PHI對前列腺癌PC3細(xì)胞組蛋白甲基化及乙酰化的調(diào)控＊

莊志明， 黃軼群， 馬旭東， 鄭亞才， 鄭周達(dá)

福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院泌尿外科，漳州 363000

雄激素非依賴性是目前制約晚期前列腺癌療效的主要原因，開發(fā)新的抗癌藥物是中晚期前列腺癌治療的迫切要求。異硫氰酸以硫配糖體形式廣泛存在于各種十字花科如莖椰菜、甘藍(lán)和水田芥等植物中［1］。異硫氰酸苯己酯（phenylhexyl isothiocyanate，PHI）已被人工合成。動物實驗表明，PHI對多種腫瘤具有廣泛有效的抑制作用。Srivastava等［2］報道，異硫氰酸丙烯酯（AITC）對移植于裸鼠的人類前列腺癌細(xì)胞（PC3）的增殖有明顯抑制作用，而對正常的前列腺上皮細(xì)胞生長無毒副作用。我們前期的研究［3－5］也發(fā)現(xiàn)，PHI可抑制白血病細(xì)胞組蛋白去乙?；?，上調(diào)組蛋白乙酰化酶P300，調(diào)控組蛋白乙?；凹谆?。本研究旨在探討PHI對前列腺癌PC3細(xì)胞的作用，檢測PHI對前列腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、組蛋白乙酰化、甲基化的影響，闡述PHI誘導(dǎo)雄激素非依賴性的前列腺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

異硫氰酸苯己酯（PHI）購自美國LKT Laboratories公司，以75%甲醇配成5 mmoL／L 存儲液，0.22μmol／L 微孔濾膜正壓過濾后－20℃保存。

一抗：Bcl－2，Caspase－9、Caspase－3、Mcl－1、Cyt－C、XIAP購自Santa Cruz公司；Anti－acetyl－Histone H3、Anti－acetyl－Histone H4、Anti－monomethyl－Histone H3（Lys4）、Anti－monomethyl－Histone H3（Lys9）購自Upstate公司（美國）。二抗：羊抗兔二抗以及羊抗鼠二抗購自Santa Cruz公司（美國）。

1.2 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)

PC3細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，用含20%胎牛血清、2mmol／L左旋谷氨酰胺的F12培養(yǎng)液置37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞呈單純貼壁生長，每3～5天傳代1次。傳代時用0.25%胰蛋白酶消化2～3min，用培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液，按所需濃度接種，接種前經(jīng)錐蟲藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞活力。

1.3 MTT檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期細(xì)胞，將其密度調(diào)整為1.0×105／mL接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Costar），每孔100μL，實驗組分別加入PHI使終濃度為0、5、10、20、40、80μmol／L，對照組只加10%培養(yǎng)液（無細(xì)胞），每組設(shè)6個平行孔，培養(yǎng)24、48、72、96h后，加5mg／mL MTT（Sigma）10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心后小心吸去上清，每孔加100μL DMSO（Sigma），充分振蕩混勻，在酶標(biāo)儀上用雙波長492nm 和630 nm 測吸光度（A）值，計算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率（%）＝（A實驗－A空白）／（A對照－A空白）×100% 。實驗重復(fù)3次。

1.4 TUNEL法原位檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期細(xì)胞，將其密度調(diào)整為1.0×105／mL接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Costar），每孔1 mL，加入無菌蓋玻片，細(xì)胞爬片48h后，分別加入PHI使終濃度為0、10、20、40μmol／L，作用7h后，取出蓋玻片按照Promage試劑盒說明書步驟操作，顯微鏡下觀察、計數(shù)200個細(xì)胞，以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒為凋亡細(xì)胞。

1.5 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測凋亡相關(guān)蛋白、組蛋白乙?；⒓谆?/h3>

