中國南方沿海13種石斑魚類的分子系統(tǒng)進化關系分析*

陳興漢，郭 梁，李明明，蒙子寧，林浩然

(1. 陽江職業(yè)技術學院生命科學與技術系，廣東 陽江 529566；2. 中山大學水生經(jīng)濟動物研究所暨廣東省水生經(jīng)濟動物良種繁育重點實驗室，廣東 廣州 510275)

石斑魚類在分類學上隸屬于鱸形目(Perciformes)、鱸亞目(Percoidei)、鮨科(Serranidae)、石斑魚亞科(Epinephelinae)。俗稱的石斑魚是石斑魚亞科魚類的統(tǒng)稱。石斑魚除少數(shù)種類生活在河口，多數(shù)棲息于熱帶或亞熱帶的珊瑚礁水域，主要以小型魚類、底棲甲殼類和頭足類等為食，是珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的主要掠食者[1]。石斑魚為世界性名貴海產(chǎn)經(jīng)濟魚類，也是我國南方沿海省份(廣東、海南、福建、廣西)重要的海水增養(yǎng)殖對象。然而近年來受過度捕撈、養(yǎng)殖群體近親繁殖、珊瑚礁破壞、海洋環(huán)境污染等因素影響，加之石斑魚本身有性逆轉的特性，致使資源日漸衰退，部分種類已被國際自然保護聯(lián)盟(IUCN, International Union for Conservation of Nature)列為瀕危或近危[2]。

石斑魚除資源狀況堪憂外，還存在著種類鑒定上的難題[3]。石斑魚的種類較多，全世界范圍內(nèi)已記錄的有100多種，我國已記錄的有50多種。石斑魚的種類鑒定通常是根據(jù)體色、身體和頭部形態(tài)、鰭的結構和數(shù)量[1]，而進一步的系統(tǒng)進化研究則主要是依據(jù)一些骨學特征以及幼體發(fā)育過程中仔魚的形態(tài)特征[4-7]。然而，由于石斑魚種類繁多、形態(tài)特征類似且體色和斑紋多變，因此，僅依據(jù)這些形態(tài)特征往往難以準確的鑒別，并導致了石斑魚分類學上的混淆以及重建進化關系研究上的困難，至今石斑魚的分類依然是魚類分類學的難題。目前依據(jù)Nelson[8]的魚類分類系統(tǒng)，將鮨科分為鮨亞科、花鱸亞科和石斑魚亞科3個亞科，共63屬449種。其中石斑魚亞科又可細分為5個族：石斑魚族、東洋鱸族、鱸族、長鱸族和黃魚族。

近年來分子生物學的快速發(fā)展，使得在分子水平上進行魚類的分類鑒定和系統(tǒng)進化研究成為現(xiàn)實。分子系統(tǒng)學(Molecular Phylogeny)通過檢測生物大分子的遺傳信息，因其含有信息量大，且趨同效應弱，因而其結論相對于經(jīng)典的形態(tài)系統(tǒng)分類更具客觀性和可比性。其中線粒體DNA由于其結構簡單、無重組、多數(shù)母性遺傳等特點，已成為群體遺傳分析和系統(tǒng)進化研究的有力工具[9-11]。線粒體特定基因序列分析，已經(jīng)成功的應用于許多種魚類系統(tǒng)進化的研究，如圓罩魚(Cyclothone)、南乳魚(Galaxias)、突吻鱈(Coryphaenoides)等[12-14]。Craig等[15]最先研究報道了南北美洲42種石斑魚類的分子系統(tǒng)進化關系。國內(nèi)學者僅見丁少雄等[16]針對中國近海30種石斑魚類，進行了基于16S rDNA的分子系統(tǒng)進化研究。

文章中應用線粒體細胞色素b基因(Cyt b)以及兩個核糖體RNA基因(16S和12S)序列對中國近海石斑魚亞科的3個屬：石斑魚屬(Epinephelus)、九棘鱸屬(Cephalopholis)和鰓棘鱸屬(Plectropomus)共13個種的種類鑒定及親緣關系進行分析，采用了線粒體基因組不同區(qū)域的多組序列數(shù)據(jù)(Cyt b、16S rRNA、12S rRNA)的聯(lián)合分析，聯(lián)合構建系統(tǒng)進化樹，以探討石斑魚類的分子系統(tǒng)進化關系。

