中藥活性肽的制備、分離純化及鑒定研究進(jìn)展

摘要：近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于水蛭、土鱉蟲(chóng)、蜈蚣等中藥的活性肽具有顯著抗凝血、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤等藥理活性?；钚噪慕M分結(jié)構(gòu)及化學(xué)性質(zhì)接近，選用適宜的制備分離及鑒定方法以獲取中藥活性肽是研究的關(guān)鍵。然而相對(duì)于食品、水產(chǎn)等行業(yè)，中藥活性肽分離純化及鑒定的研究相對(duì)較少。為此，本文綜述近年來(lái)中藥活性肽制備分離純化及鑒定相關(guān)方法，闡述其原理及特點(diǎn)，以期為中藥活性肽的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：中藥活性肽;分離純化;柱層析;膜分離;質(zhì)譜;結(jié)構(gòu)鑒定

中圖分類號(hào)：R927" " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.23.044

文章編號(hào)：1006-1959（2024）23-0186-07

Research Progress on Preparation， Separation， Purification and Identification

of Active Peptides from Traditional Chinese Medicine

Abstract：In recent years， studies have found that active peptides derived from leech， eupolyphaga， centipede and other traditional Chinese medicines have significant anticoagulant， blood lipid regulation， anti-tumor and other pharmacological activities. The structure and chemical properties of active peptides are similar. The key to the study is to select appropriate preparation， separation and identification methods to obtain active peptides from traditional Chinese medicine. However， compared with food， aquaculture and other industries， there are relatively few studies on the separation， purification and identification of active peptides from traditional Chinese medicine. Therefore， this paper reviews the methods of preparation， separation， purification and identification of active peptides from traditional Chinese medicine in recent years， and expounds its principles and characteristics， in order to provide reference for the development and application of active peptides from traditional Chinese medicine.

Key words：Active peptides from traditional Chinese medicine;Separation and purification;Column chromatography;Membrane separation;Mass spectrum;Structural identification

中藥活性肽是由中藥中的蛋白質(zhì)、多肽經(jīng)酶解等方法得到的裂解產(chǎn)物。相對(duì)于大分子蛋白質(zhì)、多肽，活性肽相對(duì)分子量主要分布在5 KDa以下，具有活性高、易吸收等特點(diǎn)。目前研究的中藥活性肽一般源于水蛭、土鱉蟲(chóng)、蜈蚣等動(dòng)物類中藥，這些活性肽具有顯著抗凝、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤等藥理作用[1-3]。為了從不同結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等成分中篩選并獲取中藥活性肽，選用適宜的制備分離及鑒定方法尤為重要。本文綜述近年文獻(xiàn)關(guān)于中藥活性肽的制備分離及鑒定研究進(jìn)展，以期為中藥活性肽的進(jìn)一步研究提供參考。

1中藥活性肽的制備

活性肽的制備方法主要包括酶解法、水提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法[4，5]、基因重組法[6]等，目前中藥活性肽的制備方法大多仍為酶解法、水提取法、化學(xué)合成法，微生物發(fā)酵法、基因重組法有待在后期中藥活性肽的制備時(shí)進(jìn)行考察。

1.1酶解法" 活性肽是蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物，酶解法是制備活性肽最常用的方法，其具有高效、專一、安全等特點(diǎn)，利用酶解將活性基團(tuán)暴露，使得活性肽產(chǎn)生多種藥理活性。酶解法常用的酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等，不同種類酶的酶切位點(diǎn)及條件不盡相同，如胃蛋白酶選擇性的切斷由芳香族氨基酸或亮氨酸構(gòu)成的肽鍵，胰蛋白酶選擇性的切斷由賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鍵[7]，不同的酶在不同的酶解條件下獲得的肽在分子量分布、藥理活性等方面存在差異。采用酶解法制備活性肽時(shí)，常需考察酶的種類、酶的用量、溫度、pH等因素。

