阿魏酸對慢性心力衰竭小鼠心室膠原重構(gòu)的影響

蔡珊珊， 鄧淑珍， 王瑞耕， 劉 玲， 孫東明

武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心心血管內(nèi)科，武漢 430016

慢性心力衰竭（簡稱心衰，chronic heart failure，CHF）是大多數(shù)器質(zhì)性心臟病發(fā)展的晚期階段，表現(xiàn)為心肌收縮和／或舒張功能的障礙。心衰的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，發(fā)生過程中重要標(biāo)志之一就是心臟纖維化，胞外基質(zhì)重構(gòu)［1－4］。阿魏酸是從當(dāng)歸、川芎、升麻和酸棗仁等中藥材中提取的一種芳香酸，它在植物中廣泛分布，主要具有抗血小板聚集，抑制血小板5－羥色胺釋放，抑制血小板血栓素a2（txa2）的生成，增強(qiáng)前列腺素活性，鎮(zhèn)痛，緩解血管痙攣等作用［2］。研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸對肝臟和腎臟的纖維化有保護(hù)作用［5－6］，但有關(guān)其對慢性心衰中心臟纖維化發(fā)生發(fā)展過程影響的報(bào)道并不多見，本實(shí)驗(yàn)通過建立壓力超負(fù)荷心力衰竭模型，觀察阿魏酸對慢性心衰小鼠細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

8～10周齡C57BL／6（C57）品系的健康小鼠40只，體重25g左右，雄性，由武漢生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供［生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2008－0003，使用許可證號：SYXK（鄂）2008－0012］。每5只小鼠放入1個獨(dú)立送回風(fēng)系統(tǒng)（IVC）籠具內(nèi)，保持室溫在22～24℃之間，濕度在50%～60%之間，明暗交替為12h，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 動物分組及模型制備

將40只小鼠分為假手術(shù)組（sham）、假手術(shù)阿魏酸組（SFA）、心衰組（TAC）、心衰阿魏酸組（TFA），每組10只。參照文獻(xiàn)［7－8］，采用主動脈縮窄的方法制作壓力超負(fù)荷心衰模型。3%戊巴比妥鈉（70mg／kg，Sigma）腹腔注射麻醉小鼠，備皮，用小動物氣管插管針直視下插管后取下小鼠，固定在手術(shù)臺上，連接呼吸機(jī)（VFA－23－BV，Kent Scientific），潮氣量約每次0.4～0.5mL，呼吸頻率90～100次／min，吸氣∶呼氣＝1∶3，定容模式，以觀察胸廓抬舉良好作為輔助呼吸成功的標(biāo)志。沿第2～3肋間切開皮膚，依次分離肌肉及軟組織，打開胸腔后，游離胸主動脈，將7－0手術(shù)縫線穿過胸主動脈，將去尖的27G 針頭連同主動脈一起結(jié)扎，然后立即拔出針頭，造成胸主動脈狹窄，逐層縫合切口。假手術(shù)組在游離出主動脈后僅穿手術(shù)縫線，不結(jié)扎，其余步驟同手術(shù)組。待小鼠夾趾反應(yīng)強(qiáng)烈即將蘇醒時(shí)，拔出氣管插管，將實(shí)驗(yàn)小鼠放入更換新鮮墊料、飼料和飲用水的飼養(yǎng)籠里，于飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，術(shù)后觀察小鼠情況。

假手術(shù)組與心衰組給予正常飲食，假手術(shù)阿魏酸組與心衰阿魏酸組給予阿魏酸飼料喂養(yǎng)，連續(xù)8周。阿魏酸飼料配制：將阿魏酸添加到維持飼料中，在小鼠維持飼料中占0.05%，小鼠攝入量約100 mg／（kg·d）。8 周后，心衰組實(shí)驗(yàn)動物死亡1 只，其余組無動物死亡。

1.3 超聲心動圖檢測心功能

術(shù)后8周，采用超聲診斷系統(tǒng)，小動物專用探頭，中心頻率10MHz，深度4cm，視窗75%，幀頻50Hz，在短軸切面測量左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end－diastolic dimension，LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end－systolic dimension，LVESD）、室間隔厚度（interventricular septal dimension，IVSD）、后壁厚度（left ventriculus posterior wall dimension，LVPWD）、射血分?jǐn)?shù)（left ventriculus ejection fraction，LVEF）及左室短軸縮短率（left ventriculus fractional shortening，LVFS）。