收集經(jīng)PHI處理后的細(xì)胞，分別用預(yù)冷的TBS洗滌2次。按1×106細(xì)胞加入100μL 裂解液和1 μL 酶抑制劑的比例裂解30 min，低溫（4℃）離心1 000r／min×10min，吸取中間清亮層，用Bradford法測定總蛋白。應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，室溫下?lián)u床封閉1h。加入用TBS稀釋不同濃度的一抗，4℃過夜。TBS洗滌液洗膜，分別加入用TBS按1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗以及羊抗鼠二抗，室溫下?lián)u床作用1h。用化學(xué)發(fā)光法顯色，X 線底片曝光，以β－actin為內(nèi)參照，以目的條帶與actin條帶的吸光度值比來反映蛋白的表達(dá)量。對照組為無細(xì)胞組。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計處理軟件分析。常規(guī)進(jìn)行方差齊性檢驗，正態(tài)性檢驗。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PHI抑制細(xì)胞增殖

圖1顯示0、5、10、20、40、80μmol／L PHI作用48 h 后，PC3 細(xì)胞增殖率分別為100.00%、88.39%、76.27%、44.69%、24.39%、11.50%，隨藥物濃度的增加增殖率逐漸下降。20μmol／L PHI作用24h時細(xì)胞增殖率為78.39%，48h為44.69%，72h為35.59%，96h為33.34%，表現(xiàn)出時間依賴性，IC50為20μmol／L（圖2）。

圖1 不同濃度PHI作用48h后PC3細(xì)胞增殖率Fig.1 Proliferation rate of PC3cells after exposure to indicated concentrations of PHI for 48h

圖2 20μmol／L PHI作用不同時間后PC3 細(xì)胞增殖率Fig.2 Proliferation rate of PC3cells treated with 20μmol／L PHI for different durations

2.2 PHI誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

2.2.1 PHI上調(diào)PC3細(xì)胞凋亡率 用TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，PHI可誘導(dǎo)PC3細(xì)胞凋亡。0、10、20、40μmol／L PHI作用7h時細(xì)胞凋亡率分別為（1.55±0.78）%、（14.30±4.32）%、（49.45±5.63）%、（76.35±6.21）%，隨濃度增加而增加（圖3），經(jīng)過單因素方差分析顯示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 不同濃度PHI處理7h后PC3細(xì)胞凋亡率（DAB，×100）Fig.3 Apoptosis rate of PC3cells after treatment with different concentrations of PHI for 72h（DAB，×100）

2.2.2 PHI下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 用Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過PHI處理后PC3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl－2、Caspase－9、Caspase－3、Mcl－1、Cyt－C、XIAP的表達(dá)均下降，且隨PHI濃度的增加和作用時間的延長而降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），呈時效及量效關(guān)系（圖4）。

圖4 不同濃度PHI處理后凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化Fig.4 Expression of apoptosis－related proteins in PC3cells treated with different concentrations of PHI

2.3 PHI上調(diào)PC3細(xì)胞組蛋白乙酰化H3、H4表達(dá)

Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)，PC3 細(xì)胞組蛋白H3、H4處于低乙?；癄顟B(tài)。PHI能明顯增加其組蛋白乙?；疕3、H4的表達(dá)，隨PHI濃度的增加，其表達(dá)量增加，且隨作用時間的延長其表達(dá)增強，呈現(xiàn)量效和時效關(guān)系。與對照組比較，PHI 10、20、40 μmol／L處理3h 后，H3 乙?；謩e增加了1.22倍、2.13倍、3.46 倍，而7h 后此變化趨勢更加顯著，分別增加為2.30倍、3.53倍、7.64倍。與對照組比較，處理3h 后，H4 乙?；黾恿?.09 倍、1.45倍、2.02倍，而7h后此變化趨勢更加顯著，分別增加了2.52倍、2.87 倍、3.50 倍，H3 乙?；黾映潭纫菻4乙酰化增加明顯（圖5）。

2.4 PHI調(diào)控PC3細(xì)胞組蛋白甲基化H3K4、H3K9表達(dá)

PC3細(xì)胞組蛋白H3K4 處于低甲基化狀態(tài)。PHI處理后H3K4甲基化水平明顯增高，呈時效和量效關(guān)系，與對照組比較，PHI在10、20、40μmol／L處理3h后組蛋白甲基化H3K4水平增加了2.74倍、3.75倍、4.58倍，7h后組蛋白甲基化H3K4增加了3.66 倍、4.75 倍、5.76 倍。PC3 細(xì)胞組蛋白H3K9處于高甲基化狀態(tài)，與對照組比較，PHI處理3h后對甲基化H3K9狀態(tài)影響不太明顯，但是處理7h后組蛋白甲基化H3K9水平降低，分別為對照組的0.65倍、0.37倍、0.22倍（圖6）。