任堯[8]考察不同酶酶解寬體金線水蛭及東亞鉗蝎分離蛋白所得產(chǎn)物的抗凝血活性，結(jié)果均以堿性蛋白酶組抗凝血活性最高，經(jīng)HPLC測(cè)定酶解產(chǎn)物相對(duì)分子量以小于5 KDa的為主。王世信等[9]采用水煎煮、勻漿、胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解以及仿生酶解等方法對(duì)芪參還五膠囊中地龍、水蛭、全蝎三種蟲(chóng)類藥材進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)采用仿生酶解法酶解時(shí)抗凝血及溶栓活性最高，并以總蛋白得率、抗凝血活性等指標(biāo)進(jìn)一步優(yōu)化酶用量、酶解時(shí)間、藥材粒度，獲得了最佳的酶解工藝。楊丹等[10]以鱉甲肽類組分提取率和ACE抑制率為指標(biāo)優(yōu)選鱉甲酶解所需蛋白酶，發(fā)現(xiàn)采用堿性蛋白酶酶解時(shí)肽類組分提取率和ACE抑制率均最高;另采用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)選堿性蛋白酶酶解鱉甲工藝，發(fā)現(xiàn)影響鱉甲肽類組分提取率的主要因素依次為pH 值、提取溫度、提取時(shí)間。

1.2水提法" 動(dòng)物藥在臨床應(yīng)用時(shí)多以水煎煮或打粉入藥，通過(guò)煎煮使得蛋白質(zhì)或多肽水解，可獲得具有一定生理活性的肽類組分，具有簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)。李水清等[11]以多肽提取量和浸膏得率為指標(biāo)考察鱉甲多肽的水提取工藝，發(fā)現(xiàn)提取次數(shù)對(duì)浸膏得率有顯著性影響，提取時(shí)間及次數(shù)對(duì)鱉甲肽的提取量有顯著性影響，且采用優(yōu)化后的工藝所得鱉甲水提液經(jīng)過(guò)二次超濾，得到相對(duì)分子量lt;8 KDa的多肽純度為57.62%。李晶峰等[12]采用石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水共4種不同極性溶媒提取4種動(dòng)物藥，結(jié)果均以水提取液的活性最強(qiáng)，并且各組分中l(wèi)t;3 KDa的小肽段活性明顯強(qiáng)于蛋白、多肽部。

1.3化學(xué)合成法" 肽的化學(xué)合成法包括液態(tài)和固態(tài)合成法，液態(tài)合成法由于每次接肽后要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化以去除副產(chǎn)物或未反應(yīng)的原料[13]，步驟繁瑣，技術(shù)要求較高，現(xiàn)一般采用固相合成法。固相合成在單個(gè)容器中可完成全部反應(yīng)，偶聯(lián)后可沖洗去除副產(chǎn)物或未反應(yīng)的原料，相對(duì)簡(jiǎn)便快捷，是實(shí)驗(yàn)室制備10～100肽的有效方法[14]，現(xiàn)多以采用Fmoc固相合成法從而使N端α-氨基得到保護(hù)，更好的避免副反應(yīng)的發(fā)生。

歐陽(yáng)小健[15]采用液質(zhì)鑒定和分子對(duì)接技術(shù)篩選得到17條具有潛在抗氧化活性的當(dāng)歸活性肽，采用Fmoc固相合成法合成17條當(dāng)歸活性肽，通過(guò)DPPH法和ABTS法發(fā)現(xiàn)其均具有一定抗氧化能力，其中肽段序列中含有抗氧化氨基酸酪氨酸（Y）的肽具有顯著抗氧化活性。姜珊等[16]采用固相合成法合成土鱉蟲(chóng)活性肽DAVPGAGPAGCHPGAGP（DP17），采用HPLC法檢視合成的DP17純度為99.5%，采用PEP-FOLD3預(yù)測(cè)其肽結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)DP17存在α螺旋和β折疊。董萍萍等[17]經(jīng)前期分離鑒定得到具有調(diào)節(jié)血脂活性的土鱉蟲(chóng)活性肽LAPAPGTL（LL8），采用固相合成法合成后獲得的LL8純度為99.5%，將LL8經(jīng)異硫氰酸熒光素進(jìn)行N段修飾得到FITC-LL8后進(jìn)行大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)高、低劑量的LL8半衰期相近，屬于快速代謝型藥物。

