氧氟沙星滴眼液的抑菌效力測定

李 昊，鄒 宇，張 帆，張亞杰（.遼寧省藥品檢驗檢測院，沈陽 0036；.沈陽三生制藥有限責任公司，沈陽 007）

氧氟沙星滴眼液的抑菌效力測定

李 昊1＊，鄒 宇1，張 帆2，張亞杰1（1.遼寧省藥品檢驗檢測院，沈陽 110036；2.沈陽三生制藥有限責任公司，沈陽 110027）

目的：建立測定氧氟沙星滴眼液抑菌效力的方法。方法：按照2015年版《中國藥典》“抑菌效力檢查法”項下要求，以金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、黑曲霉和白色念珠菌為試驗菌，對氧氟沙星滴眼液樣品進行菌落計數(shù)方法適用性試驗，并按該試驗確定的方法測定不同時間點的存活菌數(shù)，計算1 mL供試品中各試驗菌所加的菌數(shù)及各間隔時間的菌數(shù)，并換算成lg值。結(jié)果：氧氟沙星滴眼液樣品能達到“B”的抑菌效力標準。結(jié)論：采用該方法可有效判定氧氟沙星滴眼液的抑菌效力是否達標。

氧氟沙星滴眼液；菌落計數(shù)；抑菌效力檢查法

氧氟沙星滴眼液在臨床上常用于細菌性結(jié)膜炎和角膜炎的治療，具有良好的效果及安全性，能在較短時間內(nèi)控制感染[1]。而眼用制劑常為多劑量包裝，需要加入抑菌劑抑制微生物的生長與繁殖，以保證產(chǎn)品的質(zhì)量和療效[2]。抑菌劑通過干擾微生物的生長、繁殖和新陳代謝過程發(fā)揮抑菌作用[3]。氧氟沙星滴眼液雖為廣譜抗菌藥物，但是在生產(chǎn)、貯藏、運輸以及反復使用和開啟包裝過程中，仍然有污染微生物的風險[4]，故亦需要加入抑菌劑。從2015年版《中國藥典》開始，將“抑菌效力檢查法”由以往的指導原則變?yōu)檎綑z查項目。本試驗按照2015年版《中國藥典》“通則1121”“抑菌效力檢查法”項下要求對氧氟沙星滴眼液的抑菌效力進行測定，以判定其抑菌效力是否達標。

1 材料

1.1 儀器

HF safe-1500型生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；KB240型恒溫培養(yǎng)箱（德國Binder公司）；HVE-50型全自動高壓滅菌鍋（日本Hirayama公司）；YX930D型電動吸引器（上海醫(yī)療器械工業(yè)公司醫(yī)用吸引器廠）。

1.2 藥品

氧氟沙星滴眼液（遼寧某企業(yè)生產(chǎn)，規(guī)格：8 mL∶24 mg，批號：15021，使用的抑菌劑是羥苯乙酯，抑菌劑含量為0.025%）。

1.3 菌種

大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]均由中國食品藥品檢定研究院提供，菌株傳代數(shù)均為第四代。

1.4 培養(yǎng)基和試劑

胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA，美國BD公司，批號：1221965）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，北京陸橋技術股份有限公司，批號：141030）；氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20141029）；pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（青島藍雁綠檢生物技術有限公司，批號：20150212）。培養(yǎng)基適用性檢查試驗結(jié)果符合2015年版《中國藥典》要求。

2 方法

2.1 菌液制備

取經(jīng)33℃培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的TSA斜面培養(yǎng)物適量，用接種環(huán)研細并加入到0.9%無菌氯化鈉溶液中，制成適宜濃度的菌懸液。

取經(jīng)24℃培養(yǎng)24 h的白色念珠菌的SDA斜面培養(yǎng)物適量，用接種環(huán)研細并加入到0.9%無菌氯化鈉溶液中，制成適宜濃度的菌懸液。

取經(jīng)24℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉的SDA斜面培養(yǎng)物適量，加5 mL含0.05%（V/V）聚山梨酯-80的0.9%無菌氯化鈉溶液，洗下霉菌孢子，制成適宜濃度的孢子懸液。

2.2 菌落計數(shù)方法適用性試驗

2.2.1 供試液制備 取樣品10 mL，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，振蕩使分散均勻，作為1∶10供試液。

2.2.2 細菌計數(shù)（薄膜過濾法） 取“2.2.1”項下1∶10供試液1 mL，溶于pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL中，薄膜濾過，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，總沖洗量為1 000 mL，每次沖洗50 mL，在最后一次沖洗液中加入50～100 cfu試驗菌（金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌或銅綠假單胞菌），濾過，依法進行計數(shù)。