圖5 PHI處理PC3細(xì)胞后組蛋白H3、H4乙?；癄顟B(tài)的改變Fig.5 Histone acetylation in PC3cells treated with PHI

圖6 PHI處理PC3細(xì)胞后組蛋白H3K9、H3K4甲基化狀態(tài)的改變Fig.6 Histone methylation in PC3cells treated with PHI

3 討論

表觀遺傳是指DNA 序列不發(fā)生變化但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變［6］。這種改變在發(fā)育和細(xì)胞增殖過程中能穩(wěn)定傳遞［7］。表觀遺傳修飾主要包括DNA 啟動子區(qū)的甲基化、組蛋白各種類型的修飾（乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化等）、RNA 干擾等。腫瘤抑癌基因表觀遺傳修飾的異常改變所致的基因失活，將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。表觀遺傳學(xué)改變是可逆的［8］，因此，可作為腫瘤治療的特異性標(biāo)靶。目前分子遺傳學(xué)研究認(rèn)為，前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展不僅與某些癌基因的活化有關(guān)，也涉及相關(guān)抑癌基因的失活。而抑癌基因失活除了與基因突變及等位基因成分缺失有關(guān)外，還與表觀遺傳密切相關(guān)。

隨著組蛋白甲基化的研究逐漸興起，研究發(fā)現(xiàn)賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的家族中許多成員與腫瘤形成有關(guān)，HMT 活性缺失或失調(diào)可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的原因。美國一項臨床研究發(fā)現(xiàn)，甲基化在前列腺癌患者標(biāo)本中比例很高［9］。其中，組蛋白H3K9、H3K27、H3K79、H4K20位點的甲基化發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用，H3K4甲基化是基因轉(zhuǎn)錄激活的標(biāo)志，分別受到不同的甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控［10－11］。本研究發(fā)現(xiàn)PC3細(xì)胞組蛋白甲基化H3K4呈低表達(dá)，而H3K9高表達(dá)；PHI可上調(diào)組蛋白H3K4 甲基化水平，抑制H3K9甲基化的水平，即PHI可精確調(diào)控組蛋白甲基化表達(dá)，激活轉(zhuǎn)錄因子，啟動基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制PC3腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PHI能調(diào)節(jié)H3K4、H3K9的甲基化狀態(tài)在經(jīng)典的組蛋白去乙?；敢种苿℉DACI）曲古抑菌素（Trichostatin A，TSA）中未被發(fā)現(xiàn)［12］，究竟是PHI本身具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，還是通過其他途徑激活或募集組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶來改變H3K9、H3K4的甲基化狀態(tài)，其中的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

組蛋白乙酰化由乙?；D(zhuǎn)移酶（HAT）和去乙?；福℉DAC）調(diào)節(jié)。HAT 及HDAC精確地調(diào)控染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)及基因的表達(dá)。HAT 及HDAC 活性異常，或異常募集HDAC，引起抑癌基因的表達(dá)抑制或癌基因的激活和過度表達(dá)，是腫瘤發(fā)生的一個重要機(jī)制。在多種腫瘤中HDAC與細(xì)胞周期、細(xì)胞分化的調(diào)控密切相關(guān)［13－17］。

隨著對組蛋白乙?；芯康纳钊?，發(fā)現(xiàn)組蛋白HDACI能通過調(diào)節(jié)組蛋白乙?；乃絹碚{(diào)控表觀遺傳學(xué)，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或分化，引起細(xì)胞周期的阻滯，調(diào)控癌基因及抑癌基因活性，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。本研究結(jié)果表明，PC3細(xì)胞組蛋白呈低乙?；?，在PHI作用下，以劑量依賴及時間依賴的方式顯著提高組蛋白H3和H4的乙酰化水平，激活基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控人類前列腺癌PC3細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)，從而抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

本研究證實，PHI可抑制人類前列腺癌細(xì)胞PC3的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過內(nèi)源性凋亡途徑，下調(diào)凋亡抑制蛋白XIAP、Mcl－1前體（凋亡底物）的表達(dá)，從而加速腫瘤細(xì)胞的凋亡。故PHI有望成為新型的抗腫瘤藥物。

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