桑黃抗氧化活性化合物的分離純化及結(jié)構(gòu)解析

王欽博，楊 焱，馮 娜，艾連中，穆海菠，杭 鋒，宋 馨

1乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室光明乳業(yè)股份有限公司，上海200436;2農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海201403

桑黃(Phellinus sp.)俗稱桑臣、桑耳、桑黃菇等，主要生長(zhǎng)于楊、松、桑、白樺等樹的樹干上，造成心材白腐，是一種珍貴的傳統(tǒng)藥用真菌，桑黃隸屬擔(dān)子菌亞門(Basidiomyeotina)，層菌綱(Hymenomycetes)、多孔菌目(polyporales)、銹革孔菌科(Hymenochaetacae)，針層孔菌屬(Phellinus)，又分為裂蹄層孔菌(Linteus)，鮑氏層孔菌(Baumii)，火木層孔菌(Igniarius)、瓦尼木層孔菌(Vaninii)，尤地層孔菌(Yucatanensis)等多個(gè)種。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的桑黃藥理活性已引起國(guó)際醫(yī)藥工業(yè)界和保健品行業(yè)專家的關(guān)注，有著相當(dāng)可觀的市場(chǎng)前景。目前對(duì)于桑黃藥理活性的研究多集中在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)免疫能力方面，此外，還有抗菌、抗氧化、降血糖、抗突變、抗纖維化、抗肺炎等作用。

目前對(duì)桑黃抗氧化的活性研究主要集中在不同萃取部分［1，2］，但少有針對(duì)較強(qiáng)抗氧化活性化合物的分離純化和結(jié)構(gòu)解析的研究報(bào)道。本文利用實(shí)驗(yàn)室前期得到的抗氧化效果較好的乙酸乙酯萃取相和正丁醇萃取相，針對(duì)其中的抗氧化活性化合物進(jìn)行分離純化，并對(duì)其結(jié)構(gòu)解析。為研究桑黃抗氧化物質(zhì)的作用原理、構(gòu)效關(guān)系及其活性物質(zhì)對(duì)人體的功效提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

桑黃PB-10(Phellinus baumii)子實(shí)體及菌種由上海市農(nóng)科院食用菌研究所提供，標(biāo)本存放于上海市農(nóng)科院食用菌研究所藥用真菌研究室。

桑黃(Phellinus Baumii)子實(shí)體的乙酸乙酯萃取相和正丁醇萃取相干燥后得到樣品;TLC薄層層析板(HSGF254)為煙臺(tái)匯友硅膠開發(fā)有限公司生產(chǎn);柱層析硅膠(100～200目)為青島海洋化工廠生產(chǎn)。乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇、30%雙氧水、氯化亞銅為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純?cè)噭?氘代試劑為美國(guó)Cambridge Isotope Laboratorics Inc.產(chǎn)品。0.05%胰蛋白酶、RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO(二甲基亞砜)購自GIBCO公司;脂多糖(LPS)、魯米諾、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、鄰苯三酚、鄰菲羅啉、兒茶素［(+)-catechin］購自 Simga公司;MTT(噻唑藍(lán))購自Biosource公司。PC12來自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品的分離純化

取乙酸乙酯萃取部分進(jìn)行硅膠(100～200目)層析，氯仿-甲醇(100∶0 ～ 60∶40)梯度洗脫，共收集211個(gè)流分。根據(jù)薄層層析(TLC)檢測(cè)結(jié)果合并相近的流份，合并為24個(gè)組分，分別是:A1(1-9)、A2(10-28)、A3(29-33)、A4(34-37)、A5(38-47)、A6(48-53)、A7(54-57)、A8(58-71)、A9(72-73)、A10(74-75)、A11(76-87)、A12(88-110)、A13(111-117)、A14(118-124)、A15(125-136)、A16(137-142)、A17(143-148)、A18(149-155)、A19(156-162)、A20(163-169)、A21(170-176)、A22(177-183)、A23(184-187)、A24(188-211)。

將A5上Sephadex LH-20柱層析，甲醇洗脫。收集20～36組分再經(jīng)聚酰胺層析，甲醇-水(30∶70～90∶10)梯度洗脫，其中1～11組分有沉淀析出，用甲醇反復(fù)洗滌，得到化合物1。

A6有沉淀析出，甲醇反復(fù)洗滌，得到化合物2。

A11有沉淀析出，甲醇反復(fù)洗滌，得到化合物3。

將 A12進(jìn)行聚酰胺層析，甲醇-水(50∶50 ～0∶10)梯度洗脫。其中10～52組分有沉淀析出，用甲醇反復(fù)洗滌，得到化合物4。64～81組分也有沉淀析出，用丙酮反復(fù)洗滌，得到化合物5。

