甜葉菊渣中總黃酮的純化工藝研究

史高峰，王紅玉，陳學(xué)福，王國英，宮建輝

蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，蘭州 730050

甜葉菊(Stevia rebaudiana Bertoni)屬菊科多年生草本植物，原產(chǎn)于南美巴拉圭和巴西［1］，是目前已知甜度較高的糖料植物之一。甜葉菊性味甘、平，不僅富含甜菊糖苷，還含有甾醇類和黃酮類成分［2］。黃酮類化合物具有抗菌、抗病毒、抗肌瘤、抗氧化、抗自由基、抗炎、鎮(zhèn)痛和保肝等活性［3］。甜葉菊中的黃酮類化合物具有良好的降糖降壓降脂的生物活性［4］。目前關(guān)于甜葉菊黃酮類化合物的研究尚不充分，尤其是在甜葉菊黃酮的分離純化方面，報(bào)道很少，而大孔吸附樹脂是近十幾年發(fā)展起來的一類有機(jī)高分子聚合物吸附劑，近年來已廣泛用于植物有效成分的分離純化，如分離純化皂苷、黃酮、生物堿等［5-7］。因此，本研究對大孔吸附樹脂及溶劑萃取法分離純化甜葉菊總黃酮進(jìn)行初步的研究，探索適宜的純化條件，為甜葉菊葉活性成分的研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為合理開發(fā)甜葉菊資源提供必要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

甜葉菊(甘肅酒泉)經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)系馬志忠教授鑒定;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥92.5%)，中國藥品生物制品檢定所;D101、NKA-9、AB-8型大孔吸附樹脂(安徽三星樹脂科技有限公司);實(shí)驗(yàn)室自制蒸餾水、甲醇(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

U-2001紫外可見分光光度計(jì)(Hitachi，Ltd.，日本東京);AL204電子分析天平［梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司］;SHZ-D(III)型循環(huán)水真空泵(天津華鑫儀器廠);RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(揚(yáng)州鴻都電子有限公司);EQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取5 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇超聲溶解于25 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得到濃度為0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.6、1.0、1.4、2.2、3.0 mL 分別置于 10 mL 的容量瓶中，依次加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，最后加入4%NaOH溶液4.0 mL，用無水甲醇定容，搖勻，此時(shí)溶液顏色變?yōu)槌燃t色，放置15 min，以甲醇作空白，在510 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性回歸方程為:A=8．8051C-0．0042，R2=0.9997 ［A 為吸光度，C為總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/mL)］。結(jié)果表明，在蘆丁質(zhì)量濃度為0.004～0.060 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 甜葉菊總黃酮粗提物的制備

稱取甜葉菊渣100 g，在乙醇體積濃度80%、提取時(shí)間2.5 h、料液比1∶20(g/mL)、溫度80℃的條件下回流提取3次，合并提取液真空濃縮至無醇味，干燥得粗黃酮浸膏，純度為20.56%，蒸餾水超聲溶解配制1.2 mg/mL的總黃酮樣液，4℃冷藏備用。

2.3 大孔樹脂的預(yù)處理

分別稱取適量的AB-8、D101、NKA-9三種樹脂，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹和初步除雜，用濕法裝柱，繼續(xù)用95%的乙醇以適當(dāng)流速通過柱子，用乙醇洗滌至流出液加適量蒸餾水無白色渾濁現(xiàn)象后，再用蒸餾水洗凈乙醇。然后用5%HCl溶液浸泡3 h后蒸餾水洗至中性，再用4%NaOH溶液浸泡3 h后蒸餾水洗至中性，用蒸餾水浸泡備用［8］。

2.4 大孔吸附樹脂類型的篩選

2.4.1 大孔樹脂吸附率和解吸率的測定

本實(shí)驗(yàn)選取AB-8、D101、NKA-9三種不同型號的大孔吸附樹脂對甜葉菊黃酮粗提液進(jìn)行處理，探討適合甜葉菊黃酮的最優(yōu)樹脂。分別取預(yù)處理好三種大孔吸附樹脂各5.0 g，分別置于250 mL錐形瓶中，各加入總黃酮溶液(濃度1.2 mg/mL)50 mL，塞上塞子，120 rpm、30℃恒溫振蕩24 h，充分吸附后抽濾，測定濾液中黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算各樹脂吸附率。將吸附飽和的大孔樹脂加蒸餾水洗至糖的Molish反應(yīng)為陰性，再用70%乙醇50 mL，120 rpm、30℃恒溫振蕩24 h，抽濾，收集濾液測定濾液中的黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算各樹脂的解吸率。

