小分子雙鏈RNA 對人類細(xì)胞中抑癌基因p21表達的上調(diào)作用＊

胡 嘏， 陳 忠， 吳 嘉， 張 勇， 徐 華， 楊為民， 葉章群

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院泌尿外科，武漢 430030

RNA 激活（RNAa）是新近發(fā)現(xiàn)的一種基因調(diào)節(jié)方式，小的雙鏈RNA（dsRNA）通過靶向基因啟動子區(qū)或反義轉(zhuǎn)錄本可以介導(dǎo)相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄水平的激活［1－3］。這些具有RNAa功能的dsRNAs則被稱為“小激活RNA”（saRNA），在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮與RNA干擾（RNAi）相反的作用。利用RNAa靶向上調(diào)抑癌基因表達為腫瘤的基因治療提供了更具前景的策略，前期研究中，我們針對抑癌基因p21WAF1／CIP1啟動子區(qū)設(shè)計的saRNA（即dsP21－322），已在體外培養(yǎng)的前列腺癌、膀胱癌等細(xì)胞系中明顯激活p21的表達，并抑制腫瘤細(xì)胞生長，促進凋亡［2，4］。本研究旨在篩選更多對dsP21－322起效應(yīng)的新細(xì)胞系，同時在p21 被激活時檢測其上游p53 的表達，對dsP21－322介導(dǎo)p21 的上調(diào)是否依賴p53 進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

化學(xué)合成的dsP21－322及dsControl（廣州RiboBio公司），人肺腺癌細(xì)胞系NCI－H1299、人宮頸癌細(xì)胞系HeLa、人骨肉瘤細(xì)胞系U2－OS、人腎上皮細(xì)胞系293T（武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心），RPMI 1640和DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Hyclone公司），Entranster－R（北京英格恩生物公司），OPTI－MEM、Trizol Reagent、SuperScript reverse transcriptase、引物合成（美國Invitrogen 公司），RNase－free DNase Ⅰ（德國Qiagen 公司），SYBR Green Real Time PCR Master Mix（TaKaRa 公司），BCA protein assay kit（美國Pierce公司），一抗鼠單抗p53（美國CST 公司），一抗兔多抗p21和鼠單抗GAPDH（英國Abcam 公司），二抗HRP 標(biāo)記羊抗兔／鼠、Western blotting Luminol（美國Santa Cruz公司）。

1.2 dsRNA 的設(shè)計

dsP21－322為針對p21基因啟動子區(qū)相對轉(zhuǎn)錄起始點－322bp附近設(shè)計的與該段啟動子互補配對，長度為21 個核苷酸堿基對的小激活RNA［2］。dsControl為已知缺少人類基因重要同源性，長度同樣為21個核苷酸堿基對的dsRNA 序列，實驗中作為陰性對照。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

NCI－H1299、U2－OS 及293T 細(xì)胞系生長在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，HeLa細(xì)胞系生長在含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染實驗，轉(zhuǎn)染試劑Entranster－R 被用于dsP21－322及dsControl的轉(zhuǎn)染，以轉(zhuǎn)染時細(xì)胞匯合度在40%為宜，用無血清培養(yǎng)液（OPTI－MEM）分別稀釋dsRNA 和轉(zhuǎn)染試劑Entranster－R，繼而混合兩者，室溫靜置30 min完成轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備，將其加入6 孔板中，并補足培養(yǎng)液，使dsRNA的終濃度為50nmol／L，6h后觀察細(xì)胞狀態(tài)并更換培養(yǎng)液。

1.4 總RNA的提取及RT－qPCR 分析

轉(zhuǎn)染后72h 收集細(xì)胞用于mRNA 表達的分析?？俁NA 的提取使用Trizol Reagent，每個RNA 的樣本用RNase－free DNaseⅠ處理以去除殘余的DNA。利用SuperScript reverse transcriptase和oligo（dT）引物將1μg總RNA 合成cDNA。合成的cDNA 利用SYBR Green Real Time PCR Master Mix 及特異性引物通過qPCR 進行擴增。p53 的qPCR 引物序列為：上游引物5′－GTTCCGAGAGCTGAATGAGG－3′，下游引物5′－TCTGAGTCAGGCCCTTCTGT－3′；p21 的qPCR 引物序列為：上游引物5′－AGCAGCGGAACAAGGAGT－3′，下游引物5′－CGTTAGTGCCAGGAAAGACA－3′；18srRNA 作為內(nèi)參基因也被擴增，qPCR 引物序列為上游引物：5′－GTAACCCGTTGAACCCCATT－3′，下游引物：5′－CCATCCAATCGGTAGTAGCG－3′。采用2－ΔΔCt方法分析基因相對定量表達。

