巴西綠蜂膠主要生物活性成分的研究進(jìn)展

王 凱，張翠平，胡福良

浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058

阿替匹林 C(artepillin C，3，5-二異戊烯基-4-羥基肉桂酸)，巴西綠蜂膠中的主要活性酚酸類物質(zhì)，化學(xué)式為:3-［4-羥基-3，5-二(3-甲基-2-丁烯基)苯基］-2-(E)-丙烯酸，分子量為300.40。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 阿替匹林C的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of artepillin C

阿替匹林C首先由Bohlmann和Jakupovic于1979年從菊花(Flourensia heterolepis)中分離出來(lái)［1］，后來(lái)在菊科植物 Baccharis［2］和 Relhania［3］中也發(fā)現(xiàn)該成分，特別是在酒神菊屬植物(Baccharis dracunculifolia)中的含量特別高［4-6］。

巴西綠蜂膠是目前產(chǎn)量最高、研究最多的巴西蜂膠，諸多研究證實(shí)巴西綠蜂膠具有降血脂、降血糖、抗炎及抑制血管生成等多種藥理活性［7-10］，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于保健食品、藥品和化妝品等行業(yè)中。巴西綠蜂膠的主要植物來(lái)源是酒神菊屬植物B．dracunculifolia DC［11］，因此，巴西綠蜂膠中阿替匹林 C的含量較高。隨著對(duì)巴西綠蜂膠研究的逐步深入，針對(duì)阿替匹林C在蜂膠質(zhì)量控制、生物學(xué)活性、分離純化以及人工合成等方面的研究也得到了較為廣泛的開(kāi)展。

1 在蜂膠質(zhì)量控制中的應(yīng)用

阿替匹林C不僅是巴西綠蜂膠的主要活性成分之一，而且是巴西綠蜂膠的代表性成分。Kumazawa等［12］對(duì)阿根廷、澳大利亞、巴西、保加利亞、智利、中國(guó)、匈牙利、新西蘭、南非、泰國(guó)、烏克蘭、烏拉圭、美國(guó)和烏茲別克斯坦等地的蜂膠進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果僅在巴西蜂膠中檢測(cè)到阿替匹林C，而且含量較高，在乙醇提取物中的含量達(dá)43.9 mg/g。但是，阿替匹林C在巴西蜂膠中的含量受地理來(lái)源和植物來(lái)源影響較大。Matsuda和Muradiam測(cè)定了巴西不同地區(qū)收集的33個(gè)蜂膠樣本中阿替匹林C的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣本間的含量差異較大，含量范圍從0%至11%不等。從巴西東南部采集的樣本中阿替匹林C的含量最為豐富(通常在5% ～11%)，而從東北部采集的樣本中卻基本不含阿替匹林C［13］，這是因?yàn)榘臀骶G蜂膠的主要膠源植物酒神菊在巴西東北部基本沒(méi)有分布。此外，巴西綠蜂膠中阿替匹林C含量受季節(jié)影響明顯，春夏季采集的綠蜂膠中阿替匹林C含量明顯高于秋冬季采集的蜂膠［14］。

由于阿替匹林C是巴西綠蜂膠的代表性成分，阿替匹林C的有無(wú)是確定巴西綠蜂膠真實(shí)性的主要依據(jù)，而且其含量高低是評(píng)價(jià)巴西綠蜂膠質(zhì)量?jī)?yōu)劣的主要指標(biāo)。Gardana等［15］建立了同時(shí)測(cè)定57種類黃酮或酚酸的HPLC-MS/MS法方法，對(duì)歐洲、中國(guó)和阿根廷的蜂膠進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)類黃酮含量的高低是評(píng)價(jià)歐洲、中國(guó)和阿根廷蜂膠質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)。但是，巴西綠蜂膠中類黃酮含量相對(duì)較低，而酚酸含量較高，特別是阿替匹林C是目前評(píng)價(jià)巴西綠蜂膠質(zhì)量?jī)?yōu)劣的主要指標(biāo)。韓利文等［16］建立了反相高效液相色譜法測(cè)定蜂膠中阿替匹林C含量的方法，為巴西綠蜂膠的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了更加簡(jiǎn)單易行的方法。