2.2.3 真菌計數(shù)（常規(guī)法） 取“2.2.1”項下1∶10供試液9.9 mL，2份，分別加入2種試驗菌（白色念珠菌、黑曲霉）0.1 mL（含菌量約為104cfu/mL），混勻，立即分別取1 mL注入平皿，傾注SDA，按平皿法測定其菌落數(shù)。

2.2.4 回收率測定 回收率＝（試驗組菌數(shù)－供試液對照組菌數(shù)）/菌液組菌數(shù)×100%。試驗組菌數(shù)：分別按“2.2.2”“2.2.3”項下的菌落計數(shù)方法進行試驗，計算供試液的平均菌落數(shù)；菌液組菌數(shù)：測定加入樣品的每一株菌的菌數(shù)；供試液對照組菌數(shù)：取“2.2.1”項下1∶10供試液1 mL，按上述菌落計數(shù)方法測定樣品本底菌數(shù)。

2.3 抑菌效力測定

2.3.1 供試品接種 試驗組：取包裝完整的樣品5瓶，分別依次接種上述金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉菌懸液80 μL，使其最終菌濃度為105～106cfu/mL，使樣品與試驗菌充分混合均勻。置于20～25℃避光保存。

菌液組：取5個無菌試管，分別加入0.9%無菌氯化鈉溶液8 mL，然后分別接種上述金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉菌懸液80 μL，使其最終菌濃度為105～106cfu/mL，充分混合均勻，依次10倍梯度稀釋，分別吸取各稀釋度菌液1 mL，注入平皿中，傾注相應瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)，計數(shù)，計算出相當于1 mL樣品中各試驗菌所加的菌數(shù)。

2.3.2 存活菌數(shù)測定 本品為眼用制劑，按2015年版《中國藥典》“通則1121”“抑菌效力檢查法”項下要求，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌分別于接種試驗菌后的6 h、24 h、7 d、28 d測定供試品中所含菌數(shù)，從上述添加試驗菌的樣品中取1 mL，依次10倍梯度稀釋，吸取適宜計數(shù)的梯度的供試品溶液適量，按照氧氟沙星滴眼液方法適用性試驗所確定的菌落計數(shù)方法，采用TSA，測定供試液中所含的細菌數(shù)；白色念珠菌和黑曲霉分別于接種試驗菌后的7、14、28 d測定樣品中所含菌數(shù)，從上述添加試驗菌的樣品中取1 mL，依次10倍梯度稀釋，吸取適宜計數(shù)的梯度的樣品溶液適量，按照氧氟沙星滴眼液方法適用性試驗所確定的菌落計數(shù)方法，采用SDA，測定供試液中所含的真菌數(shù)。

根據(jù)存活菌數(shù)測定結(jié)果，計算1 mL樣品各試驗菌所加的菌數(shù)及各間隔時間的菌數(shù)，并換算成lg值。

3 結(jié)果

3.1 菌落計數(shù)方法適用性試驗結(jié)果

氧氟沙星滴眼液樣品細菌數(shù)、真菌數(shù)菌落計數(shù)及回收率測定結(jié)果見表1。結(jié)果表明，在3次獨立的平行試驗中，薄膜過濾法測定細菌數(shù)、常規(guī)法測定真菌數(shù)的回收率均＞70%。根據(jù)此結(jié)果，確定氧氟沙星滴眼液樣品微生物限度檢查法細菌計數(shù)可采用薄膜過濾法，真菌計數(shù)可采用常規(guī)法。

表1 菌落計數(shù)及回收率結(jié)果Tab 1 Colony count and the recovery results

3.2 抑菌效力測定結(jié)果

氧氟沙星滴眼液樣品抑菌效力測定結(jié)果見表2。

表2 抑菌效力測定結(jié)果Tab 2 Determination results of antibacterial effectiveness

由表2可知，試驗組的細菌數(shù)與菌液組相比，各菌種6 h菌數(shù)lg值下降不能全部達到2，24 h菌數(shù)lg值下降不能全部達到3，而能夠全部＞1，7 d菌數(shù)lg值下降能夠全部＞3，而28 d菌數(shù)lg值未再增加。本品為眼用制劑，按2015年版《中國藥典》“通則1121”“抑菌效力檢查法”項下要求，氧氟沙星滴眼液樣品對細菌能達到“B”的抑菌效力標準。試驗組的真菌數(shù)與菌液組相比，各菌種7 d菌數(shù)lg值下降不能全部達到2，14 d菌數(shù)lg值下降全部＞1，而28 d菌數(shù)lg值未再增加。本品為眼用制劑，按2015年版《中國藥典》“通則1121”“抑菌效力檢查法”項下要求，氧氟沙星滴眼液樣品對真菌能達到“B”的抑菌效力標準。

