淫羊藿中朝藿苷A、B和C的酶轉(zhuǎn)化及其稀有箭藿苷的制備

彭磊,徐絲瑜,武博,王政浩,魚紅閃

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連,116034)

淫羊藿是小檗科(Berberdiaceae)淫羊藿屬(Epimedium)多年生宿根性草本藥用植物,又名仙靈脾,其莖、葉可入藥,已有2 000多年的使用歷史[1]。《本草綱目》中記載,其辛溫?zé)o毒,具有堅(jiān)筋骨、益精氣、補(bǔ)腰膝、強(qiáng)心強(qiáng)骨等功能[2]。目前全世界淫羊藿屬約有68個(gè)種,其中57個(gè)種生長在中國[3]。《中華人民共和國藥典》2020年版第一部收載了4種藥用淫羊藿,分別為:小蘗科淫羊藿(EpimediumbrevicornumMaxim)、箭葉淫羊藿[Epimediumsagittatum(Seib rt Zucc.) Maxim]、柔毛淫羊藿(EpimediumpubescensMaxim)和朝鮮淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)[4]。

淫羊藿的主要活性成分是黃酮類化合物,目前已從淫羊藿中發(fā)現(xiàn)了70余種黃酮類化合物,其中淫羊藿苷、朝藿苷A、B和C在淫羊藿中含量最多,它們分別占淫羊藿總黃酮含量的58.5%、5.92%、11%和24.5%,而其他黃酮類化合物含量很低[5]。常見的淫羊藿黃酮類化合物,如圖1、表1所示。

表1 常見的淫羊藿黃酮類化合物Table 1 Common Epimedium flavonoids

圖1 常見的淫羊藿黃酮類化合物基本結(jié)構(gòu)Fig.1 Basic structure of common Epimedium flavonoids

口服使用淫羊藿黃酮時(shí),淫羊藿黃酮在腸道中被水解成低糖基黃酮苷或苷元,成為更容易吸收的化合物,通過腸道吸收最終起藥效[6-7]。淫羊藿黃酮具有提高免疫、抗炎、抗衰老、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、預(yù)防阿爾茨海默病和改善腦缺血的功能[8],淫羊藿苷元和淫羊藿次苷具有良好的抗癌、抗病毒、抗骨質(zhì)疏松、抗炎、抗血栓和抗皮膚老化等功能且吸收率高[9]?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明,淫羊藿黃酮的藥效與其糖基數(shù)量有關(guān),糖基數(shù)量越少其吸收率和藥效越高[10-11],但淫羊藿中含量高的朝藿苷A、B和C含有3個(gè)糖基,這導(dǎo)致其活性低、吸收率低。

因稀有淫羊藿黃酮類化合物產(chǎn)量少且價(jià)格昂貴,若用酶法水解淫羊藿中含量高的淫羊藿苷、朝藿苷A、B和C,制備箭藿苷A、B和C以及淫羊藿苷元等稀有淫羊藿黃酮類化合物,能為開發(fā)新藥、保健食品和化妝品提供廉價(jià)的原料,有利于提高淫羊藿在中藥產(chǎn)品、保健食品和化妝品中的利用率。

為此,本文利用Aspergillissp.y48所產(chǎn)的淫羊藿黃酮苷酶,水解淫羊藿中的朝藿苷A、B和C(淫羊藿苷制備后的廢棄物)上的糖基,進(jìn)而制備低糖基的箭藿苷A、B、C、淫羊藿次苷II和淫羊藿苷元,以期為淫羊藿苷A、B、C的高效利用和制備低糖基淫羊藿黃酮類化合物提供了理論基礎(chǔ)和工藝方案。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種Aspergillissp.y48,由本實(shí)驗(yàn)室從白酒生產(chǎn)曲類中分離得到[12]。硅膠板60-F254,由Merck公司生產(chǎn)。標(biāo)準(zhǔn)品:朝藿苷A、B、C;箭藿苷A、B、C;淫羊藿苷;淫羊藿次苷I;淫羊藿次苷II(寶藿苷I);淫羊藿苷元,由武漢格林特生物技術(shù)有限公司和南京廣潤生物制品有限公司生產(chǎn)。