1.4 心肌天狼猩紅染色檢測膠原面積

頸椎脫臼法處死小鼠，取出心臟放入10% KCl溶液中使其停跳在舒張期（n＝5），將心臟和肺臟用濾紙吸干后分別稱重，計(jì)算心臟重量與體重的比值（heart weight／body weight，HW／BW）、肺臟重量與體重的比值（lung weight／body weight，LW／BW）。4%多聚甲醛固定18～24h，石蠟包埋，垂直于心肌外膜作5μm 切片，行心肌天狼猩紅（PSR，北京海德創(chuàng)業(yè)公司）染色，每張切片在400倍下隨機(jī)選取無血管的5 個視野，HPIAS 2000圖像分析軟件系統(tǒng)定量測定膠原面積百分比（CVF），取其平均值。

1.5 RT－PCR檢測基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）mRNA 表達(dá)變化

頸椎脫臼法處死小鼠，取出心臟，去除左右心耳和右心室，將左室與室間隔迅速放入－80℃冰箱備用（n＝4或5），心肺處理同上。取約100mg左室心肌組織加1 mL Trizol（Invirogen公司）研磨后，三氯甲烷抽提RNA，加入異丙醇使RNA 沉淀后用75%乙醇漂洗，溶解提取RNA 后用分光光度計(jì)測量RNA 質(zhì)量及濃度，用電泳方法檢測RNA 是否降解。將抽提合格的RNA 反轉(zhuǎn)錄后加入SYBR Green、上下游引物（表1）等混勻點(diǎn)樣在96孔板中，放入RT－PCR 儀（Light Cycler480，Roche）中檢測mRNA 變化。

表1 目的基因與內(nèi)參照基因的引物序列Table 1 Primer sequence of target gene and reference gene

1.6 免疫組化染色檢測MMP9蛋白表達(dá)變化

心肌固定、包埋、切片步驟同上，免疫組化染色步驟參照SP檢測試劑盒說明。每張切片在400倍下隨機(jī)選取5 個視野，HPIAS 2000圖像分析軟件系統(tǒng)定量測定MMP9蛋白的表達(dá)，用灰度值的大小來表示蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱，取其平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 心臟結(jié)構(gòu)和功能

超聲檢查結(jié)果顯示，正常飲食C57小鼠主動脈縮窄術(shù)后8周時(shí)，與C57 假手術(shù)組小鼠相比，表現(xiàn)出顯著的心肌肥厚和心功能減弱。與假手術(shù)組相比，心衰和心衰阿魏酸組左室收縮末期、舒張末期內(nèi)徑顯著擴(kuò)大，左室射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率明顯降低（均P＜0.05），心衰模型制作成功。心衰阿魏酸組較心衰組射血分?jǐn)?shù)提高，左室收縮末期、舒張末期內(nèi)徑顯著縮?。ň鵓＜0.05）（表2）。

如表2所示，假手術(shù)組中正常飲食C57小鼠和阿魏酸飲食小鼠HW／BW、LW／BW 之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明阿魏酸飲食并不影響小鼠的基礎(chǔ)狀態(tài)。C57 小鼠主動脈縮窄術(shù)后8 周時(shí)心衰組HW／BW、LW／BW 明顯高于假手術(shù)組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），再次表明心衰小鼠模型制作成功。在主動脈縮窄術(shù)后8周，心衰阿魏酸組LW／BW與假手術(shù)阿魏酸組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），心衰阿魏酸組小鼠HW／BW、LW／BW 明顯較心衰組小鼠降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），說明阿魏酸飲食緩解了心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過程。

2.2 心肌膠原面積

在PSR染色時(shí)，膠原纖維呈紅色，肌纖維呈黃色（圖1）。心衰組、心衰阿魏酸組膠原面積百分比（CVF）均比假手術(shù)組明顯增大（均P＜0.05）；心衰阿魏酸組較心衰組CVF明顯減?。≒＜0.05）（表2）。

2.3 MMP9表達(dá)變化

RT－PCR檢測結(jié)果顯示，MMP9在心衰組表達(dá)明顯增加，但是在心衰阿魏酸組表達(dá)的增加程度明顯降低（P＜0.05）（表2）。

免疫組化檢測結(jié)果顯示，MMP9的陽性反應(yīng)為細(xì)胞核藍(lán)染，胞核周圍及胞質(zhì)內(nèi)棕褐色染色為陽性染色區(qū)域（圖2）?；叶戎蹬c蛋白表達(dá)量呈反比關(guān)系，灰度值越大，蛋白表達(dá)量越低。心衰組、心衰阿魏酸組MMP9表達(dá)均比假手術(shù)組明顯增加（均P＜0.05）；心衰阿魏酸組較心衰組MMP9表達(dá)明顯減少（P＜0.05）（表2）。

表2 術(shù)后8周4組小鼠各指標(biāo)結(jié)果比較（±s）Table 2 The comparision of parameters in 4groups at 8th week after operation（±s）

表2 術(shù)后8周4組小鼠各指標(biāo)結(jié)果比較（±s）Table 2 The comparision of parameters in 4groups at 8th week after operation（±s）

