抗骨增生片的質量標準提高研究

陳 希，萬林春，張文婷（江西省藥品檢驗檢測研究院/江西省藥品與醫(yī)療器械質量工程技術研究中心，南昌330029）

抗骨增生片的質量標準提高研究

陳 希＊，萬林春，張文婷#（江西省藥品檢驗檢測研究院/江西省藥品與醫(yī)療器械質量工程技術研究中心，南昌330029）

目的：完善和提高抗骨增生片的質量標準。方法：采用薄層色譜法（TLC）對制劑中骨碎補、淫羊藿、雞血藤進行定性鑒別；采用高效液相色譜法測定制劑中毛蕊花糖苷和淫羊藿苷的含量：色譜柱為Diamonsil C18，流動相為乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為270 nm（淫羊藿苷）、334 nm（毛蕊花糖苷），柱溫為25℃，進樣量為10μL。結果：骨碎補、淫羊藿、雞血藤的TLC圖斑點清晰，分離度好，陰性對照無干擾。毛蕊花糖苷、淫羊藿苷檢測進樣量線性范圍分別為0.018 8～1.88 μg（r＝0.999 9）、0.107～2.14 μg（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為100.2%～105.0%（RSD＝1.6%，n＝9）、96.2%～99.5%（RSD＝1.4%，n＝9）。結論：該標準能更加有效地控制抗骨增生片的質量。

抗骨增生片；柚皮苷；淫羊藿苷；毛蕊花糖苷；雞血藤；薄層色譜法；高效液相色譜法

抗骨增生片具有活血、止痛和補腎的功效[1-3]，適用于肥大性脊椎炎、跟骨刺、頸椎病、大骨節(jié)病、增生性關節(jié)炎的治療。該制劑由熟地黃、骨碎補、雞血藤、淫羊藿和肉蓯蓉等7味中藥組成，其糖衣片和薄膜衣片分別收載于《衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑》[4]和《國家藥品標準》[5]，內容均只有雞血藤的薄層色譜（TLC）鑒別和片劑的常規(guī)檢查，標準較簡單，不利于產品的質量控制。筆者采用TLC對骨碎補、淫羊藿和雞血藤進行定性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定制劑中毛蕊花糖苷、淫羊藿苷的含量，以期為提高抗骨增生片的質量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010C型HPLC儀，包括紫外檢測器（日本Shimadzu公司）；BT125D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；BUG25-06型超聲波清洗儀（上海必能信超聲有限公司，功率：250 W，頻率：25 kHz）。

1.2 藥品與試劑

抗骨增生片（陜西濟康藥業(yè)有限公司，批號：100301、090701；陜西白云制藥有限公司，批號：091101、090901；江門名盛制藥有限公司，批號：20080801，規(guī)格均為0.26 g/片）；淫羊藿苷對照品（批號：110737-200415，純度：100%）、柚皮苷對照品（批號：110722-200610，純度：100%）、毛蕊花糖苷對照品（批號：111530-200303，純度：96.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；雞血藤對照藥材（筆者購自江西樟樹中藥材市場，經本單位萬林春副主任中藥師鑒定為真品）；羥甲基纖維素鈉、硅膠G（青島海洋化工廠分廠）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 骨碎補、淫羊藿 取樣品20片，除去包衣，研細，加石油醚（60～90℃）30 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液備用；殘渣加乙酸乙酯70 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取淫羊藿苷、柚皮苷對照品各適量，分別加甲醇制成質量濃度均為0.5 mg/mL的單一對照品溶液。按抗骨增生片處方和工藝分別制備缺骨碎補、淫羊藿的單一陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成單一陰性對照溶液。按TLC法[2015年版《中國藥典》（四部）][6]試驗，吸取上述5種溶液各5 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水（10∶1∶1∶1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，加熱至紫外光燈（365 nm）下可見。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1。

圖1 骨碎補、淫羊藿的薄層色譜圖1.缺骨碎補的陰性對照；2.缺淫羊藿的陰性對照；3～5.供試品；6.淫羊藿苷對照品；7.柚皮苷對照品Fig 1 TLC chromatograms of Drynaria fortunei and Epimedii Folium1.negative control without D.fortunei；2.negative control without Epimedii Folium；3-5.test samples；6.reference substance of icariin；7.reference substance of naringin