1.2 酶的制備及活性確認(rèn)

Aspergillissp.y48在100 mL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%淫羊藿葉粉的5%麥汁培養(yǎng)基中,30 ℃下?lián)u床培養(yǎng)6～7 d,離心分離菌體;向上清液中加入3倍體積的甲醇沉淀酶蛋白,靜置過夜,離心收集酶蛋白沉淀;加入10 mL 0.02 mol/L(pH 5.0)的醋酸緩沖液溶解,離心去除不溶雜質(zhì),最終獲得酶液。

酶活性確認(rèn):在試管中加入0.1 mL酶液與0.1 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的朝藿苷C,在45 ℃條件下反應(yīng)1 h后,加入0.2 mL水飽和正丁醇終止反應(yīng);用正丁醇層的反應(yīng)產(chǎn)物做薄層層析(thin layer chromatography,TLC),確認(rèn)其所產(chǎn)酶的酶活性。

1.3 酶反應(yīng)最適溫度和最適pH的確定

最適溫度:在試管中加入0.1 mL酶液與0.1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%的朝藿苷C(最終為0.2%),分別在25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃下反應(yīng)1 h,然后分別加入0.2 mL水飽和正丁醇終止反應(yīng),用正丁醇層做TLC分析,確認(rèn)最適溫度。

最適pH:分別在試管中加入0.1 mL pH 3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%的朝藿苷C溶液,分別與0.1 mL酶液混合,在45 ℃條件下反應(yīng)1 h,然后分別加入0.2 mL水飽和正丁醇終止反應(yīng),用正丁醇層做TLC分析,確認(rèn)最適pH。

1.4 朝藿苷A、B和C糖基的酶水解途徑

在試管中,分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%的0.1 mL朝藿苷A、B和C與0.1 mL酶液混合,在45 ℃下反應(yīng)0.5、2、4、6 h,然后加入0.2 mL水飽和正丁醇終止反應(yīng),取朝藿苷A和C的0.5、4 h的正丁醇層以及朝藿苷B的0.5、6 h反應(yīng)的正丁醇層做TLC分析,確認(rèn)酶反應(yīng)產(chǎn)物變化情況,進(jìn)而確定酶水解朝藿苷A、B和C糖基的水解途徑。

1.5 制備稀有淫羊藿黃酮類化合物箭藿苷A、B和C,以及淫羊藿苷元

箭藿苷A的制備:將40 mg朝藿苷A混合于10 mL的0.02 mol/L(pH 5.0)醋酸緩沖液,加入10 mL酶液,在45 ℃條件下反應(yīng)3～4 h,加入20 mL水飽和正丁醇終止反應(yīng)并萃取反應(yīng)產(chǎn)物;再用10 mL水飽和正丁醇萃取2次。合并正丁醇,減壓濃縮,干燥,得到箭藿苷A。

箭藿苷B的制備:將80 mg朝藿苷B混合于20 mL的0.02 mol/L(pH 5.0)醋酸緩沖液,加入20 mL酶液,在45 ℃條件下反應(yīng)3 h,加入40 mL水飽和正丁醇終止反應(yīng)并萃取反應(yīng)產(chǎn)物;再用20 mL水飽和正丁醇萃取2次。合并正丁醇,減壓濃縮,干燥,得到以箭藿苷B為主的產(chǎn)物。

箭藿苷C的制備:將400 mg朝藿苷C混合于80 mL的0.02 mol/L(pH 5.0)醋酸緩沖液,加入80 mL酶液,在45 ℃搖床反應(yīng)3～4 h,加入50 mL水飽和正丁醇終止反應(yīng)并萃取反應(yīng)產(chǎn)物;再用40 mL水飽和正丁醇萃取2次。合并正丁醇,減壓濃縮,干燥,得到箭藿苷C。

