真菌誘導(dǎo)海南龍血樹生產(chǎn)血竭

許小鳳，李尚真，宋啟示*

1中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，昆明 650223;2中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

血竭作為一種名貴中藥，其藥理作用已經(jīng)得到系統(tǒng)研究，并被證實具有活血和止血的雙重功效，另外，它還具有抗菌、抗毒、抗氧化、抗腫瘤等作用［1］。20世紀(jì)70年代以前，我國所用血竭均為國外進口，直至1972年植物學(xué)家蔡希陶在云南孟連縣首次發(fā)現(xiàn)能夠提制血竭的劍葉龍血樹［Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen］后，國產(chǎn)血竭的生產(chǎn)和應(yīng)用才真正開始［2］。2004年又有學(xué)者發(fā)現(xiàn)海南龍血樹(D．cambodiana Pierre ex Gagnep)可以作為血竭的另一基源植物［3］。血竭形成主要原因是物理損傷和真菌誘導(dǎo)，然而由龍血樹自然損傷形成血竭，其過程十分緩慢，需要十幾年甚至幾十年。目前自然形成的血竭產(chǎn)量遠遠不能滿足急劇上升的市場需求，因此人工誘導(dǎo)血竭生產(chǎn)已成為當(dāng)務(wù)之急。近年來，國內(nèi)學(xué)者江東福、王興紅等［4，5］將從龍血樹莖桿上分離得到的鐮刀菌屬菌株回接于龍血樹枝條內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這些菌株對于血竭的形成具有良好的誘導(dǎo)作用，這表明鐮刀菌屬真菌和血竭的形成有一定的關(guān)系。本研究采用代號為brwg鐮刀菌屬真菌為誘導(dǎo)因子，以不同的處理方式將真菌回接于海南龍血樹的活體莖干部位，以龍血素A和龍血素B作為檢測標(biāo)準(zhǔn)，探討不同處理方法對血竭產(chǎn)量的影響，從而為人工接菌誘導(dǎo)血竭生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 儀器與材料

1.1 供試材料

海南龍血樹是位于云南省勐侖鎮(zhèn)中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園綜合實驗樓旁;所用真菌是2002年從劍葉龍血樹莖桿帶紅色脂塊損傷部位分離得到的一株真菌(代號brwg)，經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所鑒定為鐮刀菌屬真菌Fusarium graminearum，菌種保藏于中國科學(xué)院微生物研究所;血竭藥品為雨林牌龍血竭膠囊，國藥準(zhǔn)字Z53021514，購于西雙版納雨林制藥有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號051101;高氮培養(yǎng)基(酵母膏0.1 g，蔗糖2 g，蛋白胨5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL);高碳培養(yǎng)基(酵母膏0.1 g，蔗糖10 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1000 mL);PDA培養(yǎng)基(土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1000 mL)。

1.2 實驗試劑

龍血素A對照品(實驗室前期分離得到)，龍血素B對照品(中國藥品生物制品檢定所)，甲醇、乙腈均為色譜純，冰乙酸為分析純，水為娃哈哈純凈水。

1.3 實驗儀器

98-1-B型加熱提取器、SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺、GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱、HZQF160型全溫振蕩培養(yǎng)箱、BüCHI R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、Waters高效液相色譜儀、AL104型電子天平、HS10260D型超聲波震蕩儀、電鉆、80-2型離心沉淀機等。

2 實驗方法

2.1 真菌代謝產(chǎn)物檢測實驗

配制高碳、高氮、PDA平板培養(yǎng)基三組，高溫滅菌后均接入brwg真菌，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。觀察記錄真菌生長狀況。再將生長有真菌的平板培養(yǎng)基分別置于16、28、35℃的環(huán)境下培養(yǎng)7 d。取出培養(yǎng)完全的真菌，冷凍干燥24 h，并磨成粉末，用甲醇超聲提取，并濃縮得到真菌代謝產(chǎn)物。用HPLC方法檢測其成分。

2.2 菌株回接實驗

選取自然條件下生長的海南龍血樹直徑約3 cm的生長健康的枝條，用電鉆鉆孔，孔徑1.2 cm，孔深為枝條直徑的2/3。做不同處理，處理①:只鉆孔不接菌，不扎傷口，讓傷口裸露于空氣中;處理②:用滴管將菌懸液(菌株搖床培養(yǎng)所得)滴入孔中，不扎傷口，使其接菌部位自然裸露;處理③:用滴管將菌懸液滴入孔中，并用塑料帶扎緊傷口，盡量不讓傷口接觸空氣。以不做任何處理的枝條作為空白對照0。處理過的枝條自然生長4年后采集樣品進一步實驗。每種處理做5個重復(fù)。