1.5 總蛋白的提取及Western blot分析

轉(zhuǎn)染后96h 收集細(xì)胞用于蛋白表達的分析。用PBS洗2次細(xì)胞，加入包含蛋白酶抑制劑Cocktail的細(xì)胞裂解液（50mmol／L Tris－HCl，pH 7.5，150 mmol／L NaCl，0.5% NP－40，2 mmol／L EDTA），4℃裂解30min，高速離心15min收集上清。使用BCA protein assay kit進行蛋白濃度的測定。將每個樣本提取的蛋白上樣20μg 至SDS－PAGE膠進行電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜經(jīng)含5% 脫脂奶粉的TBST 溶液室溫封閉1h后，與特異性一抗鼠單抗p53（1∶200稀釋）、兔多抗p21（1∶100稀釋）及鼠單抗GAPDH（1∶500稀釋）4℃孵育過夜。繼而NC膜與HRP 標(biāo)記羊抗兔／鼠的二抗（1∶3 000 稀釋）孵育1h，通過Western blotting Luminol試劑觀察免疫反應(yīng)的條帶，測定各條帶的吸光度值。以各條帶與GAPDH 吸光度值的相對值表示目的基因的蛋白表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 dsP21－322對p53存在的腫瘤細(xì)胞系p21的調(diào)控

為篩選更多對dsP21－322起效應(yīng)的細(xì)胞系，同時觀察dsP21－322 介導(dǎo)p21 激活過程是否依賴p53的表達，我們首先選擇p53存在的2種腫瘤細(xì)胞系，p53野生型（p53wild type）的人骨肉瘤細(xì)胞系U2－OS和p53突變型（p53 mutant type）的人宮頸癌細(xì)胞系HeLa作為研究對象，分別將陰性對照dsControl及dsP21－322 轉(zhuǎn)染至上述細(xì)胞系，觀察dsP21－322對p21 調(diào)控的影響。如圖1A 和1C，轉(zhuǎn)染72h 后RT－qPCR 檢測顯示，相比dsControl，dsP21－322均明顯激活了上述2種細(xì)胞系p21基因的表達，分別上調(diào)3.97倍和4.94倍。Western blot檢測也進一步明確p21蛋白水平在2種細(xì)胞系中的增加（圖1B和1D），較dsControl分別增加（3.27±0.51）倍和（4.85±0.97）倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。同時我們檢測了p53基因及蛋白的表達水平，結(jié)果顯示dsP21－322的加入對p53的表達無明顯影響，與dsControl相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 dsP21－322上調(diào)U2－OS（p53野生型）及HeLa（p53突變型）細(xì)胞系p21mRNA 及蛋白表達Fig.1 Up－regulation of the expression of p21mRNA and protein in U2－OS cell line（p53 wild type）and HeLa cell line（p53 mutant type）by dsP21－322

2.2 dsP21－322對p53缺失的腫瘤細(xì)胞系p21的調(diào)控

上述結(jié)果表明p53 存在時，dsP21－322 可以上調(diào)p21的表達水平，為進一步明確p53在此過程中的作用，我們將dsP21－322 轉(zhuǎn)染至p53 缺失（p53 null）的人肺腺癌細(xì)胞系NCI－H1299，觀察p21的表達情況。72h 后RT－qPCR 檢測p21 基因表達水平，如圖2A，相對dsControl，dsP21－322的加入并未明顯激活p21基因的表達水平，轉(zhuǎn)染后96h Western blot檢測也未見p21蛋白水平的增加（圖2B），較dsControl上調(diào)（0.27±0.64）倍，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。上述結(jié)果表明dsP21－322在p53缺失的腫瘤細(xì)胞系未能激活p21的表達。

圖2 dsP21－322 不能上調(diào)NCI－H1299（p53 缺失）細(xì)胞系p21 mRNA 及蛋白表達Fig.2 Effects of dsP21－322on the expression of p21mRNA and protein in NCI－H1299cell line（p53null）

2.3 dsP21－322對非腫瘤細(xì)胞系p21的調(diào)控

之前及以上研究表明，dsP21－322 在多個腫瘤細(xì)胞系中具有明顯激活抑癌基因p21的能力，是否dsP21－322在非腫瘤細(xì)胞系中也能上調(diào)p21 的表達，我們選擇p53野生型（p53wild type）的人腎上皮細(xì)胞系293T 進行研究。如圖3A 及3B，相對ds－Control，轉(zhuǎn)染dsP21－322后的293T 細(xì)胞系，p21基因和蛋白的表達也明顯升高，p21mRNA 的表達上調(diào)4.64倍，蛋白上調(diào)（3.01±0.77）倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示dsP21－322 在非腫瘤細(xì)胞系中同樣具備上調(diào)p21 表達的能力。同期檢測p53的表達水平與U2－OS及HeLa細(xì)胞系結(jié)果相同，與dsControl相比，增加（0.64±0.41）倍，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 dsP21－322上調(diào)293T（p53野生型）細(xì)胞系p21mRNA 及蛋白表達Fig.3 Up－regulation of the expression of p21mRNA and protein in 293Tcell line（p53wild type）by dsP21－322