取正丁醇部分用氯仿-甲醇(7∶3)超聲溶解，將其中的沉淀濾出，甲醇洗滌3次，得到的沉淀物質(zhì)命名為化合物6。

經(jīng)鑒定化合物5同化合物3為同一化合物，且化合物1和化合物4取得量較少，本文以化合物2、化合物3及化合物6作為抗氧化研究對(duì)象。

2.2 清除超氧陰離子實(shí)驗(yàn)

對(duì)于非酶體系的清除超氧陰離子實(shí)驗(yàn)有多種方法可以檢測(cè)，在本章實(shí)驗(yàn)中使用魯米諾-鄰苯三酚-CBS(碳酸鈉-碳酸氫鈉)體系的化學(xué)發(fā)光法。在郭藹光［3］等報(bào)道的化學(xué)發(fā)光方法基礎(chǔ)上作適當(dāng)?shù)男薷?。將樣品及陽性?duì)照均用95%乙醇配制成不同濃度(5、10、20、50、100、200 μg/mL)，用 95%乙醇作為空白，以兒茶素做為陽性對(duì)照組，在20℃啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)，每0.6 s記錄一次發(fā)光值，連續(xù)記錄30 s。超氧陰離子的清除率計(jì)算公式如下:

2.3 清除羥基自由基實(shí)驗(yàn)

方法參照HongFei Fu［4］的化學(xué)發(fā)光的方法，并稍作改動(dòng)。先于96孔板中加入10 μL 1 mmol/L CuCl和10 μL 1 mmol/L 鄰菲羅啉。后加入 10 μL用95%乙醇配制的不同濃度的樣品及陽性對(duì)照(0.05、0.1、0.5、1 、5、10 μg/mL)，用 95% 乙醇做為空白對(duì)照，以兒茶素做為陽性對(duì)照組。在20℃啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)，每0.6 s記錄一次發(fā)光值，連續(xù)記錄30 s。羥基清除率公式同超氧陰離子清除率計(jì)算公式。

2.4 清除DPPH·自由基實(shí)驗(yàn)

根據(jù) Brand-Williams［5］等所述方法，并稍做改動(dòng)。用70%乙醇將樣品及陽性對(duì)照配制成不同濃度(5、10、20、50、80 μg/mL)。以 70% 乙醇作為空白，以兒茶素做為陽性對(duì)照組。對(duì)DPPH·自由基清除率計(jì)算如下:

2.5 抑制NO·自由基產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［6］，并作適當(dāng)改動(dòng)。取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期179 μL細(xì)胞濃度為5×105的RAW264.7細(xì)胞加入96孔板，并加入1 μL不同濃度(2 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL)樣品，1 h后在96孔板中加入20 μL 10 μg/mL LPS，于37 ℃，5%的 CO2培養(yǎng)24 h后，吸取100 μL 上清，并加入 50 μL Griess試劑，混勻后放至25℃ 10 min，并于540 nm下測(cè)吸光值，以10 μg/mL LPS 組為陰性對(duì)照組。按照文獻(xiàn)［7］的方法計(jì)算細(xì)胞產(chǎn)生NO·含量。

2.6 對(duì)PC12神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)

參照胡金霞［8］實(shí)驗(yàn)方法，并略作改動(dòng)。將分離純化的單體分別用 DMSO溶解并稀釋成2、10、20 mg/mL的溶液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 PC12細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基稀釋至2×104個(gè)/mL。取190 μL細(xì)胞懸液接于96孔板中，然后分別加入10 μL 2.5 mmol H2O2刺激4 h。將全部培養(yǎng)基吸出后加入199 μL新鮮培養(yǎng)基和1 μL不同濃度樣品，每個(gè)樣品重復(fù)3孔，于5%CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，使用MTT方法測(cè)定PC12存活率(損傷組表示加入雙氧水刺激后不加任何樣品，只加入新鮮的培養(yǎng)基)。

2.7 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

對(duì)分離純化獲得的抗氧化較強(qiáng)的化合物進(jìn)行核磁共振和質(zhì)譜分析。1H NMR譜和13C NMR譜用Varian Inova 500型核磁共振儀(美國(guó)Varian公司)，以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)測(cè)定。API-ES用HP.5973N質(zhì)譜儀(美國(guó)HP公司)(以甲醇為溶劑)，直接進(jìn)樣測(cè)定。

