右美托咪啶對神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓p38絲裂原活化蛋白激酶和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響

李 娟 ， 冷玉芳， 韓雪娜， 王一涵

蘭州大學第一醫(yī)院麻醉科，蘭州 730000

神經(jīng)損傷可激活脊髓背角小膠質(zhì)細胞，通過p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）途徑，合成和釋放腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF），BDNF 可增加神經(jīng)病理性疼痛的痛覺過敏，促進疼痛的發(fā)展［1－2］。右美托咪啶是高選擇性的α2腎上腺素受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抑制交感活性等作用，右美托咪啶作用機制十分復雜，存在多條鎮(zhèn)痛作用途徑，脊髓是其主要鎮(zhèn)痛部位［3］。本實驗旨在觀察右美托咪啶對神經(jīng)病理性疼痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用是否通過抑制p38MAPK 信號通路下調(diào)BDNF的表達而產(chǎn)生。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

右美托咪啶（批號：10122234，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）；水合氯醛（國藥集團試劑有限公司）；PL－200熱刺痛儀（成都泰盟科技有限公司）；Trizol試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；DK－S26型電熱恒溫水浴鍋（上海三發(fā)科學儀器有限公司）；TGL－16M 型低溫高速離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）；DTC－3Gplus型PCR 儀（西安天隆科技有限公司）；DYY－8C 型電泳儀（北京六一儀器廠）；LG2000型凝膠成像分析系統(tǒng)（杭州朗基科學儀器有限公司）。

1.2 動物選擇及分組

雄性成年SD 大鼠72 只，體重180～220g，由蘭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院實驗動物中心提供，隨機分為假手術(shù)組（S組）、CCI組（C 組）和右美托咪啶組（D組），每組24只。S組大鼠僅分離坐骨神經(jīng)不結(jié)扎，C組和D 組結(jié)扎坐骨神經(jīng)建立CCI模型。D 組于術(shù)后即刻開始至取材時點每天腹腔注射右美托咪啶50μg／kg，S組和C 組注射相同體積的生理鹽水。動物飼養(yǎng)環(huán)境安靜，通風良好，室溫維持20～25℃，12h／12h光／暗循環(huán)，自由攝食和飲水。

1.3 CCI模型的建立

參照Bennett等［4］的方法制備大鼠CCI模型，10%水合氯醛350 mg／kg腹腔注射麻醉大鼠并固定，剪毛消毒后切開大鼠右下肢股骨中段皮膚，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，用4－0絲線松扎4道，間隔約l mm，結(jié)扎強度以引起小腿肌肉輕度顫動為宜，傷口局部敷適量青霉素粉，逐層縫合切口，術(shù)畢常規(guī)籠養(yǎng)。

1.4 行為學觀察

術(shù)后2周內(nèi)，每日觀察1次大鼠的體位步態(tài)和術(shù)側(cè)后肢的姿勢、肌張力、持重情況，及是否出現(xiàn)舔咬肢體的現(xiàn)象。

1.5 測定大鼠機械痛閾和熱痛閾

每組大鼠分別于術(shù)前l(fā) d，術(shù)后第1、3、7、14d測定大鼠機械痛閾和熱痛閾。

1.5.1 機械痛閾檢測 參照文獻［5］的方法測定。von Frey 纖維絲的壓力值為0.41、0.52、0.87、1.16、2.05、3.61、5.50、8.28、10.33和16.73g，每次至少間隔30s。初始刺激強度2.05g，每只大鼠測定3次，間隔5min，取其平均值。

1.5.2 熱痛閾檢測 參照文獻［6］的方法采用PL－200熱刺痛儀檢測。將大鼠置于3mm 厚的玻璃板上，熱輻射光源照右后肢足底中部，記錄從照射到出現(xiàn)縮足反應的時間，以此反映熱痛閾。連續(xù)測定3次，間隔5min，單次照射時間不超過20s，取其平均值。