3 討論

眾多研究表明，小分子RNA 在進化過程中已演化成一種通用的基因調(diào)控工具，10多年前研究發(fā)現(xiàn)的小分子雙鏈RNA（dsRNA）進入細(xì)胞后能導(dǎo)致同源性基因表達沉寂，即RNA 干擾（RNAi）現(xiàn)象，目前已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究及臨床藥物研發(fā)中［5－9］。新近的研究表明dsRNA 還可以上調(diào)基因表達，體現(xiàn)出其在基因組功能調(diào)控中的多樣性。我們稱這一現(xiàn)象為RNA 激活，簡稱RNAa。與RNAi相似，RNAa提供了快速高效改變基因表達的方式，利用RNAa可以上調(diào)沉寂的或低表達的活性基因，如腫瘤細(xì)胞中的抑癌基因。此外，RNAa過程伴隨目的基因啟動子區(qū)表觀遺傳的改變，致使上調(diào)基因持續(xù)的時間更持久［1－2］。這些特征使得RNAa成為腫瘤治療的一種理想策略。p21WAF1／CIP1作為重要的細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（CDK）抑制因子家族的成員，通常負(fù)性調(diào)控細(xì)胞周期進而抑制腫瘤進展。在臨床上p21的缺失或失活常見于原發(fā)的實體腫瘤，并且與這些腫瘤的進展及較差的預(yù)后相聯(lián)系［10－11］。因此p21可以作為RNAa治療腫瘤的理想靶點。

前期針對p21 基因啟動子設(shè)計的saRNA（dsP21－322）能在前列腺癌、膀胱癌等細(xì)胞系中明顯激活p21表達，并且上調(diào)的p21表現(xiàn)出相應(yīng)的生物學(xué)活性。本研究又證實dsP21－322在骨肉瘤及宮頸癌等實體腫瘤細(xì)胞系及正常的腎上皮細(xì)胞系中激活p21的表達，顯示出RNAa現(xiàn)象在人類細(xì)胞中的普遍性。已有多篇文獻報道，p21基因的表達與骨肉瘤及宮頸癌等腫瘤的治療研究密切相關(guān)。Kim等［12］研究在U2－OS細(xì)胞中，萊菔硫烷（一種化學(xué)抗腫瘤復(fù)合物）通過上調(diào)p21表達促使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，并誘導(dǎo)凋亡。Maritz等［13］報道轉(zhuǎn)錄因子AP－1阻礙p21在宮頸癌細(xì)胞的表達，當(dāng)抑制AP－1表達時，上調(diào)的p21可以抑制細(xì)胞增殖。相比上述研究，RNAa方法更直接，通過靶向p21啟動子區(qū)來激活p21表達，從而達到治療相應(yīng)腫瘤的目的。最近已有利用dsP21－322在體內(nèi)研究的相關(guān)報道，如Wei等［14］利用dsP21－322體內(nèi)實驗激活p21 在肺癌細(xì)胞的表達，抑制了腫瘤的生長，并且上調(diào)的p21還增強了癌細(xì)胞對順鉑治療的敏感性。另外p21 在293T 細(xì)胞系的激活表明RNAa不應(yīng)局限于腫瘤的治療研究，還可以在實驗研究中作為各種傳統(tǒng)的載體過表達系統(tǒng)的替代者。