1 材料和方法

1.1 材料

文章中的石斑魚亞科3個屬13個種共61個個體為采自中國南方沿海省份廣東(廣州、深圳、珠海、惠州、湛江)和海南(?？?沿海的科研基地、養(yǎng)殖場和鮮魚市場(見表1)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 剪取魚體尾部組織約50 mg，參照Sambrook等[17]方法進行基因組DNA提取。

1.2.2 線粒體Cyt b、16S rRNA以及12S rRNA基因擴增及測序 所用引物序列見表2(上海生工合成)。PCR反應總體積為25 μL，包括2.0 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，0.2 μmol/L每種引物，1 U Taq plus DNA聚合酶(MBI)，1×Taq 聚合酶緩沖液以及30 ng基因組DNA。反應條件為94 ℃預變性2 min后經(jīng)過30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃ 45 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用UNIQ-5(上海生工)柱式純化試劑盒純化后，在ABI377型自動測序儀(PE)上進行雙向測序。

1.2.3 序列分析 采用DNAStar軟件中的SeqMan程序?qū)y序所得到的正向序列和反向序列進行拼接，使用Clustalx1.8進行對位排序，應用Genedoc軟件進行人工校正。用DNASP3.51軟件計算變異位點、簡約信息位點數(shù)、核苷酸多樣性、平均核苷酸差異數(shù)、種間平均每位點核苷酸替代數(shù)。

表1 樣品來源Table1 Origin of the samples

表2 引物及其序列Table 2 Primers and their sequences

1.2.4 聚類分析 利用MEGA3.1軟件并根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型計算遺傳距離，對3段基因序列分別構建鄰接(Neighbor-joining，NJ)和最大簡約(Maximum-parsimony，MP)系統(tǒng)樹，之后用3段基因序列的聯(lián)合基因序列(Combined genes)構建 NJ 和 MP 系統(tǒng)樹，采用Bootstrap1000檢驗分枝的置信值。

2 結 果

2.1 序列及變異

測序所得13種石斑魚類的Cyt b基因片段長423 bp，無插入和缺失，轉換/顛換之比為 2.5。共存在25種單倍型序列，序列間共有153個變異位點，其中簡約信息位點139個。核苷酸多樣性指數(shù)為0.14，平均核苷酸差異數(shù)達59.84(表3)。從種內(nèi)變異來看，序列差異較小。青石斑魚、黑邊石斑魚、鮭點石斑魚、布氏石斑魚、棕斑石斑魚和斑鰓棘鱸種內(nèi)序列相同，其余石斑魚種內(nèi)存在變異位點1～8個(表4)。

去除7個插入/缺失，測序所得13種石斑魚類的16S rRNA基因片段長592 bp，轉換/顛換之比為 2.2。共存在21種單倍型序列，序列間共有139個變異位點，其中簡約信息位點119個。核苷酸多樣性指數(shù)為0.08，平均核苷酸差異數(shù)達46.62(表3)。種內(nèi)序列差異較小，青石斑魚、鮭點石斑魚、布氏石斑魚、棕斑石斑魚、紅九棘鱸和斑鰓棘鱸種內(nèi)序列相同，其余石斑魚種內(nèi)存在變異位點1～3個(表4)。

13種石斑魚類的12S rRNA基因片段存在5個插入/缺失，去除后為434 bp，轉換/顛換之比為 2.2。共存在14種單倍型序列，序列間共有87個變異位點，其中簡約信息位點70個。核苷酸多樣性指數(shù)為0.08，平均核苷酸差異數(shù)達34.74(表3)。種內(nèi)變異極小(變異位點1個、單倍型序列14種)，除豹紋鰓棘鱸種內(nèi)存在1個位點差異外，其余石斑魚種內(nèi)序列相同(表4)。

表3 13種石斑魚類線粒體基因序列的遺傳信息指數(shù)Table 3 Genetic informative indices of the mitochondrial genes of 13 Epinepheline species

表4 13種石斑魚類的種內(nèi)遺傳差異Table 4 Intraspecies genetic variations of 13 Epinepheline species

2.2 聚類分析

從屬水平來看，線粒體3個基因以及聯(lián)合基因序列計算的遺傳距離均為石斑魚屬與九棘鱸屬的最小，與鰓棘鱸屬的最大，表明石斑魚屬與九棘鱸屬有較近的親緣關系(表5)。

從種水平來看，不同基因序列得出的種間遺傳距離不同：13種石斑魚類種間遺傳距離最大的分別為黑邊石斑魚與斑鰓棘鱸(Cyt b、聯(lián)合基因)、棕斑石斑魚與斑鰓棘鱸(16S)、鮭點石斑魚與斑鰓棘鱸(12S)；最小的分別為豹紋鰓棘鱸與斑鰓棘鱸(Cyt b、12S、聯(lián)合基因)、赤點石斑魚與青石斑魚(16S)(表6)。