1.6 p38MAPK 和BDNF mRNA檢測

于術(shù)后第1、3、7、14d測定痛閾后每組隨機取6只大鼠斷頭處死，取脊髓L4－6節(jié)段，取出的樣品立即放入液氮里保存，隨后采用RT－PCR 法檢測p38MAPK 和BDNF mRNA 的表達水平。引物合成：p38MAPK、BDNF和GAPDH 基因引物序列均由Primer premier 5.0軟件自行設(shè)計，由華大基因公司合成。p38MAPK：上游序列5′－TCCAAGGGCTACACCAAATC－3′，下游序列5′－TGTTCCAGGTAAGGGTGAGC－3′，擴增產(chǎn)物長度341bp；BDNF：上游序列5′－GGTCACAGCGGCAGATAAAAAG－3′，下游序列5′－TTCGGCATTGCGAGTTCCAG－3′，擴增產(chǎn)物長度188bp；GAPDH：上游序列5′－ACCACCATGGAGAAGGCTGG－3′，下游序列5′－GGTTTCTTACTCCTTGGAGG－3′，擴增產(chǎn)物長度698bp。將凍存的脊髓標本取出，加入RNA保護液碾磨后抽提總RNA，取10μL 總RNA 作為模板，配成20μL逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA，再取cDNA 1μL、dNTP 1μL、Taq DNA 聚合酶1μL、引物1μL、10×Buffer 5μL 和無菌去離子水配成50μL PCR 反應體系，分別PCR 擴增各組大鼠脊髓p38MAPK、BDNF和GAPDH DNA。PCR 反應條件為：94℃預變性5 min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循環(huán)36次。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產(chǎn)物，用凝膠成像分析系統(tǒng)，對RT－PCR 產(chǎn)物電泳條帶進行吸光度（A）值分析，分別以p38MAPK／GADPH、BDNF／GADPH 的比值半定量反映p38MAPK 和BDNF mRNA 在脊髓的表達水平。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 動物模型行為表現(xiàn)

實驗期間，所有大鼠均無明顯傷口感染現(xiàn)象。S組大鼠活動如常，C 組和D 組大鼠術(shù)后均出現(xiàn)跛行、舔爪，結(jié)扎側(cè)足輕度外翻，且有時出現(xiàn)懸空等后肢保護現(xiàn)象。與C 組比較，D 組術(shù)后第3天起上述癥狀逐漸減輕，第14 天時D 組大鼠后肢活動基本恢復正常。D 組大鼠在腹腔注射右美托咪啶后存在輕微的嗜睡現(xiàn)象，同時自主活動減少，但仍可被輕易喚醒，喚醒后可站立。

2.2 機械痛閾和熱痛閾

各組大鼠術(shù)前和S組大鼠痛閾差異無統(tǒng)計學意義。與術(shù)前及S組比較，C 組大鼠機械痛閾和熱痛閾于術(shù)后1、3、7、14d明顯下降，D 組大鼠于術(shù)后3、7、14d明顯下降（P＜0.05）；與C組比較，D 組大鼠機械痛閾和熱痛閾于術(shù)后3、7、14d明顯升高（P＜0.05）；與術(shù)后1d比較，C 組、D 組大鼠機械痛閾和熱痛閾于術(shù)后3、7、14d顯著降低，于術(shù)后第7天降至最低（P＜0.05）。見表1。

表1 3組大鼠不同時間點機械痛閾和熱痛閾的比較（n＝6，±s）Table 1 Comparison of mechanical and thermal pain threshold of rats at different time points in each group（n＝6，±s）

aP＜0.05 vs.group S；b P＜0.05 vs.group C.Comparison in the same group before and after operation：c P＜0.05 vs.preoperation；d P＜0.05 vs.1dafter operation；e P＜0.05 vs.3dafter operation；f P＜0.05 vs.7dafter operation

Category Groups PreoperationPostop eration 1d3d7d14d Mechanical pain Group S 14.17±1.34 13.92±1.32 13.77±1.30 13.60±1.50 14.13±1.42 threshold（g）Group C 14.12±1.14 11.83±1.68ac 8.73±1.74acd 4.65±1.81acde 6.90±1.58acdef Group D 13.95±1.03 12.30±1.47c 10.65±1.47abcd 6.73±1.61abcde 8.92±1.50abcdef Thermal pain Group S 17.19±0.76 17.00±1.03 16.92±0.94 16.85±1.22 17.10±1.02 threshold（s）Group C 17.11±0.85 15.52±1.15ac 10.82±0.98acd 6.10±1.41acde 8.95±1.11acdef Group D 17.23±1.01 16.32±1.12c 12.66±1.04abcd 8.22±1.07abcde 10.58±1.09 abcdef