2 分離純化與人工合成

阿替匹林C是巴西綠蜂膠中最主要生物學(xué)活性成分之一，也是巴西綠蜂膠最重要的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，因此，其純品的獲得不僅有利于其藥理活性的深入研究，也為巴西綠蜂膠質(zhì)量控制提供參考。目前，已從巴西綠蜂膠中分離純化出阿替匹林C，市場(chǎng)上也有人工合成的阿替匹林C。

2.1 分離純化

Chang等［17］采用超臨界二氧化碳萃取法分離巴西綠蜂膠中的阿替匹林C，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明萃取溫度、乙酸乙酯添加率是影響阿替匹林C回收率和純度的重要因素。當(dāng)采用溫度50℃(323K)、6%乙酸乙酯添加量時(shí)，阿替匹林 C的回收率最佳，為13.9%。阿替匹林C在SC-CO2提取物中含量超過(guò)40%，對(duì)其采用正相樹(shù)脂柱層析法純化回收液可得含95%以上的阿替匹林C產(chǎn)品。Chang等［18］利用超臨界二氧化碳反溶劑重結(jié)晶法從巴西綠蜂膠中分離制備阿替匹林C亞微米粒子，在SC-CO2反溶劑中，壓力20 MPa、溫度328 K條件下生成了含阿替匹林C 306 mg/g的超細(xì)粉體。

2.2 人工合成

阿替匹林C的全合成已由Uto等［19］于2002年完成，合成反應(yīng)為在水中通過(guò)對(duì)碘苯酚的鄰戊二烯化反應(yīng)，再由丙烯酸甲酯參與的Mizoroki-Heck反應(yīng)及所生成酯的進(jìn)一步水解得到。反應(yīng)過(guò)程如圖2所示。

合成過(guò)程為首先在堿性條件通過(guò)對(duì)碘苯酚的異戊二烯化，得到C-取代和O-取代的異戊烯基類混合物(3～6)，該混合物通過(guò)色譜柱的分離，得到低回收率(約25%)目標(biāo)產(chǎn)物鄰-鄰-二異戊烯基類。然后，化合物3在三鄰甲基苯基膦、三乙胺、甲苯中與丙烯酸甲酯經(jīng)過(guò)鈀催化的Mizoroki-Heck的交聯(lián)偶合反應(yīng)以31%的回收率得到阿替匹林甲酯，再在氫氧化鉀溶液中通過(guò)甲醇醇解以78%的回收率得到阿替匹林C。

圖2 artepillin C的化學(xué)合成Fig.2 Total synthesis of artepillin C

3 生物學(xué)活性

由于巴西綠蜂膠具有廣泛的生物學(xué)活性，作為巴西綠蜂膠中最主要的生物活性成分，人們對(duì)阿替匹林C所具有的生物學(xué)活性也進(jìn)行了較為廣泛的研究。

3.1 抗微生物活性

阿替匹林C對(duì)多種致病細(xì)菌都表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗菌抑菌作用，如蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、溶壁微球菌(Micro-coccus lysodeikticus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)、大腸桿菌(Escherichia coli)，馬棒狀桿菌(Corynebacterium equi)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(Methicillin resistant Staphylococcus aureus)等［20］。Aga等［21］研究認(rèn)為阿替匹林 C 可能是巴西綠蜂膠中最主要的有效抗菌成分之一。

Feresin等［22］的研究證實(shí)阿替匹林C對(duì)多種真菌都具有抑制作用，如白色念珠菌(Candida albicans)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)、啤酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)、煙曲霉(Aspergillus fumigates)、黃曲霉(Aspergilus flavus)、黑曲霉(Aspergilus niger)、犬小芽孢菌(Microsporum canis)、絮狀表皮癬菌(Epidermophyton floccosum)和紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)等。