另一方面，就石斑魚屬9個種而言，遺傳距離最大的為鞍帶石斑魚與青石斑魚(Cyt b)、鞍帶石斑魚與黑邊石斑魚(16S、聯(lián)合基因)、褐點石斑魚與黑邊石斑魚(12S)；遺傳距離最小的均為赤點石斑魚與青石斑魚。

根據(jù)線粒體Cyt b基因序列構建NJ和MP系統(tǒng)樹(圖1)，均表明13種石斑魚類分別按所屬的石斑魚屬、九棘鱸屬和鰓棘鱸屬各自聚類，形成3個單系的聚類群。石斑魚屬與九棘鱸屬親緣關系較近，首先聚類；鰓棘鱸處于系統(tǒng)樹的最基部。在NJ系統(tǒng)樹，石斑魚屬形成兩個聚類群(為方便描述起見，簡稱為A群和B群)，A群由赤點石斑魚、青石斑魚、黑邊石斑魚、蜂巢石斑魚、鮭點石斑魚以及布氏石斑魚組成，B群則包含褐點石斑魚、鞍帶石斑魚、斜帶石斑魚以及棕斑石斑魚。MP系統(tǒng)樹支持了B群的聚類，而A群中的種類則表現(xiàn)為階梯式的姐妹枝。在兩種系統(tǒng)樹中，兩兩相聚且有相對較高的置信值(>50)有：赤點石斑魚和青石斑魚、蜂巢石斑魚與鮭點石斑魚、斜帶石斑魚與棕斑石斑魚，表明它們具有較近的親緣關系。

表5 13種石斑魚類屬間的遺傳距離Table 5 Intergeneric genetic distance of 13 Epinepheline species

a．Intergeneric genetic distance——Cyt b

ECPE―――C0.10577―――P0.164280.16270―――

b．Intergeneric genetic distance——16S

ECPE―――C0.06768―――P0.141620.11340―――

c．Intergeneric genetic distance——12S

ECPE―――C0.11570―――P0.176400.15820―――

d．Intergeneric genetic distance——combined genes

(注: E=Epinephelus，C=Cephalopholis，P=Plectropomus)

表6 13種石斑魚類種間的遺傳距離Table 6 Interspecies genetic distance of 13 Epinepheline species

a．Interspecies genetic distance——Cyt b

種名E.lanceolatusE.corallicolaE.fuscoguttatusE.merraE.longispinisE.akaaraE.awoaraE.fasciatusE.bleekeriE.coioidesC.sonneratiP.leopardusE.lanceolatus―――E.corallicola0.03843―――E.fuscoguttatus0.045680.02937―――E.merra0.071780.054810.06021―――E.longispinis0.062320.049180.056540.02589―――E.akaara0.056750.040100.045510.029480.02412―――E.awoara0.058720.043790.047400.031230.029480.01022―――E.fasciatus0.081510.067860.067770.062320.051150.043850.04208―――E.bleekeri0.060360.049130.049080.045560.040140.029400.034820.05683―――E.coioides0.047590.031270.040140.047290.040060.031120.029370.058410.04729―――C.sonnerati0.106410.102480.096150.114470.110490.098450.098570.125210.098240.10046―――P.leopardus0.154740.170370.159110.170030.165420.170030.167960.174520.161460.158960.16163―――

b．Interspecies genetic distance——16S

種名E.awoaraE.akaaraE.bleekeriE.fasciatusE.merraE.longispinisE.fuscoguttatusE.coioidesE.lanceolatusE.corallicolaC.sonneratiP.leopardusE.awoara―――E.akaara0.01871―――E.bleekeri0.050470.03813―――E.fasciatus0.050310.040470.05031―――E.merra0.037940.028280.043020.04525―――E.longispinis0.057900.047950.058100.055210.02354―――E.fuscoguttatus0.073730.063250.076080.086470.076230.07874―――E.coioides0.070820.065610.078470.078230.068100.067990.03320―――E.lanceolatus0.078600.068100.080990.078130.075830.075710.040530.03560―――E.corallicola0.073320.065510.078340.070490.073200.073090.038060.028280.02833―――C.sonnerati0.080990.075710.083650.083200.078230.086060.052910.047870.042820.04531―――P.leopardus0.149610.140370.158130.151350.157470.163260.117900.129200.117770.123370.11248―――

