基于UFLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)的鹽酸克林霉素棕櫚酸酯分散片雜質(zhì)的研究*

黃 昕，張 超，周翠蘭，鄒 威，蘇薇薇，彭 維

(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州510275；2.廣州一品紅制藥有限公司，廣東 廣州510760)

鹽酸克林霉素棕櫚酸酯，化學(xué)名為6-(1-甲基-反-4-丙基-L-2-吡咯烷甲酰氨基)-1-硫代-7(S)-氯-6,7,8三脫氧-L-蘇氏-α-D-半乳辛吡喃糖苷-2-棕櫚酸酯鹽酸鹽，是克林霉素的衍生物，體外無抗菌活性，在體內(nèi)經(jīng)酯酶水解形成克林霉素而發(fā)揮抗菌活性[1]。其在合成過程中會(huì)產(chǎn)生一些副產(chǎn)物及降解產(chǎn)物，產(chǎn)生的雜質(zhì)會(huì)導(dǎo)致其抗菌活性降低、毒性增加，影響臨床使用效果[2]。因此，有必要對(duì)這些雜質(zhì)進(jìn)行鑒定和控制。

目前對(duì)于鹽酸克林霉素棕櫚酸酯雜質(zhì)的研究，主要采用高效液相色譜法(HPLC-UV)和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)[1-3]。其中液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了色譜強(qiáng)大的分離能力與質(zhì)譜優(yōu)越的定性功能，對(duì)藥物雜質(zhì)分析具有無可比擬的優(yōu)越性。Bharathi等[3]首次分離鑒定了鹽酸克林霉素棕櫚酸酯中的10種雜質(zhì)，王建等[2]采用HPLC-ESI-MSn法鑒定了國(guó)產(chǎn)鹽酸克林霉素棕櫚酸酯原料藥中的3個(gè)新雜質(zhì)。但是，由于藥物中某些雜質(zhì)含量極低，迫切需要一種更靈敏、更精確的手段對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，以確保藥物的安全性。目前新一代的超快速高效液相色譜串聯(lián)時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)(UFLC-Q-TOF-MS/MS)，集快速有效的分離能力和高分辨、高質(zhì)量精度的定性能力為一體，已成為研究微量藥物雜質(zhì)的最有效手段之一[4]，筆者采用該技術(shù)對(duì)鹽酸克林霉素棕櫚酸酯分散片中的雜質(zhì)進(jìn)行了鑒定，共檢出16種雜質(zhì)，其中4種雜質(zhì)為首次檢出。本研究對(duì)確保藥品安全性、質(zhì)量可控性具有重要意義，為國(guó)內(nèi)藥品質(zhì)量控制提供了示范。

1 儀器與試藥

超快速高效液相色譜儀(LC-20AD-XR二元泵，SIL-20AD-XR自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20A柱溫箱，日本島津公司)；四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(AB SCIEX Triple TOF 5600，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；超純水系統(tǒng)(Simplicity SIMS00000，美國(guó)密理博公司)。

鹽酸克林霉素棕櫚酸酯對(duì)照品(CAT. NO. 1137005 USP ROCKVILLE，MD LOT H01037，以克林霉素計(jì)含595 μg/mg或w=59.5%)；克林霉素B棕櫚酸酯對(duì)照品(浙江海翔藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)101025)；鹽酸克林霉素棕櫚酸酯分散片(規(guī)格75 mg/片，廣州一品紅制藥有限公司，批號(hào)20130301，20130302，20130303)；甲醇(色譜純，Burdick & Jackson)、乙腈(光譜純，Burdick & Jackson)、醋酸銨(HPLC級(jí)，F(xiàn)luka，17836-50G)。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取鹽酸克林霉素棕櫚酸酯分散片細(xì)粉適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中約含克林霉素0.57 mg溶液，濾過，作為供試品溶液；取鹽酸克林霉素棕櫚酸酯對(duì)照品，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋成每1 mL中含克林霉素2.22 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取克林霉素B棕櫚酸酯對(duì)照品，精密稱定，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋成每1 mL中含克林霉素0.50 mg的溶液，作為雜質(zhì)對(duì)照品溶液。