2中藥活性肽的分離純化

2.1膜分離" 膜分離法是利用經(jīng)特殊制造的具有選擇透過(guò)性的薄膜，根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的分子量大小或與薄膜材質(zhì)的親和性差異，在外力（如膜兩側(cè)的壓力差、濃度差、電位差等）推動(dòng)下對(duì)混合物進(jìn)行分離、提純、濃縮而獲得目標(biāo)產(chǎn)品的過(guò)程[18]。常用的膜分離法包括微濾、超濾、納濾、滲析等。

2.1.1超濾法" 超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，其膜的主要材質(zhì)為醋酸纖維素、聚乙烯或其他高分子材料，膜的孔徑一般在1～20 nm，類型有卷式膜、平面膜、中空纖維膜等，其中分子量小于超濾膜截留量的溶質(zhì)可通過(guò)超濾膜，而大分子的溶質(zhì)被截留[19]。由于蛋白質(zhì)、多肽的酶解程度不一，酶解液中活性肽的分子量分布較廣，而發(fā)揮藥理活性的往往是某一分子量段的組分，使用超濾法可達(dá)到分離純化的目的。

在中藥活性肽的分離純化方面，劉慶豐等[20]采用1 KDa、3 KDa卷式超濾膜對(duì)除鹽后的土鱉蟲(chóng)仿生酶解液進(jìn)行分離，其中截留的分子量在1～3 KDa超濾液中肽的含量最高，占70.84%;另通過(guò)對(duì)比超濾所得不同分子量段的活性肽凝膠及其水溶液的累計(jì)滲透率，發(fā)現(xiàn)分子量越小的活性肽透皮性越好。呂行直[21]將壁虎經(jīng)處理后所得醇提物用3 KDa超濾管進(jìn)行低溫離心超濾，獲取分子量小于3 KDa的活性肽部位，采用CCK8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其對(duì)DU 145、Ec 9706等癌細(xì)胞具有明顯抑制作用，后將超濾物采用葡聚糖凝膠G-25及羥丙基葡聚糖LH-20進(jìn)一步分離活性肽。王佳茜等[22]采用3000 Da、1500 Da超濾膜對(duì)地龍酶解脫鹽液進(jìn)行超濾處理，設(shè)定壓力為0.3 Mpa，流速為20 L/h，同時(shí)采用恒容間歇方法進(jìn)行試驗(yàn)，將地龍酶解脫鹽液分離得到分子量lt;1500 Da、1500～3000 Da和gt;3000 Da的3種溶液，纖維平板纖溶試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分子量lt;1500 Da的超濾溶液具有較好的體外纖溶活性?？傊瑸V法操作簡(jiǎn)單、效率高、環(huán)保安全，可將分子量差距較大的活性肽快速分離，一般作為活性肽有效部初步分離，但是超濾膜容易堵塞和污染，需及時(shí)清洗，對(duì)于分子量較為接近的活性肽分離效果不佳，需要結(jié)合柱層析等方法進(jìn)一步分離。

2.1.2納濾法" 納濾（nanofiltration membrane， NF）是一種膜孔徑為1～10 nm的壓力驅(qū)動(dòng)膜，是介于反滲透和超濾之間的壓力驅(qū)動(dòng)膜分離過(guò)程[23]，具有分子篩分效應(yīng)和電荷效應(yīng)兩種機(jī)理，可截留相對(duì)分子量大于200 Da的多價(jià)離子和有機(jī)分子。因此，相對(duì)分子量小于200 Da的單價(jià)離子與有機(jī)小分子會(huì)透過(guò)納濾膜進(jìn)入透過(guò)液，其主要是因納濾膜的表面分離層是由聚電解質(zhì)所構(gòu)成，對(duì)離子有靜電相互作用，所以納濾膜可用來(lái)脫鹽。