c．Interspecies genetic distance——12S

種名E.lanceolatusE.fuscoguttatusE.coioidesE.corallicolaE.akaaraE.awoaraE.fasciatusE.bleekeriE.merraE.longispinisC.sonneratiP.leopardusE.lanceolatus―――E.fuscoguttatus0.06490―――E.coioides0.070370.06183―――E.corallicola0.065090.058080.05050―――E.akaara0.088420.072570.074070.08216―――E.awoara0.100740.078910.070930.087000.03783―――E.fasciatus0.109940.099410.100230.097810.079660.07561―――E.bleekeri0.090610.077910.085010.083530.058850.065750.08362―――E.merra0.100450.081260.080210.093360.059550.062500.089090.06720―――E.longispinis0.090610.078070.083400.079540.062570.075020.085140.068760.04832―――C.sonnerati0.111000.102780.105420.111290.115280.114440.141490.111780.122630.12093―――P.leopardus0.162540.158470.165420.167420.179860.178300.183020.172700.182300.183090.15330―――

d．Intergeneric genetic distance——combined genes

圖1 基于13種石斑魚類Cyt b基因序列的NJ和MP系統(tǒng)樹Fig.1 NJ and MP phylogenetic trees based on Cyt b gene sequences of 13 Epinepheline species

基于16S和12S rRNA基因序列構建的NJ和MP系統(tǒng)樹(圖2，3)的拓撲結構與線粒體Cyt b基因的相似，如13個種各自按所屬聚類形成3個單系群，三個屬在系統(tǒng)樹所處的位置以及石斑魚屬形成的兩個聚類群等。不同之處在于石斑魚屬中一些種所處的位置，如在16S-NJ系統(tǒng)樹中，斜帶石斑魚與A群相聚(而在Cyt b/12S-NJ系統(tǒng)樹中斜帶石斑魚歸類于B群)；此外16S和12S-MP系統(tǒng)樹支持的是A群的聚類，而B群中的種類則表現(xiàn)為階梯式的姐妹枝；16S和12S系統(tǒng)樹均不支持斜帶石斑魚與棕斑石斑魚具有較近的親緣關系。

圖3 基于13種石斑魚類12S rRNA基因序列的NJ和MP系統(tǒng)樹Fig.3 NJ and MP phylogenetic trees based on 12S rRNA gene sequences of 13 Epinepheline species

相比較與上述單個基因所構建的系統(tǒng)樹，聯(lián)合基因序列的系統(tǒng)樹明顯具有更好的一致性(NJ和MP的拓撲結構基本一致)和更高的置信度(系統(tǒng)樹分枝的置信值高)(圖4)。聯(lián)合基因系統(tǒng)樹不僅支持13個種各自按所屬聚類形成3個單系群以及3個屬在系統(tǒng)樹所處的位置，而且以極高的置信值(100)支持石斑魚屬的兩個聚類群。此外它還支持了Cyt b系統(tǒng)樹分析得到的赤點石斑魚和青石斑魚、蜂巢石斑魚與鮭點石斑魚、斜帶石斑魚與棕斑石斑魚具有較近的親緣關系的結論。

圖4 基于13種石斑魚類聯(lián)合基因序列的NJ和MP系統(tǒng)樹Fig.4 NJ and MP phylogenetic trees based on combined gene sequences of 13 Epinepheline species

3 討 論

3.1 線粒體基因序列變異與石斑魚類的種類鑒定

準確鑒定石斑魚類的種類是進一步研究其分類關系和系統(tǒng)演化過程的基礎；在生產(chǎn)實踐中，對石斑魚類的產(chǎn)品交易、魚類自然資源的保護和利用也有著重要的意義。魚類分類學家Heemstra和Randall[1]在編著的《Groupers of the world》引言的第一段即指出：“準確種類鑒定的重要性對于每一個生物學家是顯而易見的，將得到養(yǎng)殖者和分類學家的重視，同時對正確管理該物種的漁業(yè)資源也極為重要”。然而，由于石斑魚類的種類繁多、形態(tài)類似、體色易變等，使得基于形態(tài)特征的傳統(tǒng)種類鑒定較為復雜困難，并出現(xiàn)了許多鑒定錯誤的事例。分子標記(如線粒體基因序列)反映的是物種內(nèi)在的遺傳差異，不受外在形態(tài)的影響，故已經(jīng)成為魚類種類鑒定的有力工具[18-19]。