淫羊藿苷元的制備:將80 mg朝藿苷B混合于20 mL的0.02 mol/L(pH 5.0)醋酸緩沖液,加入20 mL酶液,在45 ℃條件下反應(yīng)9 h,加入40 mL水飽和正丁醇終止反應(yīng)并萃取反應(yīng)產(chǎn)物;再用20 mL水飽和正丁醇萃取2次。合并正丁醇,減壓濃縮,干燥,得到淫羊藿苷元。

1.6 薄層層析(thin layer chromatography,TLC)和HPLC法

TLC法:用反應(yīng)后萃取的正丁醇,做TLC,在展開劑[V(乙酸乙酯)∶V(丁酮)∶V(甲醇)∶V(水)=8∶7∶1∶1]中展開,吹干,在紫外線280 nm下顯色。用BandScan 5.0軟件,確定TLC板的朝藿苷A、B和C反應(yīng)液中底物、中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物斑點(diǎn)的含量比例,確定底物的酶轉(zhuǎn)化情況。

HPLC法:將朝藿苷A、B和C反應(yīng)后分離、干燥得到的反應(yīng)產(chǎn)物,溶解于1 mL色譜純甲醇,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,做HPLC,確定朝藿苷A、B和C反應(yīng)液底物、中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物的含量比例,以及底物的轉(zhuǎn)化情況。HPLC色譜儀,Waters 2695高效液相色譜分析儀,Waters 2996二極管陣列檢測器及Empower色譜工作站進(jìn)行檢測,色譜柱為中匯達(dá)Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。進(jìn)樣量10 μL;柱溫35 ℃;體積流速1.0 mL/min;檢測波長273 nm;流動(dòng)相:乙腈(A)-水(D)0～8 min,17% A～27% A;8～32 min,27% A等度;32～60 min,27% A～85% A;60～70 min,85% A等度;70～80 min,85% A～90% A。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶反應(yīng)最適溫度與最適pH

按照1.2節(jié)及1.3節(jié)的方法進(jìn)行操作,通過TLC檢測分析朝藿苷C的生成量。如圖2-a可見,隨溫度的變化,從20～45 ℃酶活性逐漸增高,45～70 ℃酶活性逐漸降低;如圖2-b可見pH 3.0～5.0酶活性逐漸增高,pH 5.0～8.0酶活性逐漸降低。由此確定Aspergillissp.y48菌所產(chǎn)酶的酶反應(yīng)最適溫度為45 ℃,最適pH為5.0(圖2)。

a-酶反應(yīng)最適溫度;b-酶反應(yīng)最適pH圖2 0.2%朝藿苷C在45 ℃酶反應(yīng)1 h時(shí)最適溫度和pHFig.2 Optimal temperature and pH of 0.2% epimedin C at 45 ℃ for 1 h by enzyme

2.2 朝藿苷A、B和C糖基的酶水解途徑

采用1.4節(jié)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作。取朝藿苷A和C的0.5、4 h的反應(yīng)產(chǎn)物以及朝藿苷B的0.5、6 h反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物做TLC和HPLC分析,確認(rèn)酶水解朝藿苷A、B和C糖基的水解過程,結(jié)果如圖3所示。

a-1-淫羊藿苷元;2-淫羊藿次苷Ⅰ;3-淫羊藿次苷Ⅱ;4-朝藿苷A;5-朝藿苷B;6-朝藿苷C;7-箭藿苷A;8-箭藿苷B;9-箭藿苷;10-淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品;A-朝藿苷A反應(yīng)0.5 h;A′-朝藿苷A反應(yīng)4 h;B-朝藿苷B反應(yīng)0.5 h;B′-朝藿苷B反應(yīng)6 h;C-朝藿苷C反應(yīng)0.5 h;C′-朝藿苷C反應(yīng)4 h;b-朝藿苷B反應(yīng)0.5 h的HPLC 圖;c-朝藿苷C反應(yīng)0.5 h的HPLC圖圖3 0.2%朝藿苷A、B和C酶水解產(chǎn)物的TLC和HPLC圖Fig.3 Enzyme reacting product from 0.2% epimedin A, B and C in TLC and HPLC