蘆鑫等[24]采用NFM納濾膜對(duì)芝麻蛋白胰酶酶解液脫鹽，經(jīng)過(guò)3次納濾除鹽后，除鹽率達(dá)到99%，活性肽的回收率約為98%，表明納濾法對(duì)活性肽具有良好的除鹽效果，且可減少損失活性肽。李華健等[25]采用3 KDa超濾膜和1 KDa納濾膜對(duì)寬體金線水蛭酶解液進(jìn)行分離，獲得分子量gt;3 KDa、1～3 KDa和lt;1 KDa的部位，采用Fibg-TT法測(cè)定抗凝活性發(fā)現(xiàn)分子量lt;1 KDa的活性肽部位活性最好。

膜污染是應(yīng)用納濾膜時(shí)易出現(xiàn)的問(wèn)題[26]。豐桂珍等[27]研究發(fā)現(xiàn)，疏水性大分子有機(jī)物是污染納濾膜的主要物質(zhì)，通過(guò)前期超濾等前處理工藝去除疏水性有機(jī)物，可減輕納濾膜的負(fù)荷，延緩膜污染。

2.1.3電滲析法" 在采用酶解法制備中藥活性肽時(shí)，為使酶活性提高需加入適量的酸、堿調(diào)節(jié)至適宜pH，在這過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量鹽，這些鹽經(jīng)多級(jí)膜過(guò)濾、超濾等環(huán)節(jié)不易除去，進(jìn)而影響下一步的分離純化。電滲析法的原理是：在外加電場(chǎng)的作用下，正負(fù)鹽離子分別被吸附通過(guò)對(duì)應(yīng)的正負(fù)離子交換膜，鹽離子被轉(zhuǎn)移至另一水體中，實(shí)現(xiàn)原液的脫鹽淡化[28]。

于帥等[29]以電導(dǎo)率、除鹽率和肽回收率為指標(biāo)優(yōu)化豬皮仿生酶解液電滲析除鹽工藝，得出酶解液在電壓31 V、流速15 L/h、除鹽時(shí)間2 h、藥液濃度200 mg/ml的條件下進(jìn)行電滲析除鹽效果最好，平均除鹽率為93.58%，且肽回收率達(dá)82.28%。王少平等[30]以脫鹽率、肽損失量、固體物質(zhì)保留量為指標(biāo)，考察DA201-C大孔樹(shù)脂、LSD001串聯(lián)D201-C的陰陽(yáng)離子混合樹(shù)脂、納濾、電滲析4種方法對(duì)土鱉蟲(chóng)酶解液的除鹽工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電滲析除鹽時(shí)肽的損失最小，同時(shí)除鹽率達(dá)到90%以上，優(yōu)化后的除鹽工藝參數(shù)為酶解液pH為6.5、除鹽時(shí)間150 min、藥液濃度為500 mg/ml。

2.2柱層析分離

2.2.1葡聚糖凝膠柱層析" 葡聚糖凝膠柱層析的固定相是具有多孔性三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物，為惰性的珠狀凝膠顆粒，其微孔能吸入大量的溶劑，可溶脹至干體積的多倍[31]。經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠柱層析吸附后，大分子物質(zhì)無(wú)法進(jìn)入顆粒的內(nèi)徑，會(huì)隨流動(dòng)相從凝膠顆粒的間隙中被先洗脫出來(lái)，而小的分子可進(jìn)入凝膠顆粒的內(nèi)部，洗脫路徑較長(zhǎng)，被后洗脫出來(lái)，利用其分子篩作用，可對(duì)蛋白質(zhì)、活性肽、多糖等成分進(jìn)行分離純化，具有作用溫和、方便快捷等特點(diǎn)[32]。