2.3 p38MAPK 和BDNF mRNA表達

RT－PCR 產(chǎn)物電泳條帶顯示了p38MAPK 和BDNF mRNA 在脊髓的表達（圖1、2）。與S組比較，C組大鼠p38MAPK 和BDNF mRNA 于術(shù)后1、3、7、14d顯著升高，D 組大鼠于術(shù)后3、7、14d明顯升高（P＜0.05）；與C組比較，D組大鼠p38MAPK 和BDNF mRNA于術(shù)后3、7、14d顯著降低（P＜0.05）；與術(shù)后1d比較，C 組、D 組大鼠p38MAPK 和BDNF mRNA 于術(shù)后3、7、14d顯著升高，于術(shù)后第7天升到最高（P＜0.05）。見表2。對p38MAPK 和BDNF mRNA 的表達進行相關(guān)性分析，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.901，P＜0.05，表明p38MAPK mRNA 和BDNF mRNA 表達呈正相關(guān)，即BDNF mRNA 表達隨p38MAPK mRNA表達的增加而增加。

圖1 RT－PCR法檢測脊髓p38MAPK mRNA 的表達Fig.1 The p38MAPK mRNA expression in the spinal cord detected by RT－PCR

圖2 RT－PCR法檢測脊髓BDNF mRNA 的表達Fig.2 The BDNF mRNA expression in the spinal cord detected by RT－PCR

表2 3組大鼠不同時間點脊髓p38MAPK 和BDNF mRNA 表達的比較（n＝6，±s）Table 2 Comparison of p38MAPK and BDNF mRNA of rats at different time points in each group（n＝6，±s）

表2 3組大鼠不同時間點脊髓p38MAPK 和BDNF mRNA 表達的比較（n＝6，±s）Table 2 Comparison of p38MAPK and BDNF mRNA of rats at different time points in each group（n＝6，±s）

aP＜0.05 vs.group S；b P＜0.05 vs.group C.Comparison in the same groups：c P＜0.05 vs.1dafter operation；d P＜0.05 vs.3dafter operation；e P＜0.05 vs.7dafter operation

Postop eration Category Groups 1d3d7d14d P38MAPK Group S 0.25±0.02 0.26±0.03 0.27±0.04 0.26±0.03 Group C 0.30±0.03a0.43±0.04ac 0.81±0.06acd 0.62±0.05acde Group D 0.28±0.03 0.38±0.04abc 0.65±0.05abcd 0.53±0.04abcde BDNF Group S 0.40±0.03 0.41±0.04 0.42±0.04 0.41±0.03 Group C 0.48±0.03a0.66±0.06ac 0.91±0.08acd 0.78±0.05acde Group D 0.45±0.04a0.57±0.03abc 0.80±0.06abcd 0.69±0.04 abcde

3 討論

實驗中C組和D 組大鼠CCI術(shù)后均出現(xiàn)跛行、舔爪、足輕度外翻等痛行為學表現(xiàn)，機械痛閾和熱痛閾從術(shù)后1d至術(shù)后14d均明顯降低，說明大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型制備成功。參照文獻［7］及預實驗，本實驗選擇右美托咪啶注射劑量為50μg／kg，D組大鼠在腹腔注射右美托咪啶50μg／kg后1h內(nèi)有輕微嗜睡現(xiàn)象，但可輕易喚醒，喚醒后仍可站立。