2.3 樣品預(yù)處理

經(jīng)①、②、③處理過的枝條鉆孔部位均呈現(xiàn)了不同程度的紅色，將這些含紅色物質(zhì)的莖段鋸下并晾干磨成粉末。用甲醇加熱至沸騰回流提取，每批樣品共提取兩次，提取過程:加熱12 h后，冷卻，靜置12 h，取上層甲醇相。將得到的甲醇溶液濃縮蒸干，得到紅色粉末，即為待測樣品。取空白對照枝條作同樣預(yù)處理。

2.4 HPLC檢測方法

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品配制

準(zhǔn)確稱取龍血素A 2 mg和龍血素B 1 mg，加入色譜甲醇，超聲溶解30 min后定容至10 mL，將配置成的溶液稀釋10倍，即得到0.02 mg/mL的龍血素A溶液和0.01 mg/mL的龍血素B溶液。

2.4.2 待測樣品溶液配制

分別精確稱取各批次樣品100 mg，加入色譜甲醇溶解，超聲30 min，定容至10 mL，離心 10 min，經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾，即得待測樣品溶液。

2.4.3 血竭藥品溶液配制

稱取血竭藥品100 mg，加色譜甲醇溶解，超聲30 min 定容至10 mL，離心10 min，用0.45 μm 的濾膜過濾即得血竭藥品溶液，作為指紋圖譜的參照品溶液。

2.4.4 色譜條件

使用Waters 1525高效液相色譜系統(tǒng)，裝備Waters Symmetry C18柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)和Waters 2487紫外檢測器;設(shè)定柱溫為40℃，流動相:冰醋酸溶液(水∶醋酸 =100∶1)∶乙腈 =63∶37，流速為1 mL/min;檢測波長為274 nm。在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)按龍血素A、B峰計算均不低于10000，龍血素A峰和B峰的分離度大于1.27，龍血素A的保留時間約為28 min，龍血素B的保留時間約為30 min。

2.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 1、2、4、5、10、15、20 μL，按上述色譜條件測定色譜峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品進樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示龍血素A在20～400 ng、龍血素B在10～200 ng呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。龍血素A、B的回歸方程分別為:Y=3×106X+3294．5，R2=0.999;Y=5 ×106X-4201．7，R2=0.9993。

2.4.6 試驗樣品檢測

分別取待測樣品和對照品20 μL進樣。按照上述色譜條件測定色譜峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出龍血素A、龍血素B的含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

龍血素A與龍血素B在血脂塊中的含量通過如下公式計算:龍血素A(或者B)在血脂塊中的含量(mg/g)=［HPLC檢測樣品濃度(mg/mL)*龍血竭脂塊提取物重量(g)］/［龍血竭脂塊重量(g)*100 mL］，其中，每個處理中5個平行試驗結(jié)果的平均值代表該處理后的龍血素A和B的含量。采用SPSS13.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因子方差分析(One-Way ANOVA)檢驗不同處理中龍血素A和龍血素B含量之間的差異顯著性。

3 實驗結(jié)果

3.1 真菌單獨培養(yǎng)

圖1 三種不同培養(yǎng)基上真菌的生長狀況Fig.1 Fungi grown on three different mediums

三種培養(yǎng)基上真菌生長的狀況明顯不同，結(jié)果如圖1。PDA培養(yǎng)基上真菌長勢較好，正面菌絲密集呈白色，背面呈紅褐色;高碳培養(yǎng)基上，真菌幾乎不生長;高氮培養(yǎng)基上，真菌能夠生長，但是長勢一般，正面菌絲稀疏，背面呈粉色。不同溫度環(huán)境下培養(yǎng)的真菌，其代謝產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測結(jié)果如圖2。圖3是標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜，在30 min左右出現(xiàn)兩個峰a和b，分別表示龍血素A和龍血素B。圖2中30 min位置沒有色譜峰出現(xiàn)，表明真菌的代謝產(chǎn)物中不含有龍血素A和龍血素B。

3.2 三組不同的處理樣品及空白對照中龍血素A和龍血素B含量分析

龍血素A的含量在不同的處理中差異不顯著(表1);龍血素B在四組處理中含量差異顯著，在處理②中龍血素B的含量最高，而在處理①和處理③中龍血素B的含量差異不顯著。

3.3 三組不同處理樣品與龍血竭膠囊的指紋圖譜比較

指紋圖譜比較結(jié)果顯示不同處理的樣品的HPLC譜圖與龍血竭膠囊藥品的HPLC譜圖峰形大致相同，前25 min出峰較多，后25 min則比較少。

4 討論

將真菌brwg培養(yǎng)于不同的培養(yǎng)基上，生長狀況明顯差異，說明營養(yǎng)結(jié)構(gòu)不同對真菌的生長有刺激作用。再將培養(yǎng)有真菌的培養(yǎng)基置于不同的溫度環(huán)境下，以溫度作為其另一刺激因素，并檢測真菌的代謝產(chǎn)物。3.1實驗結(jié)果，檢測不同條件下培養(yǎng)的真菌代謝產(chǎn)物，其成分中均不含有龍血素A和龍血素B。而 Maria S.O.［6］和 F.Lecompte［7］等人指出微生物在溫度和不同的營養(yǎng)環(huán)境下，微生物會發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，其代謝產(chǎn)物會發(fā)生變化。這說明龍血素A和龍血素B不是真菌自身應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。

