～216 ℃, ESI-MSm/z137[M-H]-；1H NMR (400 MHz, CD3OD)δH: 7.88(2H, d,J=8.8 Hz, H-2, 6), 6.82(2H, d,J=8.8 HZ, H-3, 5);13C NMR (100 MHz, CD3OD)δC: 170.2(C-7, s), 163.4 (C-4, s), 133.1 (C-2, 6, d), 122.8(C-1, s), 116.1(C-3, 5, d)。

化合物5：無色針狀結(jié)晶(MeOH), C7H6O4,θmp199.0～201.0 ℃, ESI-MSm/z153[M-H]-;1H NMR(400 MHz, CD3OD)δH: 7.44(1H, dd,J=2.0, 8.4 Hz, H-6), 7.42(1H, d,J=2.0 Hz, H-2), 6.81(1H, d,J=8.6 Hz, H-5);13C NMR (100 MHz, CD3OD)δC: 170.4(C-7, s), 151.6(C-4, s), 146.1(C-3, s), 124.0(C-1, s), 123.2 (C-6, s), 117.8 (C-5, d), 115.9(C-2, d)。

化合物6：無色片狀結(jié)晶(MeOH-H2O), C8H8O4,θmp134～136 ℃, ESI-MSm/z167[M-H]-;1H NMR (400 MHz, CD3OD)δH: 7.56(1H, br.s, H-2), 7.54(1H, d,J=8.5 Hz, H-6 ),6.84(1H, d,J=8.8 Hz, H-5), 3.81(3H, s, -OCH3);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δC: 168.2 (C-7, s), 152.8 (C-4, s), 148.8(C-3, s), 125.4(C-6, s), 123.3 (C-1, s), 115.9(C-2, d), 114.0(C-5, d), 56.5(C-8, q)。

化合物7：無色針狀結(jié)晶(MeOH), C7H6O5,θmp235～237℃, ESI-MSm/z169 [M-H]-;1H NMR(400 MHz, CD3OD)δH: 7.06(2H, s, H-2, 6);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δC: 170.5(C-7, s), 146.5(C-3, 5, s), 139.7(C-4, s), 122.1(C-1, s), 110.5(C-2, d)。

致謝：感謝11級林秋純、鄧迪和10級楊敏、葉書豪和陳婉文五位同學(xué)在化合物分離過程中的實(shí)驗(yàn)工作。感謝中山大學(xué)分析測試中心姚俊華、關(guān)山越老師對化合物結(jié)構(gòu)測試工作的支持。

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