2.1.2 雞血藤 取“2.1.1”項下石油醚提取液，揮干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取雞血藤對照藥材1 g，按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按抗骨增生片處方和工藝制備缺雞血藤的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按TLC法[2015年版《中國藥典》（四部）][6]試驗，吸取上述3種溶液各20 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯（19∶5，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃下加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖2。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），洗脫程序（0～12 min，20%A；12～30 min，30%A；30～40 min，20%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm（淫羊藿苷）、334 nm（毛蕊花糖苷）；柱溫：25℃；進樣量：10μL。在上述色譜條件下，理論板數以毛蕊花糖苷和淫羊霍苷峰計＞3 000；各成分基線分離良好，分離度＞1.5，詳見圖3、圖4。

圖2 雞血藤的薄層色譜圖Fig 2 TLC chromatogram of spatholobus suberectus

圖3 高效液相色譜圖（334 nm）Fig 3 HPLC chromatograms（334 nm）

圖4 高效液相色譜圖（270 nm）Fig 4 HPLC chromatograms（270 nm）

2.2.2 混合對照品溶液的制備 取待測成分對照品適量，精密稱定，加甲醇制成毛蕊花糖苷、淫羊藿苷質量濃度分別為10、60μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品20片，除去包衣，精密稱定，研細，取約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理60 min，放冷，再次稱定質量，加50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，即得。

2.2.4 線性關系考察 取待測成分對照品適量，加甲醇制成毛蕊花糖苷、淫羊藿苷質量濃度分別為9.09、10.70 μg/mL的單一對照品溶液，分別精密量取上述毛蕊花糖苷對照品溶液2、5、10、20、50、100、200 μL，淫羊藿苷對照品溶液1、2、5、10、20 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得毛蕊花糖苷、淫羊藿苷的回歸方程分別為y＝3 201 368x－31 313（r＝0.999 9）、y＝412 757x－17 158（r＝0.999 9）。結果表明，毛蕊花糖苷、淫羊藿苷檢測進樣量線性范圍分別為0.018 8～1.88、0.107～2.14 μg。

2.2.5 精密度試驗 取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果，毛蕊花糖苷、淫羊藿苷峰面積的RSD分別為1.5%、0.2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液（批號：20080801）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、8、12 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，毛蕊花糖苷、淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.60%、1.90%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置12 h內基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗 精密稱取同一批樣品（批號：20080801）適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，毛蕊花糖苷、淫羊藿苷峰面積的RSD分別為1.9%、0.9%（n＝5），表明本方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量樣品（批號：20080801）適量，共9份，分別加入低、中、高質量的待測成分對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

2.2.9 樣品含量測定 取5批樣品各適量，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表2。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

表2 樣品含量測定結果（n＝3，μg/片）Tab 2 Results of contents determination of samples（n＝3，μg/tablet）

3 討論

3.1 定性指標的選擇

骨碎補和淫羊藿中的鑒別大多都是單獨鑒別，鑒于提取方法和極性近似[7]，筆者考慮在同一TLC中同時鑒別，原設計還打算同時鑒別毛蕊花糖苷，但因陰性干擾，未加入。處方中含有雞血藤原粉，筆者考慮采用雞血藤對照藥材進行鑒別。前兩者先采用石油醚除去雜質，后采用乙酸乙酯提取后進行鑒別，而雞血藤的鑒別又正好利用了上述石油醚提取液作為供試液，這樣不但操作簡便，并且節(jié)省了分析成品量和時間，同時陰性均無干擾，專屬性好。

3.2 含量測定條件的選擇

已有文獻大多是針對抗骨增生片（丸）中淫羊藿苷進行含量測定研究，很少有毛蕊花糖苷含量的研究報道，更未見兩者同時測定的研究[7-10]。因甲醇提取樣品中的毛蕊花糖苷和淫羊藿苷效果良好，所以選擇雙波長同時測定這兩個成分，而流動相中加入0.1%甲酸溶液可以改善峰形[11-15]，但兩者出峰時間相隔較遠，所以采用梯度洗脫的方法，使出峰時間大大縮短。本試驗含量測定方法簡便快捷、結果準確、重復性好，可用于該制劑的質量控制。

[1] 周軍，劉曉海，宋亞玲，等.抗骨增生膠囊對大鼠骨性關節(jié)炎的實驗研究[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（10）：145-147.