＊P＜0.05 vs.Sham group；＃P＜0.05 vs.TAC group

Parameters Sham group SFA group TAC group TFA gruo p BW（g）28.34±0.59 28.06±0.63 28.21±0.89 28.31±0.73 HW／BW（mg／g）4.23±0.05 4.18±0.08 8.93±0.12＊6.13±0.03＊＃LW／BW（mg／g）5.09±0.14 5.12±0.16 11.13±0.23＊6.48±1.35＃HR（beats／min）498.26±15.58 521.03±13.56 502.16±16.24 499.37±19.35 LVEDD（mm）3.49±0.03 3.52±0.06 5.12±0.06＊4.48±0.07＊＃LVESD（mm）1.92±0.05 1.99±0.06 3.89±0.08＊3.31±0.07＊＃LVEF（%）79.48±0.98 81.02±0.85 45.01±3.27＊60.58±4.25＊＃LVFS（%）47.35±0.58 47.38±0.64 22.03±0.15＊28.37±0.69＊＃CVF 2.24±0.64 2.30±0.25 14.67±2.13＊8.34±1.23＊＃MMP9mRNA 0.002 3±0.000 1 0.002 1±0.000 2 0.009 8±0.000 1＊ 0.005 4±0.000 3＊＃MMP9protein 1.07±0.21 1.05±0.19 0.46±0.12＊ 0.79±0.14＊＃

圖1 各組小鼠心肌膠原的天狼猩紅染色圖（×400）Fig.1 PSR staining of the ventricular collagen in mice of 4groups（×400）

圖2 各組小鼠心肌MMP9的免疫組化染色圖（×400）Fig.2 Immunohistochemisty staining of MMP9in myocardia of 4 groups（×400）

3 討論

心室重構(gòu)是心衰發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)，心室重構(gòu)包括室壁細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)的改變，后者是心室重構(gòu)的主要原因。細(xì)胞外基質(zhì)是存在于細(xì)胞之間的動態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，由膠原、蛋白聚糖、彈力纖維等物質(zhì)組成，膠原是其中最豐富的結(jié)構(gòu)成分，對維持心肌細(xì)胞的排列、協(xié)調(diào)心肌收縮和舒張及維持心室?guī)缀涡螤钇鹬匾饔?。心肌?xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)包括成纖維細(xì)胞增生、纖維化、血管結(jié)構(gòu)改變，以及細(xì)胞外基質(zhì)膠原網(wǎng)的量和組成的變化［2－3，9］。本研究結(jié)果顯示，主動脈縮窄術(shù)后8周，心臟膠原增加，心肌膠原面積增大，同時(shí)心功能下降明顯，心臟重構(gòu)顯著。心衰阿魏酸組小鼠心臟較心衰組重構(gòu)顯著減輕，膠原減少，MMP9在mRNA 水平和蛋白水平的表達(dá)均減少。

MMP9是一種鋅離子依賴性的中性蛋白酶家族成員，又稱為明膠酶B，分子量約為92kD，其主要功能是降解重構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)，維持基質(zhì)的動態(tài)平衡，其作用廣泛，在眾多細(xì)胞中均有表達(dá)，MMP9可通過調(diào)節(jié)基質(zhì)的沉積和降解而導(dǎo)致心肌重構(gòu)［10－11］。

阿魏酸（ferulic acid）的化學(xué)名稱為4羥基3甲氧基肉桂酸，是桂皮酸（又稱肉桂酸，3苯基2丙烯酸）的衍生物之一。阿魏酸具有抗血小板聚集，抑制血小板5－羥色胺釋放，抑制血小板血栓素a2（txa2）的生成，增強(qiáng)前列腺素活性，鎮(zhèn)痛，緩解血管痙攣等作用［12］。近期的研究表明阿魏酸除了傳統(tǒng)的這些功效外，還能調(diào)節(jié)組織的纖維化：Guo等［5］發(fā)現(xiàn)在用乙醛刺激精密肝切片中的星狀細(xì)胞時(shí)，阿魏酸能通過增加MMP1的表達(dá)抑制膠原生長；Meng的研究小組［6］在孤立腎輸尿管梗阻的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)阿魏酸能抑制IL－1β誘導(dǎo)的JNK 磷酸化而減輕腎小管間質(zhì)性纖維化。

目前，阿魏酸改善心室膠原重構(gòu)的具體機(jī)制尚未完全明確，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予阿魏酸8周后，心衰阿魏酸組小鼠較心衰組心室肌MMP9的表達(dá)水平減弱，膠原面積百分比減小，左室內(nèi)徑減小，左室射血分?jǐn)?shù)提高，說明阿魏酸能夠在一定程度上改善心室膠原重構(gòu)，提高心臟功能，其機(jī)制可能是通過抑制心室肌MMP9的表達(dá)而干預(yù)心室膠原重構(gòu)。

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