2.2 液相色譜分析條件[2]

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8(3×150 mm, 3.5 μm)，流動(dòng)相A為5 mmol/L醋酸銨溶液-乙腈(體積比為50∶50)，流動(dòng)相B為乙腈(洗脫梯度見表1)，流速：0.4 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。

表1 液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 HPLC mobile phase gradient elution conditions

2.3 質(zhì)譜條件

選用ESI作為電離源。采用正離子模式同時(shí)進(jìn)行一級(jí)和二級(jí)掃描。離子噴霧電壓：1 500 V；離子源氣體：60 psi；離子源溫度：550 ℃；碰撞器壓力：8 psi。檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 鹽酸克林霉素棕櫚酸酯分散片中的雜質(zhì)Table 2 Impurities in clindamycin palmitate hydrochloride dispersible tablets

2.4 雜質(zhì)解析

雜質(zhì)1：準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z425.187 2。對(duì)其進(jìn)行子離子解析，m/z377.183 1推測(cè)為準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)裂解脫去1個(gè)中性分子CH3SH產(chǎn)生，m/z126.127 6為克林霉素吡咯環(huán)的特征碎片離子[C8H5N]+。根據(jù)該化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜行為(圖1)和參考文獻(xiàn)[2-3]，故鑒定該化合物為克林霉素，分子式為C18H33ClN2O5S。

圖1 克林霉素正模式下一級(jí)掃描圖(a)、二級(jí)碎片質(zhì)譜圖(b)及斷裂途徑(c)Fig.1 (a)MS and (b) MS/MS spectra in positive mode of clindamycin, and (c) the mass fragmentation pathways

雜質(zhì)2：準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z465.218 0。對(duì)其進(jìn)行子離子解析，m/z417.218 7推測(cè)為準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)裂解脫去1個(gè)中性分子CH3SH 產(chǎn)生，m/z126.127 4為克林霉素吡咯環(huán)的特征碎片離子[C8H5N]+。根據(jù)該化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜行為(圖2)和參考文獻(xiàn)[2]，故鑒定該化合物為丙叉克林霉素，分子式為C21H37ClN2O5S。

雜質(zhì)3：準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z565.307 3。對(duì)其進(jìn)行子離子解析，m/z517.324 8推測(cè)為準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)裂解脫去1個(gè)中性分子CH3SH 產(chǎn)生，m/z126.128 9為克林霉素吡咯環(huán)的特征碎片離子[C8H5N]+。根據(jù)該化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜行為和參考文獻(xiàn)[2-3]，故可鑒定該化合物為克林霉素九酸酯，分子式為C27H49ClN2O6S。

雜質(zhì)4：準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z579.322 9。對(duì)其進(jìn)行子離子解析，m/z531.320 7推測(cè)為準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)裂解脫去1個(gè)中性分子CH3SH 產(chǎn)生，m/z126.126 8為克林霉素吡咯環(huán)的特征碎片離子[C8H5N]+。根據(jù)該化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜行為和參考文獻(xiàn)[2-3]，故可鑒定該化合物為克林霉素十酸酯，分子式為C28H51ClN2O6S。

圖2 丙叉克林霉素正模式下一級(jí)掃描圖(a)、二級(jí)碎片質(zhì)譜圖(b)及斷裂途徑(c)Fig.2 (a)MS and (b) MS/MS in positive mode of anisylidene clindamycin， and (c) the mass fragmentation pathways

雜質(zhì)5：準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z679.411 7。對(duì)其進(jìn)行子離子解析，m/z615.411 8推測(cè)為準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)裂解脫去1個(gè)中性分子CH3SOH 產(chǎn)生，m/z126.127 7為克林霉素吡咯環(huán)的特征碎片離子[C8H5N]+。根據(jù)該化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜行為(圖3)和參考文獻(xiàn)[2]，故鑒定該化合物為亞砜克林霉素棕櫚酸酯，分子式為C34H63ClN2O7S。