2.8 數(shù)據(jù)分析

文中各項(xiàng)數(shù)據(jù)均用標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示，并使用SPSS 13.0分析軟件統(tǒng)計(jì)，將實(shí)驗(yàn)樣品組與對(duì)照組進(jìn)行比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 分離化合物清除超氧陰離子實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過純化后的化合物3在清除超氧陰離子能力方面有了明顯的提高，在高濃度時(shí)，乙酸乙酯相和化合物3對(duì)超氧陰離子的清除率較為接近，與陽性對(duì)照組相比，化合物3在100 μg/mL濃度以上時(shí)，對(duì)超氧陰離子清除率較高?；衔?也有一定的清除能力，但增加趨勢(shì)較弱(圖1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物2無清除超氧陰離子能力。

圖1 分離化合物清除超氧陰離子實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The superoxide scavenging ability of separated compounds and ethyl acetate extracts

3.2 清除羥基自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2看出，化合物3清除羥基自由基的作用與原乙酸乙酯相接近，略有提高。與陽性對(duì)照組相比，化合物3羥基清除率較低?；衔?也表現(xiàn)了一定的清除羥基自由基作用，但清除效果較乙酸乙酯萃取相低，而化合物2未表現(xiàn)出清除羥基自由基能力。

圖2 分離化合物清除羥基實(shí)驗(yàn)Fig.2 The hydroxyl radical-scavenging activity of separated compounds and ethyl acetate extracts

3.3 清除DPPH·自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果

清除DPPH·自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在20 μg/mL時(shí)，化合物3比乙酸乙酯相更有效地清除了DPPH·自由基(圖3)，與陽性對(duì)照組相比，化合物3在50 μg/mL濃度以上時(shí)，DPPH·清除率較高。化合物6清除DPPH·的能力相對(duì)較弱，化合物2基本無清除能力。當(dāng)樣品濃度高于50 μg/mL時(shí)，各樣品對(duì)DPPH·的清除能力基本達(dá)到最高值。

圖3 分離化合物清除DPPH·自由基實(shí)驗(yàn)Fig.3 The DPPH·scavenging activity of separated compounds and ethyl acetate extracts

3.4 抑制NO·產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由于NO脂溶性較強(qiáng)，能夠通過細(xì)胞膜，因此可以在細(xì)胞間起廣泛的作用。當(dāng)NO的含量過高時(shí)，NO會(huì)與其他自由基發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生損傷能力更強(qiáng)的亞硝基自由基。NO在體內(nèi)有三種存在形式—NO·、NO+、NO-，三者能與體內(nèi)多種化合物起反應(yīng)，使自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)不斷增長(zhǎng)。因此，有效清除體內(nèi)過量的NO·自由基也能起到抗氧化作用。

本實(shí)驗(yàn)利用巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生NO·自由基作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究了幾種分離化合物及乙酸乙酯相對(duì)NO·自由基的清除作用(圖4)，結(jié)果表明，乙酸乙酯相和化合物3能很有效地抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO·自由基，在高濃度組中，在兩者作用下的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO·自由基量與空白組產(chǎn)生量接近。而化合物6和化合物2在抑制NO·自由基產(chǎn)生上無效果。

圖5 分離化合物修復(fù)PC12實(shí)驗(yàn)Fig.5 Recovery of damaged PC12 nerve cells with separated compounds and ethyl extracts

3.5 分離純化樣品對(duì)神經(jīng)細(xì)胞PC12的損傷修復(fù)

從圖5中可以看出，乙酸乙酯相及分離的化合物3對(duì)損傷PC12細(xì)胞均有修復(fù)作用，低濃度下，化合物3對(duì)損傷PC12的修復(fù)作用相對(duì)乙酸乙酯相有了一定的提高。化合物6在中高濃度下有一定修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞的作用?；衔?的修復(fù)作用濃度依賴關(guān)系不夠明顯。

3.6 化合物3的結(jié)構(gòu)分析

抗氧化實(shí)驗(yàn)表明化合物3具有很好的清除自由基及細(xì)胞水平的抗氧化作用，采用核磁共振及質(zhì)譜分析方法對(duì)化合物3進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，其特征為:黃色無定形粉末，分子式為C25H18O9。