雖然這些研究證實(shí)阿替匹林C具有抗微生物的活性，但其作用機(jī)制目前尚不十分清楚。

3.2 抗氧化活性

由于阿替匹林C分子結(jié)構(gòu)單元芳香環(huán)有多個(gè)鄰、間位活性酚羥基，易于釋放H·給各類自由基，如氫氧游離基(HO·)、氫過(guò)氧游離基(ROO·)、超氧陰離子(O-2)等，終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而具有較強(qiáng)的抗氧化活性［23］。Kumazawa等［12］研究發(fā)現(xiàn)，阿替匹林C對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基具有超過(guò)60%的清除活性。Nakanishi等［24］研究發(fā)現(xiàn)，阿替匹林C同異丙苯過(guò)氧自由基的反應(yīng)歷程是通過(guò)一步氫原子的轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)的，該反應(yīng)的速率常數(shù)堪比右旋兒茶素(+)-catechin，兒茶素是一種已知抗氧化能力最強(qiáng)的抗氧化劑，這表明阿替匹林C具有很強(qiáng)的抗氧化活性。阿替匹林C在小鼠肝臟線粒體細(xì)胞中也體現(xiàn)出抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，且對(duì)線粒體細(xì)胞毒性很低［25］。

3.3 抗腫瘤活性

阿替匹林C最早是作為腫瘤抑制成分而受到廣泛關(guān)注的［26，27］，主要通過(guò)以下幾種方式發(fā)揮抗腫瘤活性:

3.3.1 激活抗氧化反應(yīng)應(yīng)答原件

研究表明，小鼠肝臟細(xì)胞中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和NADPH醌還原酶的活性隨著阿替匹林C水平上升而增加，激活抗氧化反應(yīng)應(yīng)答原件(antioxidant-responsiveelement，ARE)，并 同 DNA 結(jié)合［28，29］。Kanazawa 等［30］給小鼠注射氧化偶氮甲烷，誘導(dǎo)小鼠鼠產(chǎn)生與人類類似的結(jié)腸癌，發(fā)現(xiàn)阿替匹林C可以顯著減少結(jié)腸的畸形隱窩灶(ACF)。這些結(jié)果說(shuō)明了阿替匹林C可以通過(guò)激活抗氧化劑應(yīng)答原件和誘發(fā)肝臟產(chǎn)生II相酶(phase II enzymes)，從而抑制致癌物質(zhì)危及細(xì)胞中的DNA，阻止結(jié)腸的異常隱窩灶的出現(xiàn)，使癌變?cè)谠缙诘玫接行б种啤?/p>

3.3.2 誘導(dǎo)癌細(xì)胞周期阻滯

Shimizu等［31］研究發(fā)現(xiàn)，阿替匹林C可以通過(guò)刺激Cip1/p21(細(xì)胞周期抑制蛋白Cell cycle inhibitory protein)的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，從而抑制結(jié)腸癌的發(fā)生。阿替匹林C也對(duì)由氮基三醋酸鐵誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的肺癌［32］、腎癌［33］有抑制作用。這說(shuō)明阿替匹林C可以有效預(yù)防結(jié)腸癌的發(fā)生，作為化學(xué)預(yù)防劑起到防癌治癌的作用。

3.3.3 誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡

阿替匹林C可通過(guò)誘導(dǎo)人體癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抗癌作用。Matsuno等［26］發(fā)現(xiàn)在人類和小鼠惡性腫瘤細(xì)胞中施用阿替匹林C后，腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)中的細(xì)胞毒性效應(yīng)明顯減輕，組織學(xué)分析還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡、頓挫性核分裂及腫瘤大塊性壞死。同時(shí)，CD4/CD8 T細(xì)胞的比例、輔助T細(xì)胞的數(shù)量也有所上升。這說(shuō)明阿替匹林C激活了免疫系統(tǒng)，直接發(fā)揮抗癌作用。

阿替匹林C作用于體外培養(yǎng)的人體白血病細(xì)胞株不同表型，如淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞株(T細(xì)胞細(xì)胞系、B細(xì)胞細(xì)胞系)、髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株、單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞株、非淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞株及非髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株等，結(jié)果表明阿替匹林C可以有效地殺死癌細(xì)胞，并誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株發(fā)生細(xì)胞凋亡［34］。Akao 等［35］通過(guò)形態(tài)學(xué)分析、核小體組蛋白DNA碎片分析等證實(shí)阿替匹林C通過(guò)直接誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生抗白血病效果。