姜麗等[33]依次采用葡聚糖凝膠G-50、G-25柱層析對(duì)蜈蚣胃蛋白酶解物進(jìn)行分離純化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)去離子水洗脫后獲得的F3-3部位具有較好抗凝藥效，將F3-3部位采用C18反向柱色譜分離后經(jīng)MALDI-TOF-MS分析發(fā)現(xiàn)，活性部位為分子量為lt;1 KDa的小分子活性肽。王少平等[34]考察Sephadex G-15、Sephadex G-25對(duì)雄土鱉蟲(chóng)仿生酶解液過(guò)DA201-C大孔樹(shù)脂50%乙醇洗部位的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sephadex G-15對(duì)該洗脫部位分離效果較差，Sephadex G-25可將該洗脫部位明顯分為P1、P2、P3共3個(gè)峰，進(jìn)一步通過(guò)體外溶栓實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P2、P3組分的抗凝活性和溶栓活性都比P1組分要強(qiáng)。

由于中藥活性肽的分子量一般在10 KDa以下，目前已報(bào)道的研究中多采用G-50（分離范圍1 K～30 KDa）、G-25（分離范圍1 K～5 KDa）、G-15（分離范圍lt;1500 Da）3種規(guī)格葡聚糖凝膠柱層析進(jìn)行活性肽的分離純化。在使用葡聚糖凝膠柱層析分離活性肽時(shí)，適當(dāng)增加層析柱的長(zhǎng)度可明顯改善分離效果，另外在收集洗脫液時(shí)，適當(dāng)減小每收集管的洗脫體積也可達(dá)到更好的分離效果。

2.2.2大孔吸附樹(shù)脂柱層析" 大孔吸附樹(shù)脂對(duì)蛋白質(zhì)、活性肽、黃酮等有著良好的分離效果，具有吸附量大、使用條件溫和、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，近年來(lái)在生物活性肽的分離純化中已廣泛應(yīng)用[35-38]。

在中藥活性肽分離純化應(yīng)用方面，魏芳等[39]考察AB-8、DA201-C、DA-201C和D101共4種不同規(guī)格大孔樹(shù)脂對(duì)阿膠低聚肽的脫苦效果，通過(guò)考察大孔樹(shù)脂的吸附量和解吸量，發(fā)現(xiàn)DA201-C型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)阿膠低聚肽的分離效果最好，采用25%的乙醇洗脫后收集的組分苦味較分離前顯著降低，考慮其原因?yàn)?5%乙醇洗脫時(shí)引起苦味的疏水性氨基酸解吸率最低。王佳茜等[40]考察DA201-C、AB-8、D101共3種大孔樹(shù)脂對(duì)地龍雙酶酶解液的吸附率，結(jié)果以DA201-C大孔樹(shù)脂的吸附率最高，通過(guò)靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附考察進(jìn)一步優(yōu)化上樣濃度、pH、上樣速度、吸附時(shí)間，有效成分的吸附率接近90%。

需要注意的是，大孔樹(shù)脂在使用前內(nèi)部常存在甲苯、苯乙烯等未聚合的致孔劑、引發(fā)劑，影響活性物質(zhì)分離效果及安全性[41]。因此，在使用前必須經(jīng)廠家推薦的預(yù)處理方式以去除內(nèi)部殘留物志，反復(fù)使用大孔樹(shù)脂后常會(huì)導(dǎo)致層析柱顏色變深柱效降低，需要經(jīng)再生處理后才能繼續(xù)使用。

2.2.3離子交換樹(shù)脂柱層析" 活性肽樣品一般為多種肽的混合物，因不同肽的等電點(diǎn)不盡相同使得其電荷性不同，離子交換色譜可將活性肽樣品帶電荷離子與離子交換色譜固定相中帶相反電荷的基團(tuán)結(jié)合，然后通過(guò)不同離子強(qiáng)度或pH的洗脫液洗脫，活性肽會(huì)由于電荷性差異被先后洗脫下來(lái)，從而達(dá)到分離純化的目的[42]。根據(jù)離子交換柱固定相的不同，可分為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和陰離子交換樹(shù)脂。