從化合物的正離子API-ES m/z:463.0［M+H］+和NMR譜可推斷其分子式為C25H18O9。從1H NMR上質(zhì)子的化學(xué)位移可以判斷化合物有一個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)δ 1.93(3H，s)、反式雙鍵上的兩個(gè)質(zhì)子信號(hào)［δ 6.79(1H，d，J=15 Hz)，δ 7.32(1H，d，J=14 Hz)］和六個(gè)芳香質(zhì)子信號(hào)［7.08(1H，s)，7.01(1H，d，J=8.0 Hz)，6.78(1H，d，J=8.5 Hz)，6.73(1H，d，J=8 Hz)，6.67(1H，d，J=1.5 Hz)，6.53(1H，t，J=1，8 Hz)］。從耦合常數(shù)判斷該化合物有兩個(gè)具有鄰位和對(duì)位取代的苯環(huán)結(jié)構(gòu)和一個(gè)反式烯鍵結(jié)構(gòu)。從13C NMR上的甲基碳信號(hào)(δ 16.2)、反式雙鍵的碳信號(hào)(115.8、137.5)和芳香碳信號(hào)(δ 114.4、145.7、148.2、115.9、121.2、121.1、114.6、144.9、146.3、115.2、118.7)進(jìn)一步印證了該化合物具有一個(gè)甲基、一個(gè)反式雙鍵和兩個(gè)芳香環(huán)的結(jié)構(gòu)的推測(cè)。此外，從13C NMR上還發(fā)現(xiàn)了羰基碳信號(hào)(δ 157.3、199.6)。由 H-H COSY、HMQC 和HMBC譜，找到化合物3的各個(gè)質(zhì)子和碳的連接，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［10］，得出該化合物是一種吡喃酮類的化合物(圖7)，首次從lnonotus xeranticus的甲醇萃取物中得到該化合物，并命名為Inoscavin A。

4 討論

自由基的產(chǎn)生和消失在正常的機(jī)體狀態(tài)下總是保持著平衡，當(dāng)自由基過多就會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定的氧化損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老、機(jī)體產(chǎn)生病變，因而抗氧化活性是天然物質(zhì)開發(fā)重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。有關(guān)環(huán)境傷害導(dǎo)致衰老和老年退行性疾病的最新研究多集中在自由基氧化和非酶糖基化的衰老領(lǐng)域中?？寡趸钚晕镔|(zhì)一方面能夠清除自由基的損傷;另一方面，抗氧化活性物質(zhì)可能通過提高機(jī)體內(nèi)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性，抑制脂質(zhì)過氧化，降低體內(nèi)丙二醛的生成，從而起到保護(hù)和修復(fù)機(jī)體組織細(xì)胞的作用，因而達(dá)到延緩衰老的目的［9］。由此可見，修復(fù)損傷細(xì)胞能力從細(xì)胞水平上反映了抗氧化物質(zhì)的活性。由此可見，修復(fù)損傷細(xì)胞的能力在細(xì)胞水平上為評(píng)價(jià)抗氧化作用提供了必要的參考。另有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于同一種抗氧化活性物質(zhì)，在不同的抗氧化模型中會(huì)出現(xiàn)不一致的作用效果［10］，有此，在抗氧化作用的研究中，往往引用多種抗氧化模型進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

本文以篩選出的抗氧化能力較強(qiáng)的桑黃(Phellinus baumii)子實(shí)體乙酸乙酯萃取相和正丁醇萃取相干燥樣品為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行分離純化，將純化后得到的化合物分別進(jìn)行清除超氧陰離子、羥基、DPPH·及NO·自由基和修復(fù)損傷神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了分離得到的化合物3具有較強(qiáng)的清除自由基能力，較乙酸乙酯萃取相的清除能力有所提高;化合物3對(duì)損傷的PC12神經(jīng)細(xì)胞也表現(xiàn)出很好的修復(fù)能力。對(duì)化合物3進(jìn)行1H NMR、13C NMR、DEPT、1H-1HCOSY、HMQC 等波譜分析并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［2］數(shù)據(jù)，鑒定出其化學(xué)式為C25H18O9，是一種吡喃酮類的化合物。Jong-Pyung Kim 等［2］首次從 lnonotus xeranticus的甲醇萃取物中得到該化合物，并命名為Inoscavin A，另外，莫順燕［9］從桑黃(Phellinus igniarius)乙酸乙酯萃取相也分離得到同樣的化合物。兩位學(xué)者對(duì)該化合物只進(jìn)行了清除DPPH·自由基的抗氧化實(shí)驗(yàn)。本文首次從桑黃(Phellinus baumii)中分離出Inoscavin A，并著重從清除自由基及細(xì)胞水平方面引用多種抗氧化模型綜合評(píng)價(jià)該化合物的抗氧化能力，對(duì)該化合物的抗氧化作用做了更深入地研究。

本次實(shí)驗(yàn)針對(duì)桑黃子實(shí)體(Phellinus baumii)抗氧化能力強(qiáng)的化合物進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)解析，該活性化合物的發(fā)現(xiàn)和鑒定為認(rèn)識(shí)桑黃抗氧化物質(zhì)的作用原理及其構(gòu)效關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。有關(guān)體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)及其他臨床、毒理實(shí)驗(yàn)尚未進(jìn)行，在今后的實(shí)驗(yàn)中還需對(duì)該活性化合物進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證，為天然抗氧化物質(zhì)的開發(fā)應(yīng)用提供更多的理論支持。

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