當(dāng)然RNAa也體現(xiàn)出其基因調(diào)控方式的復(fù)雜性，如轉(zhuǎn)錄因子p53是否參與RNAa過程調(diào)控其下游靶基因p21 表達尚不明確。正常p53 基因，即野生型p53 作為人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，編碼轉(zhuǎn)錄因子p53 蛋白，在細(xì)胞受到生長刺激或發(fā)生轉(zhuǎn)化時，表達迅速增加，并引起其下游p21的表達相應(yīng)上調(diào)［15］。本研究在p53 突變型宮頸癌HeLa 細(xì)胞系中，觀察到dsP21－322可以明顯激活p21的表達，表明這一過程可能不依賴p53的表達。而在p53野生型骨肉瘤細(xì)胞系U2－OS 及腎上皮細(xì)胞系293T，dsP21－322具備上調(diào)p21 表達的能力，但在p53 缺陷型肺腺癌細(xì)胞系NCI－H1299，則未能觀察此現(xiàn)象。因此dsP21－322介導(dǎo)p21表達是否依賴p53的參與需要進一步證實。此外，對p53 野生型的細(xì)胞系，Laptenko等［16］新近研究發(fā)現(xiàn)p53 可以與其在p21啟動子區(qū)的反應(yīng)元件結(jié)合，完成對p21 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本研究在野生型p53的細(xì)胞系觀察到p21被激活同時并未見p53表達增加，是否dsP21－322通過招募更多p53作用于p21的啟動子完成p21的轉(zhuǎn)錄調(diào)控還需進一步研究。目前我們已經(jīng)觀察到類似的現(xiàn)象，在對AGO2蛋白如何參與dsP21－322介導(dǎo)p21表達上調(diào)的研究中發(fā)現(xiàn)，dsP21－322的加入并不改變AGO2蛋白的表達，而是增加了其在p21啟動子區(qū)的聚集［17］。我們在下一步研究中還會利用RNAi沉默p53 的表達來明確其在該過程中對p21的調(diào)控作用。

盡管對saRNA 介導(dǎo)p21激活的機制仍不完全清楚，如沒有明確其分子靶點及哪些蛋白質(zhì)參與該過程。但是saRNA 對多個人類細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)仍體現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景，相信隨著對RNAa機制研究的不斷深入，利用RNAa特異性激活沉寂的抑癌基因或其他失調(diào)基因，將會促進以dsRNA 為基礎(chǔ)的藥物靶向治療腫瘤及其他疾病的潛能。

［1］ Janowski B A，Younger S T，Hardy D B，et al.Activating gene expression in mammalian cells with promoter－targeted duplex RNAs［J］.Nat Chem Biol，2007，3（3）：166－173.

［2］ Li L C，Okino S T，Zhao H，et al.Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103（46）：17337－17342.

［3］ Schwartz J C，Younger S T，Nguyen N B，et al.Antisense transcripts are targets for activating small RNAs［J］.Nat Struct Mol Biol，2008，15（8）：842－848.

［4］ Chen Z，Place R F，Jia Z J，et al.Antitumor effect of dsRNAinduced p21（WAF1／CIP1）gene activation in human bladder cancer cells［J］.Mol Cancer Ther，2008，7（3）：698－703.

［5］ Xu X，Zhou S，Zhang Z，et al.Malignant phenotype of PC3cell line was inhibited by siRNA targeting PAR gene［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog［Med Sci］，2007，27（4）：440－443.

［6］ Cai M，Wang G，Tao K，et al.Induction of apoptosis of human colon cancer cells by siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog［Med Sci］，2009，29（1）：45－49.

［7］ Davidson B L，McCray P B Jr.Current prospects for RNA interference－based therapies［J］.Nat Rev Genet，2011，12（5）：329－340.

［8］ 胡威，陳志強，夏忠禹，等.小分子干擾RNA 抑制大鼠腎細(xì)胞Ppif基因的表達［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2010，39（1）：98－101.

［9］ 陳敏，項紅兵，田玉科.DREAM 基因小分子干擾RNA 重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建與鑒定［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2011，40（1）：75－79.

［10］ Abbas T，Dutta A.p21in cancer：intricate networks and multiple activities［J］.Nat Rev Cancer，2009，9（6）：400－414.

［11］ Weiss R H.p21Waf1／Cip1as a therapeutic target in breast and other cancers［J］.Cancer Cell，2003，4（6）：425－429.

［12］ Kim M R，Zhou L，Park B H，et al.Induction of G2／M arrest and apoptosis by sulforaphane in human osteosarcoma U2－OS cells［J］.Mol Med Report，2011，4（5）：929－934.

［13］ Maritz M F，van der Watt P J，Holderness N，et al.Inhibition of AP－1suppresses cervical cancer cell proliferation and is associated with p21expression［J］.Biol Chem，2011，392（5）：439－448.

［14］ Wei J，Zhao J，Long M，et al.p21WAF1／CIP1gene transcriptional activation exerts cell growth inhibition and enhances chemosensitivity to cisplatin in lung carcinoma cell［J］.BMC Cancer，2010，10：632.

［15］ Kastan M B，Canman C E，Leonard C J.P53，cell cycle control and apoptosis：implications for cancer［J］.Cancer Metastasis Rev，1995，14（1）：3－15.

［16］ Laptenko O，Beckerman R，F(xiàn)reulich E，et al.p53binding to nucleosomes within the p21promoter in vivoleads to nucleosome loss and transcriptional activation［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（26）：10385－10390.

［17］ Hu J，Chen Z，Xia D，et al.Promoter－associated small doublestranded RNA interacts with heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2／B1to induce transcriptional activation［J］.Biochem J，2012，447（3）：407－416.