李開(kāi)等[43]采用DEAE Sepharose Fast Flow對(duì)薏苡仁谷蛋白酶解液3 KDa以下超濾組分進(jìn)行分離，采用0～0.2 mol/L濃度梯度的NaCl-二乙醇胺緩沖液進(jìn)行洗脫后獲得7個(gè)洗脫組分，以0.02 mol/L NaCl洗脫獲得的A2組分ACE抑制活性最高。宋曉光等[44]通過(guò)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，水蛭素的碳端富含酸性氨基酸殘基，是其產(chǎn)生抗凝活性的關(guān)鍵因素，在分離水蛭肽時(shí)將前期分離得到的活性肽溶液調(diào)pH至4，采用D201陰離子樹(shù)脂對(duì)水蛭活性肽進(jìn)行分離，結(jié)果以含2.5%氯化鈉的25%乙醇溶液、含2.5%氯化鈉的50%乙醇溶液進(jìn)行洗脫所得活性肽的得率及抗凝活性較高。

離子交換色譜可保留多肽的生物活性，通常與凝膠過(guò)濾色譜聯(lián)用會(huì)達(dá)到比較理想的分離效果，但選取合適的離子交換柱，探明合適的洗脫條件比較繁瑣。

2.2.4反相高效液相柱層析" 反相高效液相柱層析也稱反相高效液相色譜法，是分離活性肽的常用方法。活性肽中存在弱極性的組分可與十八烷基鍵合硅膠等非極性固定相結(jié)合，采用不同極性的洗脫液進(jìn)行洗脫時(shí)，不同極性活性肽與固定相的結(jié)合力不同，使得活性肽被先后洗脫出來(lái)，從而達(dá)到分離目的[45]。

程瓊[46]利用鹽析法獲得牛膝多肽混合物ABPP，采用半制備型C18反相柱層析進(jìn)行梯度洗脫分離牛膝多肽，制備其二級(jí)組分，獲得了12個(gè)多肽組分;且其體外活性試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，ABPPk組分具有顯著促神經(jīng)元生長(zhǎng)和抗氧糖剝奪損傷的作用。周怡君等[47]將前期獲得的鹿角盤(pán)總蛋白采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）進(jìn)行梯度洗脫，得到5個(gè)分離峰組分，獲得的目標(biāo)活性肽經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量為4543.14，采用質(zhì)譜分析并鑒定該活性肽的氨基酸序列為EAVLRAVDQFNKR。

反相高效液相柱層析分離分辨率高、靈敏度高、分離效果好，但分離設(shè)備較為昂貴，上樣分離量較小，不適合大規(guī)模分離制備活性肽，另外對(duì)于極性較大的小分子活性肽由于吸附性較弱，其真分離效果欠佳。

2.3電泳法" 活性肽組分常帶有不同的電離基團(tuán)，分子量分布較廣，在某個(gè)pH下會(huì)帶正電或負(fù)電，在電場(chǎng)作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動(dòng)，進(jìn)而達(dá)到分離的效果。

活性肽常用的電泳分離法有聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）、三羥甲基氨基甘氨酸凝膠電泳法（Tricine-SDS-PAGE），曲穎等[48]分別采用SDS-PAGE法和Tricine-SDS-PAGE法分離壁虎活性肽，發(fā)現(xiàn)Tricine-SDS-PAGE法能分離獲得的條帶數(shù)量明顯多于SDS-PAGE法，說(shuō)明Tricine-SDS-PAGE法更適合小分子活性肽的分離。

電泳技術(shù)分離效果好、分離速度快、選擇性強(qiáng)，其單獨(dú)使用或與其它分離方法一同使用均有良好的分離效果，但可能導(dǎo)致多肽活性喪失[49]。