綜上所述，氧氟沙星滴眼液樣品達到“B”的抑菌效力標準。采用2015年版《中國藥典》“通則1121”“抑菌效力檢查法”項下方法可有效地判定氧氟沙星滴眼液的抑菌效力是否達標。

4 討論

眼用制劑的抑菌劑要求對眼睛的刺激性較小，適用的抑菌劑根據(jù)結(jié)構和化學性質(zhì)可以分為有機汞類、季銨鹽類、醇類、酯類和酸類[5]。本試驗考察的氧氟沙星滴眼液中的抑菌劑是酯類的羥苯乙酯。羥苯乙酯適宜的pH范圍很大，且具有廣譜抗菌活性，其水溶液在pH 3～6的范圍內(nèi)可熱壓滅菌不發(fā)生降解[6]。本試驗結(jié)果顯示，氧氟沙星滴眼液加入0.025%的抑菌劑羥苯乙酯后能夠達到“B”的抑菌效力標準。

藥品生產(chǎn)企業(yè)在篩選抑菌劑時應采用最低有效濃度，既要達到抑制微生物生長的目的，又要使抑菌劑對眼睛的刺激和損害降至最低[7]。氧氟沙星滴眼液抗細菌作用較強，對霉菌、酵母菌的抑制作用較弱，采用抑制霉菌、酵母菌作用較強且毒性較小的羥苯乙酯作為抑菌劑較為適宜。抑菌劑的正確選擇與合理使用是一項系統(tǒng)工程，需要根據(jù)產(chǎn)品特點、貯藏條件等因素進行抑菌效力試驗，選擇合理的抑菌劑，以確保產(chǎn)品安全、有效和穩(wěn)定[7-8]。

[1] 闞全程，于玲，張曉堅，等.氧氟沙星滴眼液臨床療效探討[J].河南醫(yī)藥信息，2000，8（1）：44-45.

[2] 張世磊，白若琬，李津，等.萘敏維滴眼液的抑菌效力測定[J].食品與藥品，2011，13（1）：42-44.

[3] 寧黎麗，趙德恒.對多劑量眼用制劑不添加抑菌劑的思考[J].中國新藥雜志，2009，18（7）：589-591.

[4] 梁光江，王延東，葉成添，等.滴眼劑中常用幾種抑菌劑的應用和觀察[J].今日藥學，2010，20（3）：43-44.

[5] 安彥.眼用制劑中抑菌劑的應用與質(zhì)量控制[J].天津藥學，2011，23（1）：56-58.

[6] 張世磊，賀艷麗.眼用制劑中抑菌劑的應用[J].食品與藥品，2010，12（9）：343-347.

[7] 尚悅，韓鵬，許華玉.關于眼用制劑中添加抑菌劑的思考[J].中國藥品標準，2014，15（1）：12-15.

[8] 寧黎麗.眼用制劑研發(fā)過程中應關注抑菌劑的合理使用和質(zhì)量控制[J].中國藥學雜志，2007，42（23）：1836-1838.

（編輯：周 箐）

Determination of Antibacterial Effect of Ofloxacin Eye Drop

LI Hao1，ZOU Yu1，ZHANG Fan2，ZHANG Yajie1（1.Liaoning Institute for Drug Control，Shenyang 110036，China；2.Shenyang Sunshine Pharmaceutical Co.Ltd.，Shenyang 110027，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of antibacterial effect of Ofloxacin eye drop.METHODS：According to the requirements in Chinese Pharmacopoeia（2015 edition）“antibacterial effect test”，using Staphylococcus aureus，Pseudomonas aeruginosa，Escherichia coli，Aspergillus niger and Candida albicans as test bacteria，colonycount method suitability test was conducted for Ofloxacin eye drop samples，the verified method was used to determine the number of viable bacteria at each time point，calculate the bacteria number of 1 mL in the sample and the number of bacteria at each time point and convert to lg value.RESULTS：Ofloxacin eye drop sample can reach the standard of antibacterial effectiveness of the“B”.CONCLUSIONS：The method can effectively determine whether the antibacterial effect of Ofloxacin eye drop fits the standard.

Ofloxacin eye drop；Colony count；Antibacterial effect test method

R927

A

1001-0408（2017）06-0841-03

2016-03-02

2017-01-12）

＊主管藥師，碩士。研究方向：微生物檢驗。電話：024-31266313。E-mail：h-o-lee@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.06.33