3.3.4 抑制腫瘤血管生成

阿替匹林C不僅可以直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，還可以通過(guò)抑制血管生成發(fā)揮抗癌作用。Ahn等［36］研究發(fā)現(xiàn)，阿替匹林C對(duì)抑制人類臍帶內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)血管生成有顯著的量效關(guān)系(3.13～50 μg/mL)。此外，抑制HUVECs的增殖過(guò)程也體現(xiàn)了這種量效關(guān)系。同時(shí)，血管再生分析顯示，阿替匹林C能顯著減少體內(nèi)新生血管的數(shù)量，這說(shuō)明阿替匹林C具有很強(qiáng)的抗血管生長(zhǎng)能力［37］。

3.3.5 選擇性地阻止PAK1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

Messerli等［38］首次發(fā)現(xiàn)阿替匹林C可以有選擇性地阻止PAK1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并不影響其他激酶如AKT等的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而PAK1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤(NF)細(xì)胞生長(zhǎng)中起重要作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿替匹林C幾乎可以完全抑制NF腫瘤的生長(zhǎng)。由于多種癌細(xì)胞，如乳腺癌［39］、子宮癌［40］、膀胱癌［41］等的生長(zhǎng)中都需要PAK1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這也為阿替匹林C發(fā)揮更廣泛的抗癌作用提供了重要依據(jù)。

3.3.6 抗化學(xué)誘變劑

Tavares等［42，43］研究了酒神菊屬乙酸乙酯浸提物(Bd-EAE)和巴西綠蜂膠對(duì)由阿霉素誘導(dǎo)的突變性的抑抑制作用。將實(shí)驗(yàn)組大白鼠口服不同濃度Bd-EAE，再對(duì)其腹腔注射化療劑阿霉素(DXR)，發(fā)現(xiàn)微核多染性紅細(xì)胞數(shù)量顯著減少，抑制了細(xì)胞突變的發(fā)生。對(duì)Bd-EAE和巴西綠蜂膠進(jìn)行HPLC分析發(fā)現(xiàn)，其中含有大量的阿替匹林C，說(shuō)明阿替匹林C可能是其抗突變的主要原因。Azevedo Bentes Monteiro Neto等［44］采用微核實(shí)驗(yàn)和彗星實(shí)驗(yàn)方法，研究給小鼠服用阿替匹林C后再施用DXR和甲基磺酸甲酯(MMS)對(duì)小鼠的影響。結(jié)果表明，阿替匹林C對(duì)化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)發(fā)生染色體DNA發(fā)生突變具有很好的保護(hù)作用。

3.4 抗炎癥活性

Paulino等［45］研究了阿替匹林C在小鼠上的抗炎癥效果。他們采用體內(nèi)試驗(yàn)(角叉菜膠致小鼠足跖腫脹模型、致小鼠腹膜炎模型)、體外試驗(yàn)(測(cè)定RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的NO水平、HEK 293細(xì)胞NF-κB活性)，并測(cè)定小鼠口服阿替匹林C的吸收率及生物利用率。結(jié)果表明阿替匹林C對(duì)小鼠足跖腫脹最多有38%的抑制效果，減少患腹膜炎小鼠中性粒細(xì)胞的水平。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了阿替匹林C可以降低NO水平和NF-κB活性。

3.5 其他生物學(xué)活性

巴西綠蜂膠醇提物可以緩解季節(jié)性過(guò)敏性鼻炎，減少病人相關(guān)藥物使用，推遲癥狀發(fā)生時(shí)間。Tani等［46］研究發(fā)現(xiàn)阿替匹林C可以有效抑制半胱氨酸白細(xì)胞介素(cys-leukotrienes，cys-LT)的釋放，從而抑制了過(guò)敏反應(yīng)。