2.4其他處理方法" 天龍經(jīng)仿生酶解后獲得具有抗腫瘤活性的活性肽[50]，然而天龍藥材中含有大量的油脂，影響活性肽的進(jìn)一步分離純化。馬睿等[51]采用固體石蠟法對(duì)天龍酶解液進(jìn)行脫脂處理，發(fā)現(xiàn)具有良好的脫脂效果且有效成分損失較少，可為動(dòng)物藥酶解液的脫脂提供參考。

3中藥活性肽的鑒定

中藥活性肽的鑒定主要包含活性肽的氨基酸序列、相對(duì)分子量大小以及結(jié)構(gòu)分析等，當(dāng)前中藥活性肽鑒定方法有質(zhì)譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、紅外光譜法以及核磁共振法等，以質(zhì)譜法及液質(zhì)聯(lián)用法較為常用。

3.1質(zhì)譜法" 質(zhì)譜法（mass spectrometry， MS）是利用質(zhì)譜儀將活性肽、蛋白質(zhì)等組分電離生成不同荷質(zhì)比的離子，然后按其質(zhì)荷比的不同對(duì)成分和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的方法，具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。質(zhì)譜圖的精準(zhǔn)度是活性肽鑒定的關(guān)鍵，近年來(lái)電噴霧技術(shù)（ESI-MS）和基質(zhì)輔助激光解吸技術(shù)（MALDI-TOF-MS）在中藥活性肽的鑒定中應(yīng)用較多。

常規(guī)離子化方法容易將一些完整大分子解離為碎片，而MALDI-TOF-MS是一種溫和離子化技術(shù)，可以得到完整大分子質(zhì)譜信息，是目前活性肽分析鑒定的常用工具，其原理為基質(zhì)吸收光子后產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)移到活性肽樣品，樣品瞬間氣化后形成帶單一電荷的活性肽離子，離子進(jìn)入飛行時(shí)間質(zhì)量分析儀形成質(zhì)譜圖，進(jìn)而可快速準(zhǔn)確的分析活性肽的相對(duì)分子質(zhì)量和氨基酸序列[52]。姜珊等[16]采用MALDI-TOF/TOF 輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)土鱉蟲(chóng)降脂活性肽進(jìn)行氨基酸序列分析，經(jīng)一級(jí)質(zhì)譜分離后選擇高信號(hào)的肽段離子分析其二級(jí)質(zhì)譜，經(jīng)過(guò)分析肽序列為DAVPGAGPAGCHPGAGP（DP17）。侯會(huì)會(huì)[53]通過(guò)MALDI-TOF-MS對(duì)菲牛蛭抗凝血活性肽進(jìn)行鑒定，經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)其m/z有兩個(gè)顯著的峰為525.264和569.3，確定該活性肽為一種寡肽。

電噴霧質(zhì)譜法（ESI-MS）是一種軟電離質(zhì)譜技術(shù)，可直接分析溶液樣品，由于它不像電子轟擊（EI）、化學(xué)電離（CI）等常規(guī)電離技術(shù)存在樣品加熱汽化的過(guò)程，因此比較適合分析活性肽一類強(qiáng)極性、難揮發(fā)或熱不穩(wěn)定的化合物。魏瑋[54]采用反向高效液相法將經(jīng)葡聚糖凝膠G-15分離的地龍蛋白肽活性組分進(jìn)一步分離，得到最佳抗凝血活性組分，使用ESI-MS/MS對(duì)該組分進(jìn)行檢測(cè)，采用denovo從頭測(cè)序法對(duì)組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，得到3條相對(duì)分子量lt;1 KDa的活性肽序列。