文章中對13種石斑魚類的線粒體Cyt b、16S rRNA以及12S rRNA基因的部分片段進行了擴增和測序，結果表明：石斑魚類種間基因序列存在較大的變異，如Cyt b基因片段的變異位點高達153個，更為保守的rRNA基因也存在139(16S)和88(12S)個變異位點；另一方面，13種石斑魚類種內(nèi)基因序列的變異較小，在Cyt b和16S rRNA基因中均有近半數(shù)(6～7種)石斑魚類種內(nèi)序列完全相同，而其余種類通常只有1～3個變異位點。12S rRNA基因種內(nèi)變異極小，除一種石斑魚(豹紋鰓棘鱸)種內(nèi)存在1個位點差異外，其余石斑魚種內(nèi)序列相同。顯然，種間較大的遺傳差異以及極小的種內(nèi)變異使得這些線粒體基因十分適合用于石斑魚類的鑒定。通過線粒體基因的變異位點，就可以非常準確的鑒別這13種石斑魚類。

通過計算變異位點數(shù)、簡約信息位點數(shù)、核苷酸多樣性、平均核苷酸差異數(shù)等遺傳信息指數(shù)，可知12S基因的保守性最大，16S次之，而Cyt b基因保守性最小。Cyt b基因相對較小的保守性使其能提供更多用于種類鑒定的變異位點，因而作為鑒定標記較rRNA基因更為準確。但這并不表明保守性越小的基因就更適合用于石斑魚類的種類鑒定。

3.2 13種石斑魚類的系統(tǒng)進化及親緣關系分析

近年來，許多魚類學者已經(jīng)從單純的分類區(qū)系研究轉向魚類系統(tǒng)進化方面。他們綜合利用形態(tài)學、生物化學、分子生物學等方法來辨別和分析祖征和離征，藉以探求魚類系譜，探索共同起源，真正反映出彼此間的親緣關系[20]。

文章中根據(jù)所測定的13種石斑魚類的線粒體Cyt b、16S rRNA以及12S rRNA基因的部分片段，計算遺傳距離并構建NJ和MP系統(tǒng)樹進行親緣關系分析。結果表明，3個基因構建的系統(tǒng)樹拓撲結構大體一致，如石斑魚屬、九棘鱸屬和鰓棘鱸屬在系統(tǒng)樹所處的位置以及石斑魚屬形成的兩個聚類群等。但在石斑魚屬中，一些種類在系統(tǒng)樹中所處的位置隨基因的不同或建樹方法的不同而改變，且分枝節(jié)點的置信值較低。

單個基因(特別是保守性較高的基因)能提供的遺傳信息往往較為有限[21]。在無其它背景資料的情況下，為了獲得較為客觀的系統(tǒng)樹，不少學者主張線粒體基因組不同區(qū)域的多組序列數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析[22]。Miller 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，多基因聯(lián)合比單獨進行分析得到的系統(tǒng)樹分辨率及置信值更高，且被形態(tài)性狀所支持，即使基因間的進化速率差異較大。隨后更多研究發(fā)現(xiàn)同樣現(xiàn)象，支持了將同一樣本所有具有系統(tǒng)發(fā)育信息的基因合并在一起進行分析，可以獲得更真實系統(tǒng)進化關系[24-25]。

文章中將所測序的線粒體3個基因進行聯(lián)合分析。相比較單個基因，聯(lián)合基因序列構建的系統(tǒng)樹明顯具有更好的一致性(NJ和MP的拓撲結構基本一致)和更高的置信度(系統(tǒng)樹分枝的置信值高)。結合本文的結果與上述其他學者的研究結果，作者認為基因聯(lián)合分析所得到的石斑魚類系統(tǒng)進化關系可信度更高，現(xiàn)描述如下：13種石斑魚類分別按所屬的石斑魚屬、九棘鱸屬和鰓棘鱸屬各自聚類，形成3個單系的聚類群。石斑魚屬與九棘鱸屬親緣關系較近，首先聚類。石斑魚屬處于系統(tǒng)樹的頂端，表明其最近分化的進化地位；鰓棘鱸處于系統(tǒng)樹的最基部，表明其為較為原始的種類。石斑魚屬形成兩個聚類群，一枝由赤點石斑魚、青石斑魚、黑邊石斑魚、蜂巢石斑魚、鮭點石斑魚以及布氏石斑魚組成，另一枝則包含褐點石斑魚、鞍帶石斑魚、斜帶石斑魚以及棕斑石斑魚。其中，赤點石斑魚和青石斑魚、蜂巢石斑魚與鮭點石斑魚、斜帶石斑魚與棕斑石斑魚兩兩相聚且有相對較高的置信值，表明它們具有較近的親緣關系。

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