從圖3中可見,朝藿苷A在45 ℃酶催化條件下反應(yīng)0.5 h,朝藿苷A部分轉(zhuǎn)化為箭藿苷A;反應(yīng)4 h后,全部轉(zhuǎn)化為箭藿苷A(圖3-a的A和A′列);同樣朝藿苷C在45 ℃酶催化條件下反應(yīng)0.5 h,朝藿苷C部分轉(zhuǎn)化為箭藿苷C;反應(yīng)4 h后,全部轉(zhuǎn)化為箭藿苷C(圖3-a的C和C′行、圖3-c);由此可見,Aspergillissp.y48所產(chǎn)酶能水解朝藿苷A和C的7-O-β-D-Glc糖基。

朝藿苷B在相同條件下反應(yīng)0.5 h時(shí),反應(yīng)液中含有朝藿苷B、箭藿苷B、淫羊藿次苷II和苷元;當(dāng)反應(yīng)6 h后只有淫羊藿苷元(圖3-a的B和B′列、圖3-b)。由此可見,Aspergillissp.y48所產(chǎn)酶能水解朝藿苷B的7-O-β-D-Glc糖基,且可以水解箭藿苷B的末端3-O-β-D-Xyl(木糖基),變成淫羊藿次苷II;并進(jìn)一步水解淫羊藿次苷II的3-O-α-L-Rha(鼠李糖基),轉(zhuǎn)化成淫羊藿苷元。因此,朝藿苷A、B和C糖基的酶水解途徑,如圖4所示。

a-朝藿苷A;b-朝藿苷C;c-朝藿苷B圖4 Aspergillis sp.y48菌酶水解朝藿苷A、B和C糖基的途徑Fig.4 Hydrolysis pathways of epimedin A, B and C glycosides by enzyme from y48 strain

歸納上述結(jié)果,Aspergillissp.y48菌所產(chǎn)淫羊藿黃酮苷酶可以水解朝藿苷A、B和C的7-O-β-D-Glc糖基,轉(zhuǎn)化生成箭藿苷A、B和C,通過控制酶反應(yīng)時(shí)間可以將箭藿苷B末端3-O-β-D-Xyl(木糖基)轉(zhuǎn)化成淫羊藿次苷II,并進(jìn)一步水解淫羊藿次苷II的3-O-α-L-Rha(鼠李糖基)最終轉(zhuǎn)化成淫羊藿苷元,因此該方法可以制備箭藿苷A、B、C和淫羊藿苷元。

2.3 從朝藿苷A、B和C酶轉(zhuǎn)化制備淫羊藿稀有黃酮類化合物

上述實(shí)驗(yàn)證明了Aspergillissp.y48菌的淫羊藿黃酮苷酶能水解朝藿苷A和C的7-O-β-D-Glc糖基,可用于制備箭藿苷A和C。該酶能水解朝藿苷B的7-O-β-D-Glc糖基和3-O-糖基,生成箭藿苷B、淫羊藿次苷II和淫羊藿苷元。由此,控制朝藿苷B的酶反應(yīng)時(shí)間,可制備箭藿苷B、淫羊藿次苷II和淫羊藿苷元。考慮到反應(yīng)底物,朝藿苷A、B和C的水溶性,底物質(zhì)量濃度定為2 mg/mL,進(jìn)行將朝藿苷A、B和C用酶轉(zhuǎn)化為稀有淫羊藿黃酮類化合物的實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)1.5節(jié)的實(shí)驗(yàn)方法,制備箭藿苷A和C,得到61 mg HPLC純度為98%的箭藿苷A(相對(duì)分子質(zhì)量676.2、9.02 mmol),摩爾得率94.6%(圖5-a);得到310 mg HPLC純度為98%的箭藿苷C(相對(duì)分子質(zhì)量660.7、469 mmol),摩爾得率96.5%(圖5-b)。制備箭藿苷B和淫羊藿苷元:首先反應(yīng)3 h,得到HPLC純度為83%的箭藿苷B(相對(duì)分子質(zhì)量646.6、89.7 mmol)58 mg,摩爾得率75.3%,其他為淫羊藿次苷II(圖5-c);將反應(yīng)產(chǎn)物中的箭藿苷B用制備色譜法分離,得到高純度的箭藿苷B。將朝藿苷B的酶反應(yīng)時(shí)間延長到6～8 h,使朝藿苷B全部轉(zhuǎn)化為淫羊藿苷元;最終將80 mg朝藿苷B(相對(duì)分子質(zhì)量808.8、98.9 mmol)酶轉(zhuǎn)化制備為31 mg HPLC純度為98%的淫羊藿苷元(相對(duì)分子質(zhì)量368.4、84.1 mmol),摩爾得率93.8%(圖5-d)。