雜質(zhì)6：準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z593.338 6。對(duì)其進(jìn)行子離子解析，m/z545.333 1推測(cè)為準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)裂解脫去1個(gè)中性分子CH3SH 產(chǎn)生，m/z126.128 4為克林霉素吡咯環(huán)的特征碎片離子[C8H5N]+。根據(jù)該化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜行為和參考文獻(xiàn)[2-3]，故可鑒定該化合物為克林霉素十一酸酯，分子式為C29H53ClN2O6S。

圖3 亞砜克林霉素棕櫚酸酯正模式下一級(jí)掃描圖(a)、二級(jí)碎片質(zhì)譜圖(b)及斷裂途經(jīng)(c)Fig.3 (a)MS and (b) MS/MS spectra in positive mode of sulfoxides clindamycin palmitate hydrochloride and (c) the mass fragmentation pathways

雜質(zhì)7：準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z645.450 7。對(duì)其進(jìn)行子離子解析，m/z597.448 3推測(cè)為準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)裂解脫去1個(gè)中性分子CH3SH 產(chǎn)生，m/z126.128 0為克林霉素吡咯環(huán)的特征碎片離子[C8H5N]+。根據(jù)該化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜行為(圖4)和參考文獻(xiàn)[3]，故可鑒定該化合物為林可霉素棕櫚酸酯，分子式為C34H64N2O7S。

圖4 林可霉素棕櫚酸酯正模式下一級(jí)掃描圖(a)、二級(jí)碎片質(zhì)譜圖(b)及斷裂途徑(c)Fig.4 (a) MS and (b) MS/MS spectra in positive mode of Lincomycin palmitate, and (c) the mass fragmentation pathways

雜質(zhì)8：準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z607.354 2。對(duì)其進(jìn)行子離子解析，m/z559.350 5推測(cè)為準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)裂解脫去1個(gè)中性分子CH3SH 產(chǎn)生，m/z126.127 7為克林霉素吡咯環(huán)的特征碎片離子[C8H5N]+。根據(jù)該化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜行為和參考文獻(xiàn)[2]，故可鑒定該化合物為克林霉素十二酸酯，分子式為C30H55ClN2O6S。

雜質(zhì)9：準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z621.369 9。對(duì)其進(jìn)行子離子解析，m/z573.365 3推測(cè)為準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)裂解脫去1個(gè)中性分子CH3SH 產(chǎn)生，m/z126.128 1為克林霉素吡咯環(huán)的特征碎片離子[C8H5N]+。根據(jù)該化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜行為和參考文獻(xiàn)[2]，故可鑒定該化合物為克林霉素十三酸酯，分子式為C31H57ClN2O6S。

圖5 棕櫚酸乙酯正模式下一級(jí)掃描圖(a)、二級(jí)碎片質(zhì)譜圖(b)及斷裂途徑(c)Fig.5 (a) MS and (b) MS/MS spectra in positive mode of ethyl palmitate, and (c) the mass fragmentation pathways

圖6 克林霉素B棕櫚酸酯正模式下一級(jí)掃描圖(a)、二級(jí)碎片質(zhì)譜圖(b) 及斷裂途徑(c)Fig.6 (a) MS and (b) MS/MS spectra in positive mode of ethyl palmitate, and (c) the mass fragmentation pathways

雜質(zhì)11：準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z635.385 5。對(duì)其進(jìn)行子離子解析，m/z587.388 1推測(cè)為準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)裂解脫去1個(gè)中性分子CH3SH 產(chǎn)生，m/z126.127 8為克林霉素吡咯環(huán)的特征碎片離子[C8H5N]+。根據(jù)該化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜行為和參考文獻(xiàn)[2]，故可鑒定該化合物為克林霉素十四酸酯，分子式為C32H59ClN2O6S。