Iio等［47］研究發(fā)現(xiàn)蜂膠可以幫助恢復(fù)脂聯(lián)素(一種胰島素增敏激素，能改善小鼠的胰島素抗性，同時(shí)增加脂肪酸的氧化，減少肌肉中三酰甘油的含量)的表達(dá)，增進(jìn)胰島素的敏感性。Ikeda等［48］研究了巴西綠蜂膠此作用的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)阿替匹林C可以顯著阻遏由TNF-α介導(dǎo)的對(duì)脂聯(lián)素表達(dá)的抑制，卻可以激活過(guò)氧化物酶體增殖活化受體(PPAR-γ，Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma)。該受體可調(diào)節(jié)許多基因的轉(zhuǎn)錄，包括脂肪細(xì)胞的分化、體內(nèi)脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)及體內(nèi)胰島素的活動(dòng)。所以阿替匹林C是通過(guò)激活PRAR-γ從而抑制了TNF-α的表達(dá)，進(jìn)而恢復(fù)了脂聯(lián)素的活性。Choi等［49］的研究也證實(shí)阿替匹林C能夠顯著增強(qiáng)PPAR-γ的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力，促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化，提高胰島素的敏感性，有抗2型糖尿病的效果。

4 結(jié)語(yǔ)

阿替匹林C是巴西綠蜂膠的重要生物活性物質(zhì)，是目前確認(rèn)巴西綠蜂膠真實(shí)性及衡量巴西綠蜂膠質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)。但是，蜂膠化學(xué)成分復(fù)雜，目前已從蜂膠中分離鑒定出的化學(xué)成分有黃酮類、萜烯類、醌類、酯類、醇類、醛類、酚類、有機(jī)酸類，還有大量的氨基酸類、酶類、維生素類、多糖及多種微量元素等。其中，黃酮類化合物多達(dá)136種［50］，酚酸類化合物 131 種［51］，萜類化合物 194 種［52］，因此，蜂膠生物學(xué)活性的發(fā)揮不是單一成分決定的，僅以阿替匹林C為指標(biāo)不足以評(píng)價(jià)巴西綠蜂膠的質(zhì)量?jī)?yōu)劣，以阿替匹林C為主的多指標(biāo)成分結(jié)合指紋圖譜分析可能是評(píng)價(jià)巴西綠蜂膠質(zhì)量?jī)?yōu)劣的有效途徑。

阿替匹林C具有多種生物學(xué)活性，但目前大部分的研究仍以巴西綠蜂膠為對(duì)象。因此，阿替匹林C單體的生物學(xué)活性及作用機(jī)制有待今后深入研究。

1 Bohlmann F，Jakupovic J.New sesquiterpene acids，sesquiterpene diol，flavanones and other aromatic-compounds from Flourensia-Heterolepis.Naturally occurring terpene Derivatives.Phytochemistry，1979，18:1189-1194.

2 Bohlmann F，et al.Naturally-occurring terpene derivatives.307.5 Diterpenes and other constituents from 9 Baccharis species.Phytochemistry，1981，20:281-286.

3 Tsichritzis F，Jakupovic J.Diterpenes and other constituents from Relhania species.Phytochemistry，1990，29:3173-3187.

4 De Sousa JP，et al.A validated reverse-phase HPLC analyti-cal method for the quantification of phenolic compounds in Baccharis dracunculifolia.Phytocheml Anal，2009，20:24-32.

5 Park YK，et al.Chemical constituents in Baccharis dracunculifolia as the main botanical origin of southeastern Brazilian propolis.J Agric Food Chem，2004，52:1100-1103.

6 de Funari CS，et al.Analysis of propolis from Baccharis dracunculifolia DC.(compositae)and its effects on mouse fibroblasts.J Ethnopharmacol，2007，111:206-212.

7 Hu FL(胡福良).Studies on Pharmacological Actions of Propolis(蜂膠藥理作用研究)，Hangzhou:Zhejiang University Press，2005.

8 Zhu W(朱威).Effects of Chinese propolis and Brazilian propolis on diabetic rats and the possible protection mechanism on diabetic nephropathy.Hangzhou:Zhejiang University(浙江大學(xué))，PhD.2010.