a-從朝藿苷A所制備的箭藿苷A;b-從朝藿苷C所制備的箭藿苷C;c-從朝藿苷B所制備的83%箭藿苷B;d-從朝藿苷B所制備的淫羊藿苷元圖5 酶轉(zhuǎn)化從朝藿苷A、C和B所制備的箭藿苷A、C和B的HPLC圖Fig.5 Sagittatoside A, B and C products in HPLC fron epimedin C, A and B by enzyme

最終利用Aspergillissp.y48菌所產(chǎn)生的淫羊藿黃酮苷酶,將淫羊藿中含量高的朝藿苷A和C轉(zhuǎn)化得到高純度箭藿苷A和C,將朝藿苷B轉(zhuǎn)化為箭藿苷B和淫羊藿苷元。該方法簡單、成本低、收率高、產(chǎn)品純度高,且迄今為止尚未見到其他相關(guān)報(bào)道。

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Aspergillissp.y48菌所產(chǎn)生的淫羊藿黃酮苷酶,能水解朝藿苷A、C和B的7-O-β-D-Glc糖基,分別生成箭藿苷A、C和B。其中該酶能進(jìn)一步水解箭藿苷B的3-O-β-D-Xyl糖基,轉(zhuǎn)化成淫羊藿次苷II,之后水解淫羊藿次苷II的3-O-α-L-Rha糖基,生成淫羊藿苷元,若延長反應(yīng)時(shí)間,朝藿苷將全部轉(zhuǎn)化為淫羊藿苷元。但該酶不能水解箭藿苷A的末端3-O-β-D-Glc糖基和箭藿苷C末端3-O-α-L-Rha糖基。該酶最適反應(yīng)溫度為45 ℃,最適pH為5.0。由此,該酶轉(zhuǎn)化法可以用于利用朝藿苷A、C制備箭藿苷A、C,以及利用朝藿苷B制備箭藿苷B和淫羊藿苷元。

利用Aspergillissp.y48菌所產(chǎn)生的淫羊藿黃酮苷酶,將朝藿苷A和朝藿苷C轉(zhuǎn)化為箭藿苷A和箭藿苷C的純度均為98%,摩爾得率均94%以上;反應(yīng)3 h能將朝藿苷B轉(zhuǎn)化箭藿苷B,當(dāng)酶反應(yīng)時(shí)間延長到6～8 h時(shí),朝藿苷B全部轉(zhuǎn)化為HPLC純度為98%的淫羊藿苷元,摩爾得率為93.8%。相比彭靜等[13]報(bào)道的朝藿苷A和B的轉(zhuǎn)化率73.69%和74.01%更高;相比楊軼舜等[14]報(bào)道的方法,本方法條件溫和且得率更高。

相比之前的研究[15],本文對(duì)不同朝藿苷的酶轉(zhuǎn)化進(jìn)程進(jìn)行了研究,分析了Aspergillissp.y48菌酶水解反應(yīng)的時(shí)間,方法操作簡單,收率高,成本低,產(chǎn)品易提取且純度高,為高效利用淫羊藿黃酮類化合物和稀有淫羊藿黃酮類化合物的制備提供了方法參考。