雜質(zhì)12：準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z663.416 8。對(duì)其進(jìn)行子離子解析，m/z615.411 7推測(cè)為準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)裂解脫去1個(gè)中性分子CH3SH 產(chǎn)生，m/z126.127 8為克林霉素吡咯環(huán)的特征碎片離子[C8H5N]+。根據(jù)該化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜行為和參考文獻(xiàn)[2-3]，故可鑒定該化合物為克林霉素棕櫚酸酯異構(gòu)體，分子式為C34H63ClN2O6S。

雜質(zhì)13：準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z649.401 2。對(duì)其進(jìn)行子離子解析，m/z601.394 1推測(cè)為準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)裂解脫去1個(gè)中性分子CH3SH 產(chǎn)生，m/z112.111 5為克林霉素吡咯環(huán)的特征碎片離子[C7H3N]+。該化合物的保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜行為(圖6)與對(duì)照品一致[2-3] ，故可鑒定該化合物為克林霉素B棕櫚酸酯，分子式為C33H61ClN2O6S。

雜質(zhì)14：準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z677.432 5。對(duì)其進(jìn)行子離子解析，m/z629.429 6,推測(cè)為準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)裂解脫去1個(gè)中性分子CH3SH 產(chǎn)生，m/z126.127 8為克林霉素吡咯環(huán)的特征碎片離子[C8H5N]+。根據(jù)該化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜行為和參考文獻(xiàn)[2-3]，故可鑒定該化合物為克林霉素十七酸酯，分子式為C35H65ClN2O6S。

雜質(zhì)15：準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z691.448 1。對(duì)其進(jìn)行子離子解析，m/z643.445 1推測(cè)為準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)裂解脫去1個(gè)中性分子CH3SH 產(chǎn)生，m/z126.128 2為克林霉素吡咯環(huán)的特征碎片離子[C8H5N]+。根據(jù)該化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜行為和參考文獻(xiàn)[2-3]，故可鑒定該化合物為克林霉素十八酸酯，分子式為C36H67ClN2O6S。

雜質(zhì)16：分子離子峰[M+H]+為m/z703.448 1。對(duì)其進(jìn)行子離子解析，m/z655.329 6推測(cè)為準(zhǔn)分子離子峰經(jīng)裂解脫去1個(gè)中性分子CH3SH 產(chǎn)生，m/z126.128 1為克林霉素吡咯環(huán)的特征碎片離子[C8H5N]+。根據(jù)該化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、質(zhì)譜行為和參考文獻(xiàn)[2]，故可鑒定該化合物為丙叉克林霉素棕櫚酸酯，分子式為C37H67ClN2O6S。

3 討 論

在本研究中，檢測(cè)出鹽酸克林霉素棕櫚酸酯分散片中的16種雜質(zhì)，其中克林霉素九酸酯、克林霉素十酸酯、克林霉素十一酸酯、克林霉素十三酸酯為首次檢到。經(jīng)二級(jí)質(zhì)譜分析指認(rèn)，所檢測(cè)到的雜質(zhì)均為脂肪酸類物質(zhì)或克林霉素與脂肪酸的結(jié)合物，他們是鹽酸克林霉素棕櫚酸酯合成過程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，在產(chǎn)品的質(zhì)量控制中，必須對(duì)其進(jìn)行監(jiān)控。

本文采用UFLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)鹽酸克林霉素棕櫚酸酯分散片中的雜質(zhì)進(jìn)行鑒定，將液相色譜的高效在線分離能力與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度的檢測(cè)能力相結(jié)合，具有分辨率高、靈敏度高、分析時(shí)間短的特點(diǎn)[5-7]，能檢測(cè)到更多的雜質(zhì)，為進(jìn)一步加強(qiáng)藥品生產(chǎn)工藝過程的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。在有關(guān)物質(zhì)的分離與鑒定中，具有巨大的優(yōu)越性，值得推廣應(yīng)用。

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