9 Zhu W，et al.Biological activities of Chinese propolis and Brazilian propolis on streptozotocin-induced type 1 diabetes mellitus in rats.Evid-based Compl Alt，2011，Article ID 468529，doi:10.1093/ecam/neq025.

10 Xuan HZ，et al.Effect of Brazilian propolis on human umbilical vein endothelial cell apoptosis.Food Chem Toxicol，2011，49:78-85.

11 Sawaya Alexandra，et al.Analytical methods applied to diverse types of Brazilian propolis.Chem Cent J，2011，5:27-37.

12 Kumazawa S，et al.Antioxidant activity of propolis of various geographic origins.Food Chem，2004，84:329-339.

13 Matsuda AH，de Almeida-Muradian LB.Validated method for the quantification of artepillin-C in Brazilian propolis.Phytochem Anal，2008，19:179-183.

14 Simoes-Ambrosio LM，et al.The role of seasonality on the inhibitory effect of Brazilian green propolis on the oxidative metabolism of neutrophils.Fitoterapia，2010，81:1102-1108.

15 Gardana C，et al.Analysis of the polyphenolic fraction of propolis from different sources by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.J Pharmaceut Biomed Anal，2007，45:390-399.

16 Han LW(韓利文)，et al.Determination of Artepillin C in propolis by HPLC.Chin Pharm Affairs(中國(guó)藥事)，2008，22:312-314.

17 Chang CMJ，et al.Isolation and purification of 3，5-diprenyl-4-hydroxycinnamic acid(artepillin C)in Brazilian propolis by supercritical fluid extractions.Sep Purif Technol，2007，54:130-138.

18 Chang CMJ，et al.Precipitation of sub-micron particles of 3，5-diprenyl-4-hydroxycinnamic acid in Brazilian propolis from supercritical carbon dioxide anti-solvent solutions.J Supercrit Fluid，2009，50:176-182.

19 Uto Y，et al.First total synthesis of artepillin C established by o，o'-diprenylation of p-halophenols in water.J Org Chem，2002，67:2355-2357.

20 Da Silva JF，et al.Artepillin C:a review.Lett Drug Des Discov，2008，5(2):88-92.

21 Aga H，et al.Isolation and identification of antimicrobial compounds in Brazilian propolis.Biosci Biotechnol Biochem，1994，58:945-946.

22 Feresin GE，et al.Constituents of the Argentinian medicinal plant Baccharis grisebachii and their antimicrobial activity.J Ethnopharmacol，2003，89:73-80.

23 Devasagayam TP，et al.Free radicals and antioxidants in human health:current status and future prospects.J Asso Physi India，2004，52:794-804.

24 Nakanishi I，et al.Efficient radical scavenging ability of artepillin C，a major component of Brazilian propolis，and the mechanism.Org Biomol Chem，2003，1:1452-1454.

25 Hori H，et al.Artepillin C isoprenomics:Design and synthesis of artepillin C isoprene analogues as lipid peroxidation inhibitor having low mitochondrial toxicity.Bioorg Med Chem，2006，14:5721-5728.

26 Matsuno T，et al.Preferential cytotoxicity to tumor cells of 3，5-diprenyl-4-hydroxycinnamic acid(artepillin C)isolated from propolis.Anticancer Res，1997，17:3565-3568.

27 Kimoto T，et al.Cell cycle and apoptosis in cancer induced by the artepillin C extracted from Brazilian propolis.Japanese J Cancer Chemotherapy，1996，23:1855-1859.

28 Finley JW.The antioxidant responsive element(ARE)may explain the protective effects of cruciferous vegetables on cancer.Nutr Rev，2003，61:250-254.

29 Menshchikova EB，et al.Active defense under oxidative stress.The antioxidant responsive element.Biochemistry-Moscow，2006，71:962-974.

30 Kanazawa K，et al.Dietary artepillin C suppresses the formation of aberrant crypt foci induced by azoxymethane in mouse colon.Cancer Lett，2006，240:135-142.