表1 不同處理血脂塊中的龍血素A、B含量的檢測結(jié)果(平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差，n=5)Table 1 The contents of loureirin A and loureirin B detected in dragon's bloods induced by different treatments(mean ± SD，n=5)

圖4 不同處理樣品與龍血竭膠囊的HPLC指紋圖譜比較Fig.4 Overlaid HPLC fingerprints of different samples

3.2實驗結(jié)果顯示海南龍血樹樹體本身含有龍血素A而不含有龍血素B，但是做過處理的龍血樹損傷部位受到空氣中微生物或真菌的侵染后均產(chǎn)生龍血素B，表明龍血素B的產(chǎn)生是微生物和龍血樹相互作用的結(jié)果。

表1顯示經(jīng)過不同的處理得到的血竭中龍血素A的含量差異不顯著，龍血素B的含量差異顯著，這一結(jié)果說明微生物的侵染對龍血素B的影響較大，而對龍血素A的影響很小，這也表明龍血素A與龍血素B的形成之間沒有明顯的關(guān)系，但目前龍血素B的形成機制仍不明確，所以本實驗結(jié)論需要進一步研究證實。

龍血素B含量在不同處理樣品中差異顯著。處理①作了打孔處理，受傷部位裸露在空氣中，受到空氣中微生物侵染;處理②在打孔部位接入真菌并將傷口裸露在空氣中，因此受傷部位既受到空氣中微生物的侵染又受到接種真菌的侵染;處理③在打孔部位接入真菌并將傷口扎緊，隔絕空氣，傷口部位僅僅受到接種真菌的侵染。表中結(jié)果顯示處理①、②、③中均含有龍血素B，處理③與處理①中龍血B的含量差異不明顯，而處理②中龍血素B的含量遠高于處理①、③。王興紅［8］2007年研究表明細菌、真菌共代謝有利于龍血樹產(chǎn)生紅色的抑菌分泌物，黃酮類成分龍血素B是血竭抑菌作用成分之一［9，10］。因此處理②中龍血素B的含量最高原因可能是龍血樹的莖干損傷部位受到空氣中的其他真菌及細菌與人工接入的brwg真菌共同作用，侵染能力增強，從而提高了龍血素B的含量。此外，處理②中接入傷口的菌株可以充分接觸空氣，也可能自身生長較好增強了其侵染能力，從而增加龍血素B的產(chǎn)量。龍血素B作為龍血竭的主要成分具有較好的抗血栓、抗血瘀、抗凝血等活血化瘀藥理作用［11］，而處理②對龍血素B的產(chǎn)生誘導(dǎo)效果最佳，從而為人工誘導(dǎo)血竭生產(chǎn)提供了方向。

指紋圖譜比較結(jié)果顯示經(jīng)過不同處理后的含脂塊與龍血竭藥品成分相似，真菌的接種沒有引起組成血竭的各個組分的明顯變化，保證了血竭品質(zhì)的穩(wěn)定。這進一步為人工接菌誘導(dǎo)血竭生產(chǎn)提供依據(jù)。人工接菌方法的優(yōu)勢在于:打孔傷口小且選擇樹體的側(cè)枝打孔不會影響龍血樹的存活;同一枝條可以同時多處打孔提高龍血竭產(chǎn)量;人工接入真菌增加了龍血樹的侵染機率，縮短了龍血竭生產(chǎn)周期。因此人工接菌方法有望解決目前龍血竭生產(chǎn)面臨的原料枯竭難題。

5 結(jié)論

本研究結(jié)果在支持了前人結(jié)果的基礎(chǔ)上，揭示了不同的接種方法對血竭中主要藥用成分龍血素A和B在血竭樹脂中的含量的影響。通過本研究，對海南龍血樹采用樹枝打孔處理，孔口接入菌種，保持孔口裸露的處理方式，能夠在保證血竭產(chǎn)品中龍血素A成分含量穩(wěn)定的情況下，明顯地增加龍血素B的含量，提高了血竭的品質(zhì)，所以打孔接種的這種高效穩(wěn)定方式，有利于大規(guī)模推廣。

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