3.2液質(zhì)聯(lián)用法" 李彥超等[55]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UFLC-MS/MS）法分析蜈蚣3種經(jīng)酶解后獲得的特征性活性肽類成分TD1（LEEDLERSEERL）、TD2（EEKDKALQNAEGEVAAL）、TD3（MILPTGASSF），以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）建立了3種特征活性肽的檢測(cè)分析方法，可與水蛭、土鱉蟲(chóng)、全蝎等活性肽區(qū)分，并且可與非藥典品蜈蚣所得活性肽組分進(jìn)行區(qū)分。熊莎[56]采用HPLC-TOF-MS對(duì)前期篩選的鱉甲最佳抗肝纖維化活性肽相對(duì)分子量lt;1 KDa的組分進(jìn)行鑒定，先將組分采用C18小柱進(jìn)行除鹽，采用HPLC進(jìn)行梯度洗脫，TOF-MS進(jìn)行數(shù)據(jù)采集分析，將質(zhì)譜產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)采用MASCOT蛋白鑒定軟件進(jìn)行分析，檢索NCBI中龜鱉類Chelonia蛋白庫(kù)，經(jīng)鑒定得到了110個(gè)肽類化合物的結(jié)構(gòu)。

3.3紅外光譜法" 蛋白質(zhì)及活性肽中存在羰基、氨基、羧基等特征基團(tuán)，此類基團(tuán)在紅外光譜中存在特征吸收帶，紅外光譜可通過(guò)特征基團(tuán)的伸縮振動(dòng)來(lái)推測(cè)組分中含有的基團(tuán)及二級(jí)結(jié)構(gòu)。史浩川等[57]采用傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）溴化鉀壓片法對(duì)蜂毒肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)蜂毒肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要呈現(xiàn)α-螺旋并有部分彎曲，表明在純化過(guò)程中其二級(jí)結(jié)構(gòu)未受到破壞，猜測(cè)其仍保留生物活性。馮曉梅等[58]以紅外光譜測(cè)定前期分離所得牡蠣多肽結(jié)構(gòu)，紅外譜圖顯示反式吸收（1514.69 cm-1）強(qiáng)于順式吸收（1417.66 cm-1），說(shuō)明該肽鏈?zhǔn)且驭?螺旋的構(gòu)型存在。

4總結(jié)

諸多富含蛋白質(zhì)及多肽的中藥在抗凝血、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤等方面存在顯著的藥理活性，多項(xiàng)研究已表明活性肽是其主要藥效物質(zhì)，但由于活性肽組分在結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)及分子量分布等方面接近，選擇適宜的制備分離手段獲取目標(biāo)活性肽尤為重要?，F(xiàn)階段已通過(guò)酶解、膜分離、柱層析等方法結(jié)合藥理試驗(yàn)篩選得到土鱉蟲(chóng)降脂、水蛭抗凝血、天龍抗腫瘤等活性肽，但其制備分離工藝普遍較為繁瑣且大多處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，因此有必要進(jìn)一步考察更為高效、低成本、自動(dòng)化的制備分離手段以滿足產(chǎn)業(yè)化需求。另外，由于中藥成分的復(fù)雜性及在臨床治療的整體性，中藥活性肽有可能通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑來(lái)發(fā)揮藥理作用，在研究時(shí)應(yīng)盡量避免片面追求分離獲得單體活性肽，以藥理及臨床療效為基礎(chǔ)，在“安全、有效、穩(wěn)定”的前提下，分離、制備中藥活性肽有效部位具有一定的研究意義。

目前獲得的活性肽大多以體外活性篩選獲得，對(duì)于其作用機(jī)制研究尚不夠深入，有待進(jìn)一步考察其在動(dòng)物乃至人體內(nèi)的藥理活性及安全性。在中藥活性肽的構(gòu)效關(guān)系研究方面，堿性氨基酸、芳香氨基酸、疏水性氨基酸在肽序列中的數(shù)量以及所處的位置對(duì)于活性有何影響值得進(jìn)一步研究。雖然中藥活性肽的開(kāi)發(fā)還存在一些問(wèn)題，但隨著相關(guān)研究的不斷深入以及制備分離、鑒定新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)及成熟，中藥活性肽的開(kāi)發(fā)具有廣闊的發(fā)展前景。

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