[2] 陳履平，李龍.抗骨增生膠囊治療膝骨關節(jié)炎的臨床[J].實用臨床醫(yī)藥雜志，2010，14（15）：98-100.

[3] 鄒文孝，田維君，張春，等.抗骨增生片聯合骨肽片治療骨質增生癥60例[J].中國藥業(yè)，2012，21（8）：93-94.

[4] 國家衛(wèi)生部.衛(wèi)生部藥品標準：中藥成方制劑：第7冊[S].北京：化學工業(yè)出版社，1993：74-75.

[5] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局.國家藥品標準[S].WS3-B-1338-93-1.

[6] 劉湘豫，彭詞艷，胡焰，等.抗骨增生片制備工藝及質量標準研究[J].中南藥學，2013，11（8）：572-574.

[7] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：57-57.

[8] 楊立芳，宋文耆.高效液相色譜法測定抗骨增生丸中淫羊藿苷的含量[J].中國藥房，2006，17（18）：1420-1422.

[9] 楊小妹，朱俊彥.高效液相色譜法測定抗骨增生片中淫羊藿苷含量[J].中國現代應用藥學雜志，2005，22（4）：314-315.

[10] 劉淑妦，張妮瑜，辛秀，等.抗骨增生片定性定量方法研究[J].中南藥學，2014，12（6）：574-575.

[11] 顧利紅，張瑩.HPLC測定護心膠囊中淫羊藿苷的含量[J].中成藥，2008，30（7）：1092-1094.

[12] 楊增明.HPLC法測定淫羊藿苷含量研究[J].中國藥品標準，2008，9（1）：143-144.

[13] 蔣桂平.高效液相色譜法測定抗骨增生丸中淫羊藿苷的含量[J].中南藥學，2008，6（3）：322-323.

[14] 張貴財，朱旭江，杜興，等.HPLC法測定蘭州肉蓯蓉中毛蕊花糖苷的含量[J].中國藥事，2010，24（8）：801-803.

[15] 柴茂，董誠明，江道會，等.不同品種懷地黃中梓醇和毛蕊花糖苷的高效液相色譜法測定[J].中醫(yī)學報，2013，28（5）：690-692.

（編輯：張 靜）

Study on Improving the Quality Standards of Kanggu Zengsheng Tablet

CHEN Xi，WAN Linchun，ZHANG Wenting（Jiangxi Institute for Drug Control/Jiangxi Provincial Engineering Research Center for Drug and Medical Device Quality，Nanchang 330029，China）

OBJECTIVE：To develop and improve the quality standard for Kanggu zengsheng tablet.METHODS：TLC was used for the qualitative identification of Drynaria fortunei，Epimedii Folium and Spatholobus suberectus；HPLC was used for the contents determination of icariin and acteoside：the column was Diamonsil C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%formic acid solution（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min；detection wavelength was 270 nm for icariin and 334 nm for acteoside，Cdumn temperature was 25℃，and the injection volume was 10μL.RESULTS：The TLC spots of D.fortunei，Epimedii Folium and S.suberectus were clear and well separated，negative control without interference.The linear range was 0.018 8-1.88 μg for acteoside（r＝0.999 9）and 0.107-2.14 μg for icariin（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 100.2%-105.0%（RSD＝1.6%，n＝9）and 96.2%-99.5%（RSD＝1.4%，n＝9）.CONCLUSIONS：The improved standard can more effectively control the quality of Kanggu zengsheng tablet.

Kanggu zengsheng tablet；Naringin；Icariin；Acteoside；Spatholobus suberectus；TLC；HPLC

R284.1；R917

A

1001-0408（2017）06-0838-04DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.06.32

2016-02-06

2016-02-26）

＊主管檢驗師，碩士。研究方向：藥物分析和食品分析。電話：0791-88158796。E-mail：89276794@qq.com

#通信作者：副主任藥師，碩士。研究方向：藥物分析。電話：0791-88158630。E-mail：2819176959@qq.com