31 Shimizu K，et al.Artepillin C in Brazilian propolis induces G(0)/G(1)arrest via stimulation of Cip1/p21 expression in human colon cancer cells.Mol Carcinogen，2005，44:293-299.

32 Kimoto T，et al.Pulmonary carcinogenesis induced by ferric nitrilotriacetate in mice and protection from it by Brazilian propolis and artepillin C.Virchows Arch，2001，438:259-270.

33 Kimoto T，et al.Renal carcinogenesis induced by ferric nitrilotriacetate in mice，and protection from it by Brazilian propolis and artepillin C.Pathol Int，2000，50:679-689.

34 Kimoto T，et al.Apoptosis of human leukemia cells induced by artepillin C，an active ingredient of Brazilian propolis.Anticancer Res，2001，21:221-228.

35 Akao Y，et al.Cell growth inhibitory effect of cinnamic acid derivatives from propolis on human tumor cell lines.Biol Pharm Bull，2003，26:1057-1059.

36 Ahn MR，et al.Suppression of tumor-induced angiogenesis by Brazilian propolis:major component artepillin C inhibits in vitro tube formation and endothelial cell proliferation.Cancer Lett，2007，252:235-243.

37 Ohta T，et al.Correlation between antiangiogenic activity and antioxidant activity of various components from propolis.Mol Nutr Food Res，2009，53:643-651.

38 Messerli SM，et al.Artepillin C(ARC)in Brazilian green propolis selectively blocks oncogenic PAK1 signaling and suppresses the growth of NF tumors in mice.Phytother Res，2009，23:423-427.

39 Kumar R，et al.p21-activated kinase-1 signaling mediates cyclin D1 expression in mammary epithelial and cancer cells.J Biol Chem，2004，279:1422-1428.

40 Schraml P，et al.Combined array comparative genomic hybridization and tissue microarray analysis suggest PAK1 at 11q13.5-q14 as a critical oncogene target in ovarian carcinoma.Am J Pathol，2003，163:985-992.

41 Ogawa O，et al.P21-activated kinase 1:A new molecular marker for intravesical recurrence after transurethral resection of bladder cancer.J Urology，2007，178:1073-1079.

42 Tavares DC，et al.Inhibition of doxorubicin-induced mutagenicity by Baccharis dracunculifolia.Mutat Res-Gen Tox En，2007，634:112-118.

43 Tavares DC，et al.Effects of propolis crude hydroalcoholic extract on chromosomal aberrations induced by doxorubicin in rats.Planta Med，2007，73:1531-1536.

44 Azevedo Bentes Monteiro Neto M，et al.Antigenotoxicity of artepillin C in vivo evaluated by the micronucleus and comet assays.J Appl Toxicol，2011，published online.

45 Paulino N，et al.Anti-inflammatory effects of a bioavailable compound，artepillin C，in Brazilian propolis.Eur J Pharmacol，2008，587:296-301.

46 Tani H，et al.Inhibitory activity of Brazilian green propolis components and their derivatives on the release of cys-leukotrienes.Bioorg Med Chem，2010，18:151-157.

47 Iio A，et al.Ethanolic extracts of Brazilian red propolis promote adipocyte differentiation through PPAR gamma activation.Phytomedicine，2010，17:974-979.

48 Tsuda T，et al.Brazilian propolis-derived components inhibit TNF-alpha-mediated downregulation of adiponectin expression via different mechanisms in 3T3-L1 adipocytes.BBAGen Subjects，2011，1810:695-703.

49 Choi SS，et al.Artepillin C，as a PPARgamma ligand，enhances adipocyte differentiation and glucose uptake in 3T3-L1 cells.Biochem Pharmacol，2011，81:925-933.

50 Zhang CP(張翠平)，Hu FL(胡福良).Flavonoids in propolis.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，2009，21:1084-1090.

51 Zhang CP(張翠平)，Hu FL(胡福良).Phenolic Acid contribution in Propolis.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，Contribution.

52 Zhang CP(張翠平)，Hu FL(胡福良).Terpenoids in propolis.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，in press.