本實驗結(jié)果顯示，與S 組比較，C 組大鼠p38MAPK 和BDNF mRNA 的表達明顯升高，并且p38MAPK 和BDNF mRNA 表達的變化與機械痛閾和熱痛閾的變化在時間上相一致，表明p38MAPK 和BDNF mRNA 參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展。近年來的研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用，激活的小膠質(zhì)細胞可釋放多種疼痛遞質(zhì)造成脊髓背角神經(jīng)元敏感化，從而使疼痛產(chǎn)生和擴大［8］。BDNF是小膠質(zhì)細胞－神經(jīng)元信號傳遞中的重要因子。外周神經(jīng)損傷可引起脊髓神經(jīng)元釋放大量ATP，產(chǎn)生的ATP 激活脊髓背角小膠質(zhì)細胞P2X4R，引起Ca2＋內(nèi)流，細胞內(nèi)Ca2＋升高后，Ca2＋可迅速與胞內(nèi)的鈣調(diào)蛋白結(jié)合引起鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶磷酸化，促使細胞內(nèi)的BDNF 釋放，并且細胞內(nèi)Ca2＋升高可激活p38MAPK 信號通路，活化的p38MAPK不僅能促使細胞內(nèi)的BDNF 釋放，并且可通過激活下游特定的轉(zhuǎn)錄因子，如轉(zhuǎn)錄活化因子（1ATF－1）、cAMP反應序列結(jié)合蛋白（CREB），從而使BDNF在小膠質(zhì)細胞中的合成增加［1，9］。CCI模型大鼠保留了完整的傳遞痛覺信息的無髓鞘C 纖維，神經(jīng)損傷使背根神經(jīng)節(jié)（DRG）中神經(jīng)生長因子（NGF）表達增加，NGF 通過激活C 纖維上的p38MAPK，使DRG 中的BDNF表達升高，BDNF再逆行運輸?shù)郊顾璞辰嵌l(fā)揮作用［10］。p38MAPK 是BDNF 合成和釋放過程中的關(guān)鍵因子，本研究相關(guān)性分析結(jié)果也表明p38MAPK 和BDNF mRNA 的表達呈正相關(guān)，說明BDNF mRNA 表達會隨著p38MAPK mRNA 表達的增加而增加。BDNF 表達增加后其高親和力受體酪氨酸蛋白激酶受體B（TrkB）的表達也隨BDNF的增加而上調(diào)，脊髓背角的BDNF與突觸后神經(jīng)元上的TrkB 受體結(jié)合，通過激活PKC 途徑，從而引起痛覺過敏［11］。BDNF 與TrkB 結(jié)合還能激活信號級聯(lián)反應，如MAPK 通路，增加谷氨酸能突觸傳遞，促進NMDA 受體亞單位磷酸化，誘發(fā)和維持長時程增強，從而誘導中樞敏化的形成［12］，中樞敏化是疼痛長期持續(xù)的主要原因。

本研究結(jié)果顯示，D 組大鼠在腹腔注射右美托咪啶后機械痛閾和熱痛閾與C 組比較均明顯升高，p38MAPK 和BDNF mRNA 的表達明顯降低，表明右美托咪啶對神經(jīng)病理性疼痛有鎮(zhèn)痛作用且其機制與下調(diào)p38MAPK 和BDNF mRNA 的表達有關(guān)。本實驗采用從CCI術(shù)后即刻至取材時點連續(xù)每天腹腔給藥的方式，從術(shù)后3d開始，C組與D 組之間同一指標的差異逐漸增大（P＜0.05），在術(shù)后7d時差異達到最大，7d后神經(jīng)損傷開始恢復，至14d時差異比7d減小，但與術(shù)后3d比較此時右美托咪啶仍發(fā)揮著較強的鎮(zhèn)痛作用。在術(shù)后1d時C 組、D組差異無統(tǒng)計學意義，說明與單次給藥相比連續(xù)應用右美托咪啶能產(chǎn)生更強的鎮(zhèn)痛作用，并且其鎮(zhèn)痛作用在7～14d時達到高峰。

長期的疼痛刺激，可使脊髓背角α2腎上腺素受體（α2－AR）數(shù)目增加［13］。右美托咪啶作為一種高選擇性的α2腎上腺素受體激動劑，主要作用于脊髓背角的α2－AR 產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。通過作用于小膠質(zhì)細胞膜上的α2－AR，可激活鉀離子通道，抑制鈣離子通道［14］。鈣離子通道受抑制后，Ca2＋內(nèi)流減少使神經(jīng)末梢的興奮－釋放偶聯(lián)機制受到抑制，減少了神經(jīng)遞質(zhì)和BDNF的釋放，同時p38MAPK 的活化也因胞內(nèi)Ca2＋減少而受到抑制，從而BDNF的合成也相應減少。另一方面鉀離子通道激活后，K＋外流增加，細胞處于超極化狀態(tài)，減弱了BDNF與TrkB受體結(jié)合引起的細胞去極化作用，從而減輕疼痛的發(fā)展。最近的研究［15］表明右美托咪啶還能抑制膠質(zhì)細胞的活性和ERK 信號通路，ERK 和p38MAPK同屬MAPK 家族，右美托咪啶是否通過ERK 信號通路對p38MAPK 和BDNF 的表達產(chǎn)生影響仍需進一步研究。

綜上所述，右美托咪啶能通過抑制p38MAPK信號通路，下調(diào)BDNF的表達，從而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。

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