C0:吸附前樣品液中總黃酮質(zhì)量濃度mg/mL;V0:吸附前樣液體積mL;

C1:吸附后殘液中總黃酮質(zhì)量濃度mg/mL;V1:吸附后殘液體積mL;

C2:解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度mg/mL;V2:解吸液體積mL;

M1:黃酮質(zhì)量;M:浸膏質(zhì)量;

2.4.2 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)特性測定

進(jìn)行靜態(tài)吸附動力學(xué)測定，進(jìn)一步篩選最佳樹脂。準(zhǔn)確稱取處理好的樹脂5.0 g，用濾紙吸干表面水分，裝入250 mL錐形瓶中，加入質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL黃酮提取液50 mL，120 rpm、30℃恒溫振蕩吸附，每隔1 h取樣1 mL，測定其黃酮質(zhì)量濃度，繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線［9］。

2.4.3 大孔樹脂的動態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

由篩選實(shí)驗(yàn)篩選出一種理想大孔吸附樹脂，稱取15 g已經(jīng)預(yù)處理的最佳樹脂，濕法裝入1.5×25 cm層析柱中，考察上樣流速、上樣液質(zhì)量濃度、上樣液pH值、上樣量、解吸液體積濃度、用量以及流速等進(jìn)行動態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)，確定最佳工藝條件。

2.5 溶劑萃取法純化總黃酮

通過研究溶劑種類、萃取溫度、萃取次數(shù)3個(gè)單因素對大孔樹脂純化后總黃酮純度的影響，篩選出溶劑萃取法的最佳工藝條件。

3 結(jié)果與分析

3.1 大孔樹脂的篩選

3.1.1 3種大孔樹脂吸附量與解吸率

如表1所示，雖然AB-8和D101大孔樹脂的解吸率差不多，卻明顯高于NKA-9，而且AB-8的吸附率高于D101和 NKA-9，實(shí)驗(yàn)中選擇AB-8和 D101這2種樹脂通過靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

表1 3種大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解吸Table 1 Static adsorption rates and desorption rates of three types of macroporous resins

3.1.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

在樹脂靜態(tài)吸附過程中，吸附動力學(xué)曲線反映了吸附量與吸附時(shí)間之間的關(guān)系。流出液中黃酮的濃度越大就說明吸附量越小，從圖1看出，大孔吸附樹脂AB-8、D101在4 h以內(nèi)流出液黃酮濃度波動較大，呈下降趨勢，即吸附量波動較大，呈上升趨勢;5 h后趨勢變緩，2種樹脂對甜葉菊總黃酮的吸附飽和時(shí)間都在5 h左右，但從總體上來看AB-8吸附量始終優(yōu)于D101，故選取AB-8進(jìn)行產(chǎn)品純化。

3.2 大孔樹脂對黃酮的動態(tài)吸附與解吸

3.2.1 上樣流速對AB-8吸附的影響

取甜葉菊黃酮提取液50 mL(1.2 mg/mL)，以不同的流速上樣，測定吸附后溶液中總黃酮濃度，計(jì)算吸附率。結(jié)果如圖2所示，吸附率隨上樣流速增大而降低，流速在1 mL/min～2 mL/min時(shí)，下降趨勢小;在2 mL/min～4 mL/min時(shí)下降趨勢明顯較大。其原因可能是流速較慢時(shí)提取液與樹脂接觸的時(shí)間較長，有利于黃酮類物質(zhì)從液相擴(kuò)散到樹脂內(nèi)部，從而提高了吸附率［10］。因此，為了節(jié)省時(shí)間，選擇上樣流速為2 mL/min。

3.2.2 上樣液質(zhì)量濃度對AB-8吸附的影響

將甜葉菊黃酮溶液稀釋成0.38、0.75、1.20、1.50、1.93、2.50 mg/mL 等不同濃度的上樣液，各50 mL，以2 mL/min的流速上樣，測定吸附后溶液中總黃酮濃度，計(jì)算吸附率。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)樣液濃度小于1.5 mg/mL時(shí)，隨著樣液濃度的增大，吸附率增大;當(dāng)樣液濃度為1.5 mg/mL時(shí)，吸附率達(dá)到最大值;隨后，隨著樣液濃度的增大，吸附率減小。所以，并不是濃度越大吸附效果越好，藥液的澄清度也會影響樹脂的吸附效果，且如果樣品溶液濃度超過了樹脂吸附極限，黃酮類物質(zhì)就會過早流出，導(dǎo)致吸附率降低。因此，選擇上樣液質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL。

3.2.3 上樣液pH值對AB-8吸附的影響

將濃度為1.5 mg/mL的甜葉菊總黃酮提取液分別調(diào)成 pH 2.5、3.5、4.5、5.5，以 2 mL/min 流速上樣，測定吸附后溶液中總黃酮濃度，計(jì)算吸附率。由圖4可知，樣液的pH值對吸附率的影響較大。在pH 3.5時(shí)吸附率達(dá)到最大值，之后，隨著pH的增大，吸附率反而減小。這是由于黃酮類化合物具有多羥基酚結(jié)構(gòu)，呈弱酸性，在酸性條件下呈分子狀態(tài)，以氫鍵方式被吸附，因而樹脂吸附量大，但若酸性過強(qiáng)，黃酮類化合物易生成烊鹽，使吸附效果變差。堿性增大則H質(zhì)子易于被強(qiáng)堿俘獲，使酚羥基上的氫解離形成酸根離子，與樹脂的結(jié)合減弱從而使吸附量降低［11］。因而AB-8在弱酸性或酸性條件下對甜葉菊總黃酮吸附的效果較好。因此，上樣液pH值控制在3.5左右。

3.2.4 上樣量對AB-8吸附的影響

取甜葉菊黃酮提取液，濃度為1.5 mg/mL，pH為3.5，以2 mL/min的流速上樣，收集每1 BV的流出液，測定流出液中總黃酮濃度。結(jié)果如圖5所示，隨著上樣量的增大，流出液中總黃酮的濃度呈上趨勢。當(dāng)上樣量達(dá)到4 BV時(shí)，黃酮濃度達(dá)到0.17 mg/mL，超過上樣濃度的10%，已達(dá)到泄漏點(diǎn)，因此，選擇上樣量為4 BV。

3.2.5 解吸液體積濃度對AB-8吸附及黃酮純度的影響

取甜葉菊黃酮提取液，濃度為1.5 mg/mL，pH為3.5，以2 mL/min的流速上樣4 BV，分別用水、10%、30%、50%、70%、90%等不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行洗脫，解吸液為4 BV。測定解吸液中總黃酮濃度，計(jì)算解吸率及純度。結(jié)果如圖6所示，當(dāng)乙醇濃度小于50%時(shí)，解吸率和黃酮純度都隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增大，50%乙醇解吸率最大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于50%時(shí)，解吸率及純度都呈下降趨勢?？赡苁怯捎谝掖俭w積分?jǐn)?shù)增大，醇溶性的雜質(zhì)增多，降低了解吸率和總黃酮純度。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

3.2.6 解吸流速對AB-8吸附的影響

取甜葉菊黃酮提取液，濃度為1.5 mg/mL，pH 3.5，以2 mL/min的流速上樣4 BV，分別用50%的乙醇溶液以1、1.5、2、2.5 mL/min的流速解吸。測定解吸液中總黃酮濃度，計(jì)算解吸率。結(jié)果如圖7所示，當(dāng)解吸流速小于1.5 mL/min時(shí)，解吸率隨著解吸流速的增大而增大;解吸流速為1.5 mL/min時(shí)，解吸率達(dá)到最大值;解吸流速大于1.5 mL/min時(shí)，解吸率反而隨著解吸流速的增大而減小。這是由于解吸流速太慢時(shí)，解吸時(shí)間長、解吸的雜質(zhì)多;流速太快時(shí)，解吸液與大孔樹脂接觸時(shí)間太短，導(dǎo)致解吸不完全。因此，選擇解吸流速為1.5 mL/min。

3.2.7 解吸液量對AB-8吸附的影響

取甜葉菊黃酮提取液，濃度為1.5 mg/mL，pH為3.5，以2 mL/min的流速上樣4 BV，用50%的乙醇溶液以1.5 mL/min的流速解吸。收集每1 BV的解吸液，測定解吸液中黃酮濃度，計(jì)算解吸率。結(jié)果如圖8所示，在解吸量小于5 BV時(shí)，隨著解吸量的增大，解吸率急劇上升;解吸量大于5 BV時(shí)，解吸率變化不大，說明總黃酮已基本洗脫完全?？紤]到溶劑的消耗，因此，選擇解吸液量為5 BV。

3.2.8 動態(tài)吸附解吸驗(yàn)證

準(zhǔn)確稱取120 g經(jīng)預(yù)處理好的AB-8型大孔樹脂2份，裝入3 cm ×50 cm層析柱，在最佳工藝條件下初步分離純化甜葉菊渣中總黃酮。最佳工藝條件:上樣液質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，上樣液pH 3.5，吸附流速為2 mL/min，上樣量為4 BV進(jìn)行動態(tài)吸附。樹脂經(jīng)飽和吸附后，以蒸餾水洗脫至無色，除去水溶性的雜質(zhì)。然后用50%的乙醇進(jìn)行解吸，解吸流速為1.5 mL/min，收集5 BV的解吸液，真空濃縮，干燥得棕黃色的總黃酮粉末。用紫外分光光度法測得純化后的總黃酮純度為50.11%，約為純化前的2.5倍。

3.3 溶劑萃取法純化總黃酮

3.3.1 溶劑種類對甜葉菊總黃酮的影響

取AB-8大孔樹脂純化后的總黃酮0.1 g三份，蒸餾水超聲溶解于20 mL燒杯中，常溫下，分別用等體積的乙醚、乙酸乙酯、氯仿萃取總黃酮，萃取3次，合并有機(jī)相，回收溶劑，干燥得淡黃色的總黃酮粉末，測黃酮的得率及純度。結(jié)果如圖9所示，乙酸乙酯萃取總黃酮得率和純度均最高，乙醚萃取效果次之，氯仿萃取效果最差。原因可能是由于乙醚萃取的脂溶性成分較多，使活性物質(zhì)黃酮溶出減少，降低了得率和純度，而氯仿由于極性太小，萃取出的黃酮少。故選擇乙酸乙酯為萃取溶劑。

圖9 溶劑種類的影響Fig.9 Effect of types of solvent

圖10 萃取溫度的影響Fig.10 Effect of extraction temperature

3.3.2 萃取溫度對甜葉菊總黃酮的影響

如3.3.1方法制備總黃酮樣液，用等體積的乙酸乙酯分別在30、40、50、60℃下萃取總黃酮，萃取3次，測黃酮的得率及純度。結(jié)果如圖10所示，隨著萃取溫度的升高，總黃酮得率升高，而純度卻降低了。原因是由于隨著溫度的升高，黃酮的溶解度增大，得率就高，但雜質(zhì)的溶解度也增大了，所以就導(dǎo)致純度下降了。考慮到升高溫度會增大溶劑的蒸發(fā)，浪費(fèi)溶劑，還增加熱能的消耗，故選擇30℃，也就是常溫下萃取。

3.3.3 萃取次數(shù)對甜葉菊總黃酮的影響

如3.3.1方法制備總黃酮樣液，在常溫下，用等體積的乙酸乙酯萃取總黃酮，測每次萃取的總黃酮的得率及純度。結(jié)果如圖11所示，隨著萃取次數(shù)的增加，總黃酮得率呈上升趨勢，但當(dāng)萃取次數(shù)達(dá)到5次時(shí)，總黃酮得率趨勢平緩，考慮到溶劑的浪費(fèi)，故選擇萃取5次。

圖11 萃取次數(shù)的影響Fig.11 Effect of extraction times

3.3.4 溶劑萃取驗(yàn)證

取三份初步純化的總黃酮，用乙酸乙酯在常溫條件下萃取5次，純度由50.11%上升到91.8%。

4 結(jié)論

AB-8型樹脂對甜葉菊總黃酮的吸附量大、吸附率高、易解吸，產(chǎn)品純度較高，是一種良好的黃酮吸附劑，適用于甜葉菊總黃酮的純化。最佳純化條件為:吸附流速2 mL/min、上樣液質(zhì)量濃度1.5 mg/mL、上樣液pH 3.5、上樣量4 BV、解吸液為體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液，解吸流速1.5 mL/min、解吸量5 BV，經(jīng)處理后總黃酮純度為50.11%，約為純化前的2.5倍。后用乙酸乙酯在常溫條件下萃取5次，得到甜葉菊渣中總黃酮純度為91.8%。結(jié)果表明:通過AB-8大孔樹脂吸附和乙酸乙酯萃取相結(jié)合的方法，能很好的純化甜葉